辛然，馬麗鑫，劉蓉，王煦松，董秀萍，秦磊

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧大連 116034）

貽貝（Mytilus edulis）又名海虹，是一種雙殼類軟體動物，在我國有近60 多年的的養(yǎng)殖歷史。據(jù)統(tǒng)計，2020年我國貽貝年產(chǎn)量已達8.87×105t，居世界首位[1]。貽貝有很高的營養(yǎng)價值，富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和氨基酸[2,3]。隨著人們生活水平的提升和對食品營養(yǎng)健康關(guān)注度的提高，貽貝越來越受到人們的關(guān)注和喜愛。在我國，貽貝的銷售范圍狹窄，主要以活鮮品銷售為主，深加工利用率較低[4,5]。少部分被加工成干制品或冷凍食品進行出售，有些甚至直接被用作飼料或遺棄從而造成了資源的浪費，因此提升我國貽貝的深加工利用率是非常重要的。目前，相關(guān)藥物及食品研發(fā)成為熱潮，如貽貝抗高血脂及治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物的開發(fā)等[6]。但目前貽貝的產(chǎn)業(yè)化研究仍停留在實驗研究階段，這一問題制約了貽貝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展也拉低了貽貝的實際市場價值。因此為了提高貽貝的經(jīng)濟價值，充分利用海洋資源，應(yīng)投入更多的科研力量對其進行研究，促進其深加工、產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。

隨著現(xiàn)代社會的發(fā)展，海鮮風(fēng)味香精迎合市場需求，逐漸成為熱點。反應(yīng)型海鮮香精是經(jīng)美拉德反應(yīng)制備的一種香氣濃郁、逼真度高[7]的復(fù)合調(diào)味料。美拉德反應(yīng)是一種非酶催化反應(yīng)[8-10]，可使食品具有獨特的色澤和風(fēng)味[11-13]。目前，美拉德反應(yīng)已廣泛應(yīng)用于海鮮香精的制備當(dāng)中，如宋亞琴[14]等以蒸煮的貽貝肉為原料，通過美拉德反應(yīng)研究開發(fā)了貽貝調(diào)味料。陳啟航[15]等以鰹魚蒸煮液為原料，通過美拉德反應(yīng)開發(fā)新型的鰹魚調(diào)味料。

制備香精粉體的干燥方法有噴霧干燥、真空冷凍干燥、超聲波噴霧-冷凍干燥法等。噴霧干燥是將液體樣品分散為小霧滴，再經(jīng)熱干燥介質(zhì)蒸發(fā)水分制成粉末狀產(chǎn)品[16,17]。真空冷凍干燥是在真空條件下，利用升華原理將物料中的水分直接脫除的干燥技術(shù)[18]。超聲波噴霧-冷凍干燥是在溫度較低的條件下，通過霧化將液體樣品轉(zhuǎn)變?yōu)榭烧{(diào)控大小且分布均勻的霧滴，并將其瞬間冷凍[19-21]。不同的干燥方式對香精風(fēng)味品質(zhì)具有不同程度的影響，因此選擇合適的干燥方法對香精品質(zhì)具有重要的意義。

本文以貽貝酶解液為原料，通過感官評定探究還原糖種類及添加量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間對美拉德反應(yīng)的影響，選擇美拉德反應(yīng)的最佳條件。對比不同干燥方式（超聲波噴霧-冷凍干燥、真空冷凍干燥和噴霧干燥）制得香精粉體的理化特性，使用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法（SPME-GC-MS）測定不同干燥方式制得的香精中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)差異。以期為貽貝熱反應(yīng)香精的生產(chǎn)加工提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮貽貝購買于遼寧大連新長興市場。

木瓜蛋白酶（≥10 units/mg）、環(huán)己酮（＞99.5%，GC）、核糖（98%）、葡萄糖（≥99.5%）、果糖（99%）、木糖（98%）北京寶希迪科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Scan Speed 40 真空濃縮干燥儀，丹麥LaboGene公司；CF16RXⅡ高速冷凍離心機，日本日立公司；Vortex 3 旋渦混合器，IKA（廣州）儀器設(shè)備有限公司；SU8010/PP3010T 冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本日立公司；Agilent7890B GC/7010B GC-MS，安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 海鮮香精制備工藝流程

貽貝肉→勻漿（6 000 r/min，2 min）→凍干→酶解（木瓜蛋白酶）→美拉德反應(yīng)→干燥→貽貝海鮮風(fēng)味香精

1.3.2 貽貝酶解物的制備

稱取20 g 貽貝肉凍干粉，加入m=0.3%的木瓜蛋白酶，在pH 值為6.5、溫度為50 ℃的條件下，酶解3 h。

1.3.3 美拉德反應(yīng)條件優(yōu)化

1.3.3.1 單因素試驗

本實驗以感官評定得分為評價指標(biāo)，以底物濃度為10wt%的貽貝酶解液凍干粉為原料，考察還原糖種類（核糖、葡萄糖、果糖、木糖）、還原糖添加量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、5%、10%、15%、20%）、反應(yīng)時間（60、90、120、150 min）以及反應(yīng)溫度（100、110、120、130、140 ℃）對美拉德反應(yīng)的影響，每項實驗重復(fù)三次。

1.3.3.2 正交試驗

選取反應(yīng)時間（A）、反應(yīng)溫度（B）、木糖添加量（C）作為自變量，以感官評分作為考察指標(biāo)，設(shè)計L9(34)正交試驗，因素與水平見表1。

表1 正交因素水平表Table 1 Orthogonal factor and level

1.3.4 感官評定

挑選十名有經(jīng)驗的成員組成感官評定小組，根據(jù)表2中的感官評定標(biāo)準(zhǔn)對樣品進行打分，具體評分細(xì)則見表2。

表2 感官評定描述詞及標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation descriptors and standards

1.3.5 不同干燥方式制備海鮮香精樣品前處理方法

在底物濃度為10%的貽貝酶解液凍干粉中加入5%木糖，在反應(yīng)溫度為100 ℃、反應(yīng)時間為120 min條件下進行美拉德反應(yīng)，制備海鮮香精溶液，制得的香精溶液進行干燥制成香精粉體。干燥方式分為以下3 種：

超聲波噴霧-冷凍干燥：超聲功率3 W；進料流速3 mL/min；噴霧后將樣品轉(zhuǎn)移至-40 ℃的冰箱退火5 h。退火后將樣品凍干；

噴霧干燥：進風(fēng)溫度：160 ℃；出風(fēng)溫度：85 ℃；蠕動速度：15 RPM；風(fēng)速：20 m3/min；

真空冷凍干燥：將樣品于-80 ℃條件下預(yù)凍12 h。在真空度1 kPa、冷阱溫度-50 ℃、隔板加熱溫度20 ℃的條件下真空冷凍干燥48 h。

1.3.6 香精粉體理化性質(zhì)的測定

1.3.6.1 堆積密度的測定

將20 mL 量筒置于110 ℃烘箱中干燥至恒重m1，稱取10 mL 香精粉體于量筒中，稱重m2，堆積密度（ρ，g/mL）計算如下：

1.3.6.2 溶解性的測定

稱取0.5 g 粉體于50 mL（25 ℃）水中，低速攪拌，記錄粉末完全溶解時間，平行3 次取均值。

1.3.6.3 色差的測定

使用測色儀測定三種干燥方式復(fù)水后的香精溶液和香精原液的色度。采集L*、a*、b*、及?E值，每個樣品測量3 次。

式中：

?E——總色差值；

L——明度值，+表示偏白，-表示偏暗；

L0——標(biāo)準(zhǔn)白板的明度值，93.37；

a——紅度值，+表示偏紅，-表示偏綠；

a0——標(biāo)準(zhǔn)白板的紅度值，-0.91；

b——黃度值，+表示偏黃，-表示偏藍(lán)；

b0——標(biāo)準(zhǔn)白板的黃度值，0.19。

1.3.6.4 粉體分散性測定

應(yīng)用冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SU8010/PP3010T）對經(jīng)過噴金處理（噴金條件5 mA，120 s）的香精粉體進行顯微鏡圖像觀察、采集；取不同干燥方式的粉體0.1 g，加入1 mL 正己烷混勻，取出200 μL 放到載玻片上，自然晾干后，用顯微鏡檢測。

1.3.7 不同干燥方式的香精粉體中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

取美拉德反應(yīng)溶液4 mL 放入20 mL 頂空進樣瓶中，分別加入內(nèi)標(biāo)氘代環(huán)己酮（50 mg/L，100 μL），進行手動進樣，樣品先在溫度40 ℃下孵育20 min，手動進樣針萃取時間40 min。GC-MS 條件如下：色譜條件：Agilent7890B GC/7010B GC-MS；毛細(xì)管色譜柱HP-5MS（30 m×250 μm×0.25 μm）；升溫程序；45 ℃保持3 min，以5 ℃/min 升至280 ℃，保持10 min；載氣流速l mL/min；進樣口溫度260 ℃。質(zhì)譜條件：電離模式EI；掃描模式Scan；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍m/z35～400；溶劑延遲3.5 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0 軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進行方差分析；使用Origin 8.0 繪制雷達圖；使用Metaboanalyst 5.0軟件進行主成分分析與繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 美拉德反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 單因素試驗結(jié)果

美拉德反應(yīng)途徑的復(fù)雜性導(dǎo)致數(shù)千個與顏色和香氣相關(guān)的物質(zhì)形成[22,23]。其化學(xué)途徑的種類和所形成物質(zhì)的重要性與反應(yīng)條件有關(guān)，特別是還原糖、時間、溫度、反應(yīng)物起著至關(guān)重要的作用[24]。在美拉德反應(yīng)中，糖是羰基的主要來源，糖的種類與添加量會直接影響美拉德風(fēng)味物質(zhì)的形成。

由圖1a 可知，在所添加的所有還原糖中，添加木糖的香精感官評定得分最高，無焦苦味，海鮮味較為突出。添加核糖的得分與添加木糖的得分相近，但添加核糖的香精顏色較深，鮮味相對較弱，故本試驗美拉德反應(yīng)所需添加的還原糖選擇為木糖。由圖1b 可知，在木糖添加量為10wt%時獲得的感官評分最高，且隨著木糖添加量的增加，香精的顏色逐漸加深，鮮味逐漸下降。由圖1c 可知，感官評分最高的反應(yīng)溫度為110 ℃。反應(yīng)溫度是美拉德反應(yīng)一個很重要的影響條件，當(dāng)溫度較低時，會產(chǎn)生醛類、呋喃類等化合物；當(dāng)溫度較高時，會產(chǎn)生帶有烘烤香氣的吡嗪、吡咯、吡啶等化合物。但溫度過高不僅會導(dǎo)致產(chǎn)物碳化，還會產(chǎn)生一些有毒、有害的物質(zhì)[20]。由圖1d 可見，在反應(yīng)溫度為110 ℃的條件下，反應(yīng)120 min 時，制得香精的感官評分最高。反應(yīng)時間的長短對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的形成至關(guān)重要，反應(yīng)時間過短，美拉德反應(yīng)不完全，形成的風(fēng)味物質(zhì)較少，且風(fēng)味較淡；反應(yīng)時間過長，美拉德反應(yīng)過度，會產(chǎn)生有害物質(zhì)，使香精產(chǎn)生苦味，使樣品整體風(fēng)味變差。

圖1 美拉德反應(yīng)條件優(yōu)化單因素試驗感官評分雷達圖Fig.1 Sensory score radar diagram of Maillard reaction condition optimization single factor test

2.1.2 正交試驗設(shè)計結(jié)果

如表3所示，極差分析結(jié)果表明，各因素對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的影響為：木糖添加量(C)＞反應(yīng)時間(A)＞反應(yīng)溫度(B)；根據(jù)正交試驗結(jié)果及感官評分結(jié)果確定美拉德反應(yīng)的最優(yōu)組合為：A1B1C1，即反應(yīng)時間90 min，反應(yīng)溫度100 ℃，木糖添加量5wt%。在此條件下進行驗證試驗所得感官評分為8.50、8.70、9.00，平均值為8.73，所制得的海鮮香精風(fēng)味較好，且具有濃郁海鮮風(fēng)味。

表3 L9(34)美拉德反應(yīng)條件優(yōu)化正交試驗方案及結(jié)果Table 3 L9(34) Maillard reaction condition optimization orthogonal test scheme and results

2.2 不同干燥方式制備海鮮香精粉體效果對比

2.2.1 不同干燥方式的粉體形態(tài)比較

圖2a 分別為三種干燥方式制得的粉體，可以看出不同干燥方式制得的粉體顏色、分散度、顆粒大小都不同。超聲波冷凍噴霧-冷凍干燥制得的香精粉體顏色淡黃、細(xì)膩；噴霧干燥的香精顏色較深；真空冷凍干燥的香精呈片狀，大小不一。超聲波噴霧-冷凍干燥制得的香精粉體優(yōu)于其他兩種干燥方式制得的香精粉體，可能由于超聲波噴霧-冷凍干燥霧化的過程中可以產(chǎn)生尺寸可控且分布良好的霧滴，液滴在低溫狀態(tài)下被瞬時凍結(jié)；而真空冷凍干燥的粉體是經(jīng)過后續(xù)的研磨得到的；噴霧干燥霧化的液滴因重力、碰撞等原因在噴霧過程中產(chǎn)生變形[25,26]。圖2b 為掃描電鏡圖，其中超聲波噴霧-冷凍干燥的香精為大顆粒狀，噴霧干燥的香精呈現(xiàn)扁球形，真空冷凍干燥的香精呈現(xiàn)規(guī)則不一的片狀。由圖2c 為顯微鏡下測得的香精分散狀態(tài)，可以看出噴霧干燥的香精分散緊密，而超聲波噴霧-冷凍干燥制得的香精粉體分散均勻，真空冷凍干燥制得的香精較稀疏。

圖2 不同干燥方式對香精粉體表觀形態(tài)的影響Fig.2 Effect of different drying methods on the apparent morphology of essence powder

2.2.2 不同干燥方式下海鮮香精的物理特性比較

圖3為3 種干燥方式制得香精的堆積密度與溶解性對比。由圖3a 中可以看出，采用3 種不同的干燥方法制得的香精粉體堆積密度由大到小依次為噴霧干燥＞超聲波噴霧-冷凍干燥＞真空冷凍干燥。其中真空冷凍干燥制得香精的粉體堆積密度最小，其原因可能是樣品經(jīng)真空冷凍干燥凍結(jié)建立了穩(wěn)固的固體基架，且脫水后不容易發(fā)生改變，得到的粉體疏松多孔，因此堆積密度較小。而噴霧干燥制得的香精粉體堆積密度最大，其原因可能是噴霧干燥制得的香精是形狀均勻、平滑無縫隙的球型顆粒狀（圖2），排列緊密，因此堆積密度較大。由圖3b 可以看出3 種干燥方式制備的香精粉完全溶解所需的時間為：噴霧干燥＞真空冷凍干燥＞超聲波噴霧-冷凍干燥。樣品完全溶解所需的時間越短，則該樣品的溶解性最好。因此三種干燥方式制得的香精粉的溶解性為：超聲波噴霧-冷凍干燥＞真空冷凍干燥＞噴霧干燥。超聲波噴霧-冷凍干燥制得的香精粉溶解性最好，其原因可能是超聲波噴霧-冷凍干燥是在低溫環(huán)境下，通過霧化和瞬時凍結(jié)使液體樣品變?yōu)榧?xì)膩、呈大顆粒狀、空隙較大且分布均勻的粉體（圖2），因此溶解性最好。

圖3 不同干燥方式對香精粉體物理特性的影響Fig.3 Effects of different drying methods on physical properties of essence powder

圖4為不同干燥方式粉體色差對比。從圖4a 色度分析來看，3 種干燥方式的粉體色度均小于原樣品，且超聲波噴霧-冷凍干燥＜噴霧干燥＜真空冷凍干燥，說明真空冷凍干燥粉體能更好地保持物料原色。從圖4b 偏紅度上來看，超聲波噴霧-冷凍干燥與真空冷凍干燥的偏紅程度與未干燥的香精較為接近，噴霧干燥的粉體偏紅度最高。從圖4c 偏黃度上來看，超聲波噴霧-冷凍干燥和真空冷凍干燥與原樣品都較為接近，噴霧干燥的樣品偏黃度大于原樣品。從圖4d 整體色差來看，3 種干燥方式的樣品色差相差不大，超聲波噴霧-冷凍干燥更接近于原樣品顏色。綜上，在3 種干燥方式中超聲波噴霧-冷凍干燥粉體更好，更具有產(chǎn)業(yè)應(yīng)用優(yōu)勢。

圖4 不同干燥方式對香精粉體色差的影響Fig.4 Effect of different drying methods on chromatic aberration of essence powder

2.2.3 SPME-GC-MS 測定結(jié)果

由表4可知，四種樣品中共測得揮發(fā)性物質(zhì)28種，包括醛類9 種、醇類5 種、吡嗪1 種、呋喃2 種、酯類3 種、酮類2 種、其他6 種。由此可以看出，醛、醇是香精中主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。香精原液中共檢測出19 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，總量為：101.61 μg/mL；真空冷凍干燥樣品中共檢測出19 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，總量為28.09 μg/mL；噴霧干燥樣品中共檢測出21 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，總量為62.37 μg/mL；超聲波噴霧-冷凍干燥樣品中共檢測出16 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，總量為39.09 μg/mL。醇類物質(zhì)中的不飽和醇類閾值低，具有類金屬、蘑菇香氣[27]。醛類化合物主要是由脂質(zhì)的自動氧化產(chǎn)生的，酮類化合物主要是由不飽和脂肪酸的熱氧化或降解產(chǎn)生的。酯類物質(zhì)是食品香氣的主要組成成分，短鏈脂肪酸形成的酯有水果香味，長鏈脂肪酸形成的酯有輕微油脂味[19]。吡嗪類物質(zhì)的形成是氨基親核進攻羰基并發(fā)生加成和脫水反應(yīng)的結(jié)果，一般具有堅果、燒烤等風(fēng)味特征[28]。

表4 不同干燥方式香精的揮發(fā)性化合物SPME-GC-MS 結(jié)果Table 4 Results of volatile compounds SPME-GC-MS in different drying methods

圖5a～5d 是以最小偏二乘判別和聚類分析表明使用不同干燥方式制備海鮮香精中揮發(fā)性化合物的分析圖。從圖5a 的得分圖來看，組分1 和組分2 的貢獻率分別為49.2%和34.5%，總貢獻率為83.7%，表明2個組分能夠反應(yīng)原始數(shù)據(jù)的信息。其中噴霧干燥制得的香精分布在第一、四象限，真空冷凍干燥制得的香精分布在第二象限，未干燥香精和超聲波噴霧-冷凍干燥制得的香精分布在第三象限，4 組樣品在揮發(fā)性成分上有一定差異。其中超聲波噴霧-冷凍干燥與未干燥香精在同一象限且位置接近，這表明二者中的揮發(fā)性化合物最為相似。圖5b 載荷圖表示不同干燥方式制得的香精中揮發(fā)性化合物的分布信息。由圖5b、5c 可知，超聲波噴霧-冷凍干燥中的揮發(fā)性化合物與原香精重合最多，其中4-乙基苯甲醛、1-十二醇、3,4-二甲基環(huán)己醇、正庚醇、環(huán)己醇、3,5-辛二烯-2-酮與超聲波噴霧-冷凍干燥香精有顯著相關(guān)性；2-戊基呋喃、反-2-(2-戊烯)呋喃、芐腈與未干燥原香精有顯著相關(guān)性。其中2-戊基呋喃是具有果香、清香的化合物[29]。4-甲基-1-(1-甲基乙烯基)-環(huán)己烯、2-乙基己醇與真空冷凍干燥香精有顯著相關(guān)性；苯乙醛、甲硫基丙醛、2,6,6-三甲基-1,3-環(huán)己二烯-1-甲醛、鄰苯二甲酸二異丁酯與噴霧干燥香精有顯著相關(guān)性。由圖5d 可以看出，超聲波噴霧-冷凍干燥相較于其他兩種干燥方式，和原香精溶液中的揮發(fā)性物質(zhì)重合的種類數(shù)最多且含量更接近。而真空冷凍干燥制得的香精中揮發(fā)性物質(zhì)與原香精相比產(chǎn)生了不同的氣味化合物，而且與原香精中相同的化合物含量比超聲波噴霧-冷凍干燥方式少。噴霧干燥方式制得的香精粉體由于經(jīng)過高溫，又產(chǎn)生了新的揮發(fā)性化合物，氣味與原香精相比發(fā)生了明顯變化。因此綜合來看，超聲波噴霧-冷凍干燥方式制得的香精粉體效果最好。

圖5 不同干燥方式制得的香精粉體中揮發(fā)性化合物分析圖Fig.5 Analysis diagram of volatile compounds in essence powder prepared by different drying methods

3 結(jié)論

本研究以貽貝酶解物為原料，通過單因素及正交試驗得到美拉德反應(yīng)的最佳工藝條件為：木糖5wt%，反應(yīng)時間90 min，反應(yīng)溫度100 ℃，所得海鮮香精風(fēng)味好，且有濃郁海鮮風(fēng)味。通過香精粉的物理特性和微觀結(jié)構(gòu)對3 種干燥方式（超聲波噴霧-冷凍干燥、真空冷凍干燥和噴霧干燥）進行對比，顯示出超聲波噴霧-冷凍干燥制得的香精粉優(yōu)于其他兩種干燥方式制得的香精粉，其粉體細(xì)膩、分散均勻、呈大顆粒狀、顏色淡黃、堆積密度小、溶解性好且色差與香精原液最為接近。通過SPME-GC-MS 法測定香精中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，共檢測出28 種揮發(fā)性物質(zhì)，主要包括醛、醇、吡嗪、呋喃、酯、酮等。通過最小偏二乘判別和聚類分析發(fā)現(xiàn)，3 種干燥方式制得的香精中揮發(fā)性成分差異顯著，超聲波噴霧-冷凍干燥制得的香精粉質(zhì)細(xì)膩且風(fēng)味最接近香精原液。本研究可為貽貝的深加工和高值化利用提供一定的理論參考。