朱學(xué)伸，王凱，徐俊杰，陳顯銳，周越，劉少華，黃雪方，王仁雷

（江蘇第二師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)化工學(xué)院，藥食兩用活性物質(zhì)開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 211200）

我國(guó)一直以來(lái)都是鴨子的主要養(yǎng)殖及屠宰基地，鴨肉產(chǎn)量一直穩(wěn)居世界前列。雖然國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上鹽水鴨、烤鴨等產(chǎn)品十分深受消費(fèi)者喜愛，但鴨肉整體深加工比率仍有較大提升空間。眾所周知，鴨肉肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的變化對(duì)肉類品質(zhì)有很大影響，其主要功能特性是能夠形成熱誘導(dǎo)凝膠，從而賦予肉類制品良好的質(zhì)地和口感，但劣質(zhì)肉的產(chǎn)生對(duì)于肉品品質(zhì)的影響不容忽視。課題組較早在國(guó)內(nèi)報(bào)道了類PSE 禽肉的發(fā)生，其是宰前因素與基因特性共同作用的結(jié)果[1,2]。國(guó)內(nèi)外先后研究報(bào)道了宰后初期高溫處理是誘導(dǎo)類PSE 肉產(chǎn)生的主要途徑，可模擬產(chǎn)生雞肉[3]、火雞肉[4]、豬肉[5]、兔肉[6]等劣質(zhì)肉，其顯著特征均是顏色發(fā)白，保水性差，蛋白質(zhì)功能特性下降。值得一提的是，禽肉中關(guān)于初期高溫對(duì)鴨肉的影響報(bào)道十分缺乏。近年來(lái)肌原纖維蛋白氧化與其蛋白特性關(guān)系越來(lái)越受到關(guān)注。Carvalho 等[7]研究報(bào)告了利用高溫誘導(dǎo)類PSE 肉中蛋白質(zhì)羰基化程度高，蛋白質(zhì)不同程度產(chǎn)生交聯(lián)，最終提出了蛋白質(zhì)氧化與宰后高溫處理后肉雞纖維蛋白的理化特性顯著相關(guān)。包玉龍等[8]隨后研究報(bào)道豬肌原纖維氧化會(huì)造成組氨酸殘基的損失，會(huì)導(dǎo)致肌原纖維蛋白羰基的形成；自由巰基損失，形成二硫鍵，最終導(dǎo)致大的交聯(lián)組分的形成。同時(shí)肌球、肌動(dòng)和原肌球蛋白等等電點(diǎn)下降，肌原纖維凈電荷發(fā)生改變，最終影響肉的品質(zhì)。李銀等[9]試驗(yàn)分析了羥自由基氧化體系中不同過(guò)氧化氫濃度對(duì)蛋白氧化程度及肌原纖維蛋白凝膠白度、持水力、質(zhì)構(gòu)特性與彈性模量等特征指標(biāo)的影響，羥自由基氧化體系中，氧化劑濃度越高，氧化程度就越高，肌原纖維結(jié)構(gòu)破壞越嚴(yán)重，保水性越低。陳曉思等[10]對(duì)氧化兔肉肌原纖維蛋白進(jìn)行研究，肌原纖維二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲含量上升，同時(shí)部分蛋白發(fā)生聚集和交聯(lián)?？偨Y(jié)近年來(lái)的研究可以發(fā)現(xiàn)，蛋白氧化并導(dǎo)致蛋白加工性能的變化，及其與相應(yīng)功能特性改變的內(nèi)在關(guān)系仍有待于研究。適度的蛋白氧化甚至可以改善或提高肌肉蛋白的功能特性，因此研究鴨肉中氧化程度以及同時(shí)關(guān)注宰后溫度的影響具有一定理論意義。

本文主要研究不同羥基自由基氧化體系對(duì)不同溫度處理后鴨肉提取的肌原纖維蛋白氧化特性及凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響，旨為鴨肉產(chǎn)品加工過(guò)程中的質(zhì)量控制提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料鴨胸肉采購(gòu)于江蘇省南京市溧水區(qū)當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。鴨經(jīng)屠宰后立刻取下鴨胸肉，放置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，在宰后0.5 h 至4.5 h 期間分別按照兩個(gè)溫度梯度0 ℃和40 ℃下處理鴨胸肉樣品，之后分裝成約30g 每袋，置于-80 ℃冰箱保存待用。實(shí)驗(yàn)所用氯化鈉、氯化鎂、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸、磷酸氫二鉀、過(guò)氧化氫、乙二胺四乙酸二鈉、三氯乙酸、十二烷基硫酸鈉、2,4-二硝基苯肼等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純（≥99.70%），實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 主要儀器設(shè)備

ST2100 實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)，上海奧豪斯儀器有限公司；5810R 多功能臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；UV5100 紫外可見光分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；BDF-25V350 電熱超低溫冰箱，濟(jì)南寶來(lái)醫(yī)療器械有限公司；GZX9070MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司分散器；T18 分散器，德國(guó)IKA 公司；Hitachi S-3000N 掃描電鏡，日本日立公司等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取

鴨肉肌原纖維的提取方法提取按照Park 等[11]的方法做適當(dāng)修改。取30 g 鴨胸肉樣品加入120 mL 提取液（四倍體積），放入絞肉機(jī)，之后轉(zhuǎn)移到離心管中。13 000 r/min 條件按下分散30 s 后于4 ℃，6 000 r/min離心10 min，重復(fù)上述分散及離心步驟三次，獲得的沉淀用Trinton X-100 再洗三次。之后沉淀再用0.1 mol/L NaCl 洗三次，得到肌原纖維蛋白沉淀。此過(guò)程需要全程冰浴進(jìn)行。

1.3.2 Fenton 體外氧化體系的建立

肌原纖維的氧化參考Kong 等[12]的方法，并有一些改動(dòng)。將濃度調(diào)制33 mg/L 的蛋白液與Fenton 試劑：0.01 mmol/L 三氯化鐵，0.1 mmol/L 抗壞血酸（A 液）和過(guò)氧化氫（B 液）按照表1進(jìn)行處理，其中過(guò)氧化氫的濃度梯度為0、5、10 mmol/L。將整個(gè)反應(yīng)體系放置4 ℃氧化24 h。之后加入10 μL，500 mmol/L EDTA 終止氧化。之后在反應(yīng)體系中加入30 mL 10 mmol/L 磷酸氫二鉀，4 ℃ 10 000 r/min，離心10 min，棄上清。將得到的沉淀用40 mL 10 mmol/L 磷酸氫二鉀緩沖液再洗滌2 次，即得氧化后肌原纖維蛋白沉淀。蛋白質(zhì)濃度采用Biuret 方法測(cè)定。

表1 Fenton 氧化體系Table 1 Fenton oxidation system

1.3.3 肌原纖維蛋白的保水性測(cè)定

根據(jù)Bao 等[13]方法測(cè)定了肌原纖維的保水性（B，%）。先稱取并記錄離心管質(zhì)量為m1，取約1 g 氧化后肌原纖維蛋白沉淀置于離心管中，記錄總質(zhì)量為m2，將裝有蛋白的離心管開蓋豎直放入烘箱中，100 ℃干燥6 h；取出離心管，記錄總質(zhì)量為m3。

1.3.4 肌原纖維蛋白巰基含量測(cè)定

氧化處理后肌原纖維的巰基含量依據(jù)Zhang 等[14]的方法測(cè)定，并作適當(dāng)修改，利用DTNB 顯色法測(cè)定蛋白中游離巰基的含量。取濃度為2 mg/mL 的蛋白質(zhì)溶液600 μL，用1 400 μL 0.6 mol/L NaCl 稀釋，之后取0.5 mL 上述溶液溶液加入2 mL 0.1 mol/L Tris-HCl，測(cè)A412(前)和A280；將溶液倒回離心管中，再向離心管加入0.5 mL 10 mmol/L DTNB，混勻后室溫避光30 min 后測(cè)A412(后)，用0.1 mol/L Tris-HCl 調(diào)零。采用14 150 L/(mol·cm)摩爾消光系數(shù)換算，巰基含量[記為C，nmol/(mg pro)]利用下列公式計(jì)算，測(cè)定三次取平均值。

1.3.5 羰基含量測(cè)定

氧化處理后肌原纖維的羰基含量的參照Solia等[15]的方法測(cè)定，并略做改動(dòng)，使用DNPH 顯色法測(cè)定蛋白中的羰基含量。取蛋白濃度為20 mg/mL 的溶液五份（每份200 μL），再加入1 mL 10%三氯乙酸，8 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀加入400 μL 5wt% SDS 于100℃水浴15 min。取其中2 份樣品加入400 μL 3 mol/L HCl，另外3 份樣品加入400 μL 0.3wt% DNPH，靜置30 min 后加入300 μL 體積分?jǐn)?shù)40% TCA，8 000 r/min離心5 min，棄上清液。沉淀用1 mL 乙醇-乙酸乙酯10 000 r/min 離心3×5 min，沉淀干燥20 min，加入1.5 mL 6 mol/L 鹽酸胍，37 ℃水浴30 min 后10 000 r/min，4 ℃，離心5 min，取上清測(cè)A280和A370，調(diào)零用鹽酸胍。采用22 000 L/(mol·cm)摩爾消光系數(shù)換算，羰基含量[記為D，nmol/(mg pro)]利用下列公式計(jì)算，測(cè)定三次取平均值。

1.3.6 表面疏水性測(cè)定

氧化處理后肌原纖維蛋白的表面疏水性按照Miklav?in 等[16]的方法進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行了一些修改。取濃度為2 mg/mL 蛋白質(zhì)溶液1 mL，加入200 μL 1 mg/mL溴酚藍(lán)溶液，于4 ℃孵育10 min 后10 000 r/min 離心3 min，取上清液稀釋十倍后測(cè)A595，調(diào)零用緩沖液。表面疏水性（E，μg）利用下列公式計(jì)算，測(cè)定三次取平均值。

1.3.7 電泳及蛋白免疫印跡

蛋白質(zhì)電泳參照J(rèn)ia 等[17]的方法并進(jìn)行了一些修改，將不同氧化體系處理后蛋白質(zhì)溶液濃度調(diào)至2 mg/mL（用0.6 mol/L NaCl，10 mmol/L 磷酸氫二鉀，pH 值7.0 稀釋），取500 μL 上述溶液與500 μL 上樣緩沖液混合均勻，再加入10 μL 1 mg/mL 溴酚藍(lán)，混勻后金屬浴99 ℃加熱5 min。電泳條件：200 V，45 min。染色、脫色后用凝膠呈像儀進(jìn)行拍照和分析。

蛋白免疫印跡條件如下：取出電泳后凝膠進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)移：30 V 轉(zhuǎn)膜1 h。將轉(zhuǎn)膜結(jié)束的PVDF 膜在TBST中清洗5 min，然后轉(zhuǎn)移到封閉液中搖晃孵育1 h，用TBST 清洗5 min 后轉(zhuǎn)移到Actin 一抗（小鼠單抗）（AA132-1，碧云天）或MYH7Rabbit Polyclonal Antibody 一抗中（AF7533，碧云天）搖晃孵育1 h，用TBST 清洗3×5 min 后轉(zhuǎn)移到AP 標(biāo)記山羊抗小鼠lgG(H+L)二抗中或Anti-Rabbit lgG(Fc) AP conjugate（S3738，Promega）中搖晃孵育1 h，用TBST 清洗3×5 min 后轉(zhuǎn)移到另一干凈容器中，加入適量BCIP/NBT（A0258，碧云天）顯色。將顯色完成的PVDF膜用蒸餾水沖洗，放在濾紙上吸干水分，利用凝膠呈像儀進(jìn)行拍照和分析。

1.3.8 蛋白凝膠結(jié)構(gòu)

上述不同氧化梯度處理后的肌原纖維蛋白質(zhì)濃度調(diào)至60 mg/mL，取6 mL 放置至于10 mL 玻璃燒杯中，在水浴鍋中以2 ℃/min 梯度升溫從20 ℃加熱到80℃，之后用冰水冷卻30 min，放入4 ℃冰箱中冷藏12 h。取凝膠用3%的戊二醛固定，之后用乙醇（體積分?jǐn)?shù)50%、70%、90%、95%、100%）進(jìn)行梯度脫水。脫水后的樣品放于叔丁醇中置換，之后冷凍干燥，最后噴上約10 nm 的金粉，15 kV 電鏡觀察[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析用SPSSTM20 軟件（SPSS Inc.，美國(guó)）進(jìn)行雙因素方差分析，并采用Duncan's 方法做數(shù)據(jù)差異顯著性比較，p＜0.05 時(shí)表示不同處理組間存在顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 肌原纖維蛋白保水性分析

保水性反映了肌原纖維蛋白的吸水能力和防止其在外力作用下滲出水分的能力，側(cè)面反映肌原纖維蛋白狀態(tài)的重要指標(biāo)之一[19]。由圖1可知，隨著過(guò)氧化氫濃度的增加，DMP 的保水性逐漸下降。在不添加H2O2情況下0 ℃處理組肌原纖維蛋白的保水性為93.48%，而被10 mmol/L H2O2氧化24 h 后的0 ℃處理組DMP 保水性僅為90.07%，原因可能是部分DMP 被過(guò)氧化氫產(chǎn)生的羥基自由基誘導(dǎo)發(fā)生氧化，肽鏈側(cè)鏈巰基形成二硫鍵，蛋白質(zhì)之間發(fā)生交聯(lián)，導(dǎo)致DMP 橫向收縮，破壞了蛋白間的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，肌原纖維蛋白發(fā)生了變性并過(guò)度聚集形成聚集體。蛋白肽鏈聚集體改變了其結(jié)構(gòu)，不利于形成穩(wěn)定的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，對(duì)水分的截留能力變差[20,21]，而氧化導(dǎo)致的蛋白質(zhì)交聯(lián)使肌原纖維發(fā)生收縮，疏水性基團(tuán)暴露，從而對(duì)DMP 保水性產(chǎn)生直接的負(fù)面影響。同時(shí)，40 ℃處理組DMP 氧化空白組和添加10 mmol/L H2O2組的保水性分別為85.39%和83.09%，隨著過(guò)氧化氫濃度的增加，40 ℃處理組組DMP 的保水性呈現(xiàn)一定的下降趨勢(shì)（p＜0.05），但在相同氧化體系條件下，高溫預(yù)處理組客觀上造成了肌原纖維蛋白保水性進(jìn)一步顯著下降。

圖1 不同過(guò)氧化氫氧化梯度對(duì)不同溫度預(yù)處理鴨肉肌原纖維蛋白保水性的影響Fig.1 Effects of different hydrogen peroxide oxidation gradients on water holding capacity of duck myofibrillar protein pretreated at different temperatures

2.2 肌原纖維蛋白氧化指標(biāo)分析

2.2.1 羰基含量測(cè)定

羰基含量是蛋白質(zhì)氧化的重要指標(biāo)之一，羰基含量越高表明蛋白質(zhì)被氧化的程度越高[22]，不同濃度過(guò)氧化氫氧化下肌原纖維蛋白的羰基含量如圖2所示，隨著過(guò)氧化氫濃度的增加，0 ℃處理組和40 ℃處理組組DMP 的羰基含量都呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)（p＜0.05），在相同氧化體系條件下，40 ℃處理組羰基含量顯著高于0 ℃處理組的羰基含量（p＜0.05），說(shuō)明40 ℃處理組DMP 更容易被氧化，推測(cè)可能與宰后初期高溫處理導(dǎo)致部分關(guān)鍵的氧化還原酶活性下降，同時(shí)部分骨架蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，結(jié)構(gòu)更加松散[7]。推測(cè)羥基自由基氧化導(dǎo)致肽鏈羰基含量上升，主要跟蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的一些基團(tuán)，如精氨酸、脯氨酸、蘇氨酸和賴氨酸側(cè)鏈基團(tuán)被羥基自由基氧化生成羰基化合物有關(guān)，同時(shí)氧化自由基會(huì)直接攻擊蛋白質(zhì)肽鏈，直接使天冬氨酸和谷氨酸氧化，使肽鏈進(jìn)一步裂解，導(dǎo)致羰基含量上升[8]；需要強(qiáng)調(diào)的是，由于氧化使蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使隱藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的氨基酸殘基被暴露出來(lái)尤其是高溫組，被自由基氧化，同樣會(huì)進(jìn)一步造成羰基含量上升。李銀等[9]報(bào)道了類似的結(jié)果，隨H2O2濃度的增加到20 mmol/L，豬背最長(zhǎng)肌中肌原纖維羰基值顯著上升至2.82 nmol/mg pro。

圖2 不同過(guò)氧化氫氧化梯度對(duì)不同溫度預(yù)處理鴨肉肌原纖維蛋白羰基含量的影響Fig.2 Effects of different hydrogen peroxide oxidation gradients on carbonyls content of myofibrillar protein in duck meat pretreated at different temperatures

2.2.2 巰基含量測(cè)定

巰基是肌原纖維中反應(yīng)活性最高，對(duì)氧化條件最敏感的基團(tuán)，其總含量是反映蛋白質(zhì)氧化狀態(tài)的重要指標(biāo)之一。DMP 中巰基基團(tuán)數(shù)量較多，其中僅肌球蛋白就含有42 個(gè)巰基[23]。含硫的氨基酸殘基很容易受到活性氧的攻擊而形成二硫鍵產(chǎn)生交聯(lián)，從而進(jìn)一步對(duì)蛋白質(zhì)的功能造成一定的影響。不同過(guò)氧化氫氧化梯度對(duì)不同溫度預(yù)處理鴨肉肌原纖維蛋白巰基含量的影響如圖3所示。0 ℃處理組在沒(méi)有過(guò)氧化氫添加的情況下巰基含量為84.81 nmol/mg pro，隨著過(guò)氧化氫的濃度增加，蛋白巰基含量呈下降趨勢(shì)，當(dāng)過(guò)氧化氫濃度達(dá)到10 mmol/L 時(shí)，巰基含量?jī)H為66.98 nmol/mg pro，說(shuō)明巰基含量會(huì)隨著氧化力度的增加而下降。而高溫組DMP 隨著體系中過(guò)氧化氫濃度的升高巰基含量也呈下降趨勢(shì)（p＜0.05）。在同一氧化梯度下，高溫預(yù)處理組巰基含量顯著低于普通肉蛋白的巰基含量，表明40 ℃處理組更易被氧化，以上結(jié)果與上述羰基含量所表明的結(jié)果相一致。陳曉思等[10]之前報(bào)道了類似的結(jié)果，過(guò)氧自由基（AAPH）處理后巰基含量呈現(xiàn)顯著的下降，當(dāng)濃度達(dá)到10 mmol/L 時(shí)，巰基含量下降至31.93 nmol/mg pro。

圖3 不同過(guò)氧化氫氧化梯度對(duì)不同溫度預(yù)處理鴨肉肌原纖維蛋白巰基含量的影響Fig.3 Effects of different hydrogen peroxide oxidation gradients on thiol group content of myofibrillar protein in duck meat pretreated at different temperatures

2.2.3 表面疏水性測(cè)定

表面疏水性的改變可以直接反應(yīng)疏水性氨基酸在蛋白質(zhì)表面的分布情況和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。蛋白質(zhì)的表面疏水性一般用蛋白質(zhì)中疏水性氨基酸與溴酚藍(lán)的結(jié)合量表示。表面疏水性的過(guò)量增加會(huì)使蛋白質(zhì)與水間的相互作用減弱，造成蛋白質(zhì)穩(wěn)定性降低，出現(xiàn)蛋白疏水性聚集，導(dǎo)致蛋白變性，影響肌肉蛋白制品品質(zhì)[24]。不同濃度過(guò)氧化氫氧化對(duì)不同溫度預(yù)處理的肌原纖維蛋白表面疏水性的影響如圖4所示，對(duì)照組0℃處理組DMP在沒(méi)有過(guò)氧化氫添加的情況下表面疏水性為50.72 μg，在同樣條件下，40 ℃處理組蛋白的表面疏水性達(dá)到82.93 μg；并且隨著過(guò)氧化氫濃度的增加，兩組樣品蛋白的表面疏水性均都有上升趨勢(shì)（p＜0.05），即羥基自由基氧化使DMP 更多的疏水性氨基酸殘基暴露。前面研究結(jié)果也顯示氧化自由基攻擊含硫氨基酸殘基間形成二硫鍵，蛋白發(fā)生聚集，使蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其可能與隱藏在蛋白內(nèi)部疏水性氨基酸被暴露過(guò)程相關(guān)聯(lián)。需要指出的是，劉洋[25]前期報(bào)道了過(guò)度Fenton 氧化處理豬肌原纖維表面疏水性卻顯著下降，推測(cè)這可能是因?yàn)樵贔enton 氧化過(guò)程中蛋白受到的氧化作用過(guò)于強(qiáng)烈，從而導(dǎo)致蛋白在后期處于聚集狀態(tài)，掩蓋了蛋白結(jié)構(gòu)展開。

圖4 不同過(guò)氧化氫氧化梯度對(duì)不同溫度預(yù)處理鴨肉肌原纖維表面疏水性的影響Fig.4 Effects of different hydrogen peroxide oxidation gradients on the surface hydrophobicity of duck myofibrils pretreated at different temperatures

2.3 電泳及蛋白免疫印記分析

不同過(guò)氧化氫濃度處理后肌原纖維蛋白組成如圖5所示，在非還原條件情況下，蛋白大量聚集在180 ku以上區(qū)域，同時(shí)凝膠頂部上樣孔處可以觀察到高分子量的蛋白質(zhì)聚合物；推測(cè)原因可能是由于羥基自由基氧化造成蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，蛋白質(zhì)分子量增加[26]。需要指出的是周非白等[27]研究報(bào)道了氧化對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響與反應(yīng)體系氧化劑濃度有關(guān)，較低濃度有利于蛋白交聯(lián)，產(chǎn)生蛋白聚集體，而過(guò)高濃度的反而可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)組分的降解。在還原條件下，凝膠上樣孔處堆積的大分子量蛋白顯著減少，180 ku 附近的肌球蛋白重鏈和45 ku 附近肌動(dòng)蛋白條帶強(qiáng)度有明顯增強(qiáng)，這表明二硫鍵是造成蛋白交聯(lián)的主要作用力，且氧化中發(fā)生交聯(lián)聚集的蛋白主要是肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白[28]；結(jié)合上文羰基、巰基含量的變化，SDS-PAGE的結(jié)果可以進(jìn)一步證明氧化導(dǎo)致肌原纖維巰基含量下降的部分原因是共價(jià)鍵交聯(lián)（二硫鍵等），在凝膠頂部仍然存在部分大分子量的聚集體殘留，表明樣品中還存在其它非二硫鍵的共價(jià)鍵參與了蛋白質(zhì)交聯(lián)，如希夫堿和二酪氨酸等[27]。還原劑添加后的樣品可發(fā)現(xiàn)肌球蛋白重鏈條帶強(qiáng)度呈上升趨勢(shì)，肌動(dòng)蛋白條帶呈下降趨勢(shì)。同樣發(fā)現(xiàn)在120 ku 附近有新的不連續(xù)條帶生成，這可能是由于高溫處理組DMP 結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，肌漿蛋白中的糖原磷酸化酶附著在骨架蛋白（即肌原纖維蛋白）上被提取出來(lái)[3]。在17 ku 附近可以觀察到無(wú)還原劑的樣品有清晰的肌球蛋白輕鏈3(MLC3)條帶和模糊的肌球蛋白輕鏈2(MLC2)，而在還原條件下樣品肌球蛋白輕鏈3 條帶強(qiáng)度明顯減弱，且在20 ku 附近出現(xiàn)清晰的肌球蛋白輕鏈2。

圖5 不同過(guò)氧化氫氧化梯度對(duì)不同溫度預(yù)處理鴨肉肌原纖維SDS-PAGE 圖譜(a)及肌球蛋白(b)和肌動(dòng)蛋白(c,d)免疫印跡結(jié)果的影響Fig.5 Effects of different hydrogen peroxide oxidation gradients on SDS-PAGE profile of DMP (a) and western-blotting of myosin (b)and actin (c,d) in duck myofibrils pretreated at different temperatures

肌球蛋白蛋白免疫印記實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5b 所示，非還原組樣品結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白全部聚集在加樣孔附近，且印跡強(qiáng)度與電泳染色結(jié)果有相同的趨勢(shì)。還原組結(jié)果顯示180 ku 附近的肌球蛋白重鏈條帶大量聚集，與電泳結(jié)果中發(fā)現(xiàn)的交聯(lián)聚集的蛋白主要是肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白一致。樣品7～9 為0 ℃處理組肌原纖維，印跡強(qiáng)度基本處于同一水平，40 ℃處理組印跡強(qiáng)度呈明顯的上升趨勢(shì)，這是因?yàn)?0 ℃處理組肌球蛋白的蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，較0 ℃處理組肌球蛋白更容易受到羥基自由基的影響。肌動(dòng)蛋白蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5c、5d 所示，其中圖5c 為非還原條件，大部分肌動(dòng)蛋白交聯(lián)成大分子量蛋白聚集體堆積在凝膠的上部，在45 ku 附近可以觀察到部分肌動(dòng)蛋白蛋白條帶；印跡強(qiáng)度也與電泳結(jié)果有相同的趨勢(shì)。對(duì)比1 和6 號(hào)樣品，6 號(hào)樣品的大分子量條帶強(qiáng)度強(qiáng)于1 號(hào)樣品，45 ku 處的肌動(dòng)蛋白條帶則是1 號(hào)樣品更強(qiáng)，說(shuō)明高氧化力度下的高溫處理組肌原纖維氧化程度更高，蛋白間交聯(lián)的程度更高，有更多的肌動(dòng)蛋白被交聯(lián)聚集成高分子量的肌動(dòng)球蛋白聚合物。圖5d 為還原狀態(tài)免疫印跡結(jié)果，發(fā)現(xiàn)45 ku 附近的肌動(dòng)蛋白條帶強(qiáng)度明顯增加，上部分的大分子量蛋白聚集體條帶強(qiáng)度減弱，并且55～130 ku 區(qū)間有新的小分子量蛋白出現(xiàn)。在頂部進(jìn)樣孔處可以觀察到隨著氧化力度增加逐漸增強(qiáng)的蛋白聚集，這表明肌球蛋白中還存在著除二硫鍵外的其它相互作用力參與蛋白質(zhì)的交聯(lián)過(guò)程，且這種作用力也會(huì)受到過(guò)氧化氫濃度的影響[28]。

2.4 凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

不同過(guò)氧化氫氧化梯度對(duì)不同溫度預(yù)處理鴨肉肌原纖維凝膠結(jié)構(gòu)的影響如圖6所示。隨著氧化梯度的增加，鴨肉肌原纖維凝膠空洞變大，形成大小不同的分散凝膠膠束且膠束內(nèi)部網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越來(lái)越致密，而未經(jīng)過(guò)氧化處理的肌原纖維凝膠結(jié)構(gòu)相對(duì)比較均一。網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在10 mmol/L 過(guò)氧化氫處理后形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)的均勻性顯著降低且空隙增加。需要指出的是，同一氧化梯度下，40 ℃處理組結(jié)構(gòu)整體松散程度高于0 ℃處理組，側(cè)面反映其蛋白質(zhì)的凝膠特性下降，與之前保水性結(jié)果相吻合。以上結(jié)果表明，40 ℃處理組肌原纖維結(jié)構(gòu)更容易受到氧化因素的影響，最終影響其凝膠特性[29]。許多研究表明羥基自由基氧化導(dǎo)致了蛋白質(zhì)的變性，結(jié)構(gòu)更加松散無(wú)序，同時(shí)在凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成過(guò)程中由于分子間作用力受到影響，而降低了形成凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的作用力，最終弱化凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[30,31]。

圖6 不同過(guò)氧化氫氧化梯度對(duì)不同溫度預(yù)處理鴨肉肌原纖維凝膠結(jié)構(gòu)的影響Fig.6 Effects of different hydrogen peroxide oxidation gradients on the structure of duck myofibril gel pretreated at different temperatures

3 結(jié)論

宰后不同溫度處理的DMP隨著羥基自由基處理濃度的提高其羰基含量和表面疏水性升高、而巰基含量和保水性均表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，同時(shí)氧化導(dǎo)致了分子間交聯(lián)度提升，形成凝膠品質(zhì)下降。尤其需要指出的是，高溫預(yù)處理組肌原纖維結(jié)構(gòu)更容易受到氧化因素的影響。總之，在羥自由基氧化體系中對(duì)蛋白質(zhì)的氧化存在著明顯的濃度效應(yīng)。以上研究表明在鴨肉的生產(chǎn)加工中，宰后初期應(yīng)避免高溫同時(shí)盡量控制引起肌原纖維蛋白氧化的外界因素。