王娟，肖巧梅，張曉宇，羅涵瀟，李雪丹，魏子濤，呂才有*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)院，云南昆明 650201）（2.勐?？h茶葉與綠色食品產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，云南勐海 666200）

普洱茶是使用獨(dú)特的加工工藝而制成的具有獨(dú)特品質(zhì)特征的茶葉，按加工工藝的不同分為普洱生茶和普洱熟茶[1]。因其具有降脂減肥、抗氧化、降血糖、預(yù)防心血管疾病等的藥理作用[2-4]，市場需求量逐漸增大。市場擴(kuò)大的同時，云南省茶葉種植面積也在逐年上升，但我國平均茶園單產(chǎn)830 kg/hm2遠(yuǎn)低于土耳其的3 314 kg/hm2，致使很多茶葉的生物產(chǎn)量沒有被充分利用，茶鮮葉存在利用率低[5]，并且省內(nèi)對茶樹鮮葉的采摘還主要依靠傳統(tǒng)手工采摘方式來完成[6]，采摘環(huán)節(jié)出現(xiàn)了嚴(yán)重的用工荒。如何提高單位面積的產(chǎn)出效益和降低采摘成本成為云南省茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟待解決的問題，機(jī)械化采摘成為解決此難題的最可能途徑[7-9]。茶樹鮮葉機(jī)械化采摘的研究推廣，促使提升機(jī)采機(jī)制茶品質(zhì)成了首要任務(wù)。分級處理是提高品質(zhì)的一個重要手段，經(jīng)過分級處理后的機(jī)采茶，在應(yīng)用及品質(zhì)上都有所提升。目前已有大量的分級設(shè)備投入使用，可以對機(jī)采鮮葉進(jìn)行分級，一定程度上提高鮮葉的勻度和質(zhì)量[10]。經(jīng)分級后的機(jī)采鮮葉，也能初步區(qū)分鮮葉的老嫩程度，有利于之后加工原料的分離[11]。依據(jù)原料的等級來加工不同種類紅茶和綠茶[12,13]，使得機(jī)采鮮葉原料的資源利用率提升到最大化。利用機(jī)采機(jī)制曬青茶，經(jīng)分級處理后加工成普洱熟茶，是提高利用率和產(chǎn)出效益的方法，也是普洱茶提質(zhì)增效的關(guān)鍵手段。

茶葉品質(zhì)評定的方法包括感官審評和理化檢驗(yàn)，感官審評是利用人們的感覺器官對茶葉的外形、內(nèi)質(zhì)進(jìn)行審評，并用專業(yè)術(shù)語來描述茶葉的各種品質(zhì)屬性。而理化檢驗(yàn)則是通過一定的儀器、設(shè)備或方法來探測茶葉的理化性狀，組學(xué)是動態(tài)的揭示系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能相互作用和運(yùn)行規(guī)律的技術(shù)，目前植物代謝組學(xué)被廣泛用在茶學(xué)研究中，主要集中在茶葉加工[14]、茶葉功效[15]、品質(zhì)研究[16]等方面。本試驗(yàn)采用秋季機(jī)采鮮葉制作的機(jī)采曬青茶為原料，經(jīng)篩分后得到的三個不同等級機(jī)采機(jī)制曬青茶，通過小框發(fā)酵的方式加工成不同等級普洱熟茶。用代謝組學(xué)技術(shù)來揭示氨基酸、生物堿、黃酮及類黃酮和兒茶素及其衍生物這幾類物質(zhì)在不同等級普洱熟茶中的變化規(guī)律，以期找到影響不同等級普洱熟茶品質(zhì)的主要化學(xué)成分；并根據(jù)感官審評結(jié)果來篩選出提高機(jī)采曬青茶加工普洱熟茶品質(zhì)的加工工序，增加機(jī)采機(jī)制曬青茶的經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

曬青茶取樣：本實(shí)驗(yàn)于2020年秋季，課題組成員前往云南省德宏現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)茶園使用機(jī)械采摘大葉種云抗十號鮮葉，后經(jīng)機(jī)械化加工制成機(jī)采機(jī)制曬青茶，并以此為原料。通過型號6CSY 茶葉平篩機(jī)（篩子為4 目和7 目）把機(jī)采機(jī)制曬青茶原料分為三個等級，三個不同等級機(jī)采機(jī)制曬青茶在相同條件下使用竹筐發(fā)酵的加工方式，得到A、B 和C 三個不同等級普洱熟茶試樣。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 感官審評

引用感官審評國標(biāo)[17]中普洱熟茶的感官審評方法分別從香氣、湯色、滋味、葉底四個方面評審并得出評語。

1.2.2 差異代謝物測定

委托上海百趣生物科技有限公司，A、B 和C 三個不同等級普洱熟茶為實(shí)驗(yàn)材料，應(yīng)用EXION LC System（SCIEX）超高效液相色譜儀，使用超高效液相色譜（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）和串聯(lián)質(zhì)譜（Tandem Mass Spectrometry，MS/MS）的代謝組學(xué)技術(shù)，通過Waters UPLC 液相色譜柱對目標(biāo)化合物進(jìn)行色譜分離，主要方法如下：

（1）代謝物提取

將樣本進(jìn)行冷凍干燥處理后再進(jìn)行研磨（60 Hz，30 s）；稱取50 mg 的樣本到離心管中，加入700 μL 甲醇水提取液（體積比3:1，含內(nèi)標(biāo)）；渦旋30 s，35 Hz勻漿4 min，冰水浴超聲5 min；重復(fù)勻漿超聲3 次；在混勻儀上4 ℃過夜；將樣本4 ℃，12 000 r/min 離心15 min；取上清經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾；用提取液稀釋上清液20 倍，渦旋30 s，每個樣本各取20 μL 混合成質(zhì)量控制（Quality Control，QC）樣本；-80 ℃儲存直到上機(jī)檢測。

（2）液相條件

本試驗(yàn)使用EXION LC System（SCIEX）超高效液相色譜儀，通過Waters UPLC 液相色譜柱對目標(biāo)化合物進(jìn)行色譜分離。液相色譜A 相為含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液，B 相為乙腈。柱溫箱溫度為40 ℃，自動進(jìn)樣器溫度為4 ℃，進(jìn)樣體積為2 μL，體積流量為400 μL/min，具體流動相梯度見表1。

表1 液相色譜流動相條件Table 1 Mobile phase conditions of liquid chromatography

（3）質(zhì)譜條件

本試驗(yàn)使用裝備IonDrive Turbo VESI 離子源的SCIEX 6500 QTRAP+三重四極桿質(zhì)譜儀，以多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式進(jìn)行質(zhì)譜分析。離子源參數(shù)如下：IonSpray Voltage：+5500 V/-4500 V，Curtain Gas：35 psi，Temperature：400 ℃，Ion Source Gas 1：60 psi，Ion Source Gas 2：60 psi，DP：±100 V。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個樣品提取4 次，實(shí)驗(yàn)中所有質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及目標(biāo)化合物定量分析工作。均通過SCIEX Analyst Work Station Software（Version 1.6.3）來完成。使用MSconventer 軟件將質(zhì)譜原始轉(zhuǎn)成TXT 格式。再使用自撰寫R 程序包結(jié)合自建數(shù)據(jù)庫完成提峰、注釋等工作。

采用多元統(tǒng)計(jì)分析，基于正交偏最小二乘法-判別分析（Orthogonal Projections to Latent Structures-Discriminant Analysis，OPLS-DA）結(jié)果，從多變量分析 OPLS-DA 模型的變量重要性投影（Variable Importance in Project，VIP）中初步篩選出不同樣品間差異代謝物，再通過組合單變量分析的P（P-Value）值或差異倍數(shù)值（Fold Change）來進(jìn)一步篩選差異代謝物。本試驗(yàn)中存在生物學(xué)重復(fù)，通過Fold Change 和OPLS-DA 模型的VIP 值相結(jié)合的方法來篩選差異代謝物。篩選標(biāo)準(zhǔn)：選取Fold Change≥2（上調(diào)）和Fold Change≤0.5（下調(diào)）的代謝物。

2 結(jié)果與討論

2.1 感官審評

參照普洱茶國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22111-2008 對三個試樣進(jìn)行感官審評，得出感官審評結(jié)果表2和圖1，認(rèn)為這三個普洱熟茶試樣為合格茶樣，具有普洱熟茶的品質(zhì)特征。外形評定中A 最好，條索較緊結(jié)和緊細(xì)，只是略帶老梗；B 較好，帶少量黃片與老梗；C 較差，存在大量黃片與老梗。內(nèi)質(zhì)評定中七個試樣的湯色除A為紅褐之外，其余試樣的湯色都為褐紅，差異較??；香氣結(jié)果中為B 較好，表現(xiàn)為陳香濃郁且持久，其余試樣都為陳香較濃郁；滋味結(jié)果中為B 和C 最好，口感達(dá)到醇厚，A 的滋味較淡；葉底結(jié)果中，A 的葉底明顯區(qū)別于其余試樣，A 的葉底中明顯存在泛青的現(xiàn)象，說明發(fā)酵程度不足，其余試樣差異較小。

表2 感官審評結(jié)果Table 2 Sensory evaluation results

圖1 感官審評Fig.1 Sensory evaluation

A、B 和C 三個不同等級普洱熟茶中B 的感官審評結(jié)果最優(yōu)；A 等級嫩度最高，但感官審評結(jié)果并不是最優(yōu)的，葉底中出現(xiàn)泛青現(xiàn)象，發(fā)酵程度明顯低于其余試樣，說明不一定嫩度最高，加工的普洱熟茶品質(zhì)就最好。

2.2 代謝產(chǎn)物種類及主成分分析

三個試樣經(jīng)廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)鑒定，共檢測到1 073 種物質(zhì)，已確定1 048 種代謝物，包括178 個黃酮及類黃酮、141 個生物堿、139 個萜類、86 個酚類及其衍生物、67 個苯丙素和香豆素、55 個脂類、50 個醇類、44 個氨基酸及其衍生物、42 個酸類、36 個雜環(huán)化合物、32 個有機(jī)化合物、31 個核苷酸及其衍生物、28 個木脂素、24 個酮類、18 個醌類、14 個植物激素、9 個糖類、6 個維生素、3 個酯類和45 個其他類，共20 個類別。

主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）圖中橫坐標(biāo)PC[1]和縱坐標(biāo)PC[2]分別表示排名第一和第二的主成分的得分，每個散點(diǎn)代表一個樣本，散點(diǎn)的顏色和形狀表示不同的分組。樣本基本處于95%置信區(qū)間內(nèi)。圖2PCA 得分圖中，A、B 和C 三個不同等級存在明顯區(qū)分。A 明顯區(qū)別于其余試樣，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的不同等級試樣之間均得到清晰的區(qū)分，存在具有顯著性差異的相關(guān)化合物，說明它們可作為鑒別不同等級普洱熟茶之間的代謝標(biāo)志物。

圖2 PCA 得分圖Fig.2 PCA score chart

2.3 不同等級普洱熟茶代謝物對比分析

為了進(jìn)一步區(qū)分不同組別差異，確定不同等級普洱熟茶的差異成分，采用有監(jiān)督的OPLS-DA 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，圖3分別顯示了OPLS-DA 方法對原料分級和精制分級后得到不同等級普洱熟茶的分析結(jié)果。圖中橫坐標(biāo)t[1]P 表示第一主成分的預(yù)測主成分得分，展示樣本組間差異，縱坐標(biāo)t[1]O 表示正交主成分得分，展示樣本組內(nèi)差異，每個散點(diǎn)代表一個樣本，散點(diǎn)形狀和顏色表示不同的實(shí)驗(yàn)分組。從OPLS-DA 得分圖的結(jié)果可以看出，兩組樣本兩兩之間區(qū)分非常顯著，且樣本全部處于95%置信區(qū)間（Hotelling's T-squaredellipse）內(nèi)，說明不同等級普洱熟茶組分間的代謝產(chǎn)物都產(chǎn)生較大的差異。

圖3 不同等級普洱熟茶對比的OPLS-DA 得分散點(diǎn)圖Fig.3 OPLS-DA score scatter diagram of comparison of different grades of Pu'erh ripe tea

置換檢驗(yàn)通過隨機(jī)改變分類變量Y的排列順序，多次（次數(shù)n=200）建立OPLS-DA 模型以獲取隨機(jī)模型的R2和Q2值。圖4中橫坐標(biāo)表示置換檢驗(yàn)的置換保留度（與原模型Y變量順序一致的比例，置換保留度等于1 處的點(diǎn)即為原模型的R2Y和Q2值），縱坐標(biāo)表示R2Y和Q2取值，綠色圓點(diǎn)表示置換檢驗(yàn)得到的R2Y值，藍(lán)色方點(diǎn)表示置換檢驗(yàn)得到的Q2值，兩條虛線分別表示R2Y和Q2的回歸線[18]。原模型R2Y非常接近1，說明建立的模型符合樣本數(shù)據(jù)的真實(shí)情況；原模型Q2比較接近1，說明如果有新樣本加入模型，會得到比較近似的分布情況，總的來說原模型可以很好地解釋兩組樣本之間的差異。置換檢驗(yàn)隨機(jī)模型的Q2值均小于原模型的Q2值；Q2的回歸線與縱軸的截距小于零；同時隨著置換保留度逐漸降低，置換的Y變量比例增大，隨機(jī)模型的Q2逐漸下降。由此說明本試驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂辛己玫姆€(wěn)健性，不存在過擬合現(xiàn)象。

2.4 不同等級普洱熟茶差異代謝物的篩選

VIP 值表示對應(yīng)代謝物的組間差異在模型中各組樣本分類判別中的影響強(qiáng)度，一般認(rèn)為VIP≥1 的代謝物則為差異顯著。本研究以VIP≥1 且p＜0.05 為卡值標(biāo)準(zhǔn)，用OPLS-DA 模型（圖4）來比較不同等級普洱熟茶間的代謝差異。A、B 和C 三個不同等級普洱熟茶差異代謝物中，A 組相對于B 組有269 個差異代謝物，237 個成分顯著上調(diào)，32 個成分顯著下調(diào)；A 組相對于C 組有296 個差異代謝物，255 個成分顯著上調(diào)，41個成分顯著下調(diào)；B 組相對于C 組有127 個差異代謝物，83 個成分顯著上調(diào)，44 個成分顯著下調(diào)。

圖4 不同等級普洱熟茶對比的模型置換檢驗(yàn)圖Fig.4 Model replacement test chart for comparison of different grades of Pu'erh ripe tea

根據(jù)上述得到的差異代謝物，將篩選差異代謝物的結(jié)果以火山圖（Volcano Plot）的形式進(jìn)行可視化，來尋找潛在的差異物質(zhì)[19]。如圖5所示，火山圖中每個點(diǎn)代表一個代謝物，橫坐標(biāo)代表該組對比各物質(zhì)的倍數(shù)變化（取以2 為底的對數(shù)），縱坐標(biāo)表示學(xué)生t檢驗(yàn)的P-value（取以10 為底對數(shù)的負(fù)數(shù)），散點(diǎn)大小代表OPLS-DA 模型的VIP 值，散點(diǎn)越大VIP 值越大。散點(diǎn)顏色代表最終的篩選結(jié)果，顯著上調(diào)的代謝物以紅色表示，顯著下調(diào)的代謝物以藍(lán)色表示，非顯著差異的代謝物為灰色?？梢灾庇^的看出不同組間差異代謝物的分布情況，每組對比樣本都有明確的高表達(dá)或者低表達(dá)的區(qū)域，都能夠很好的區(qū)別，不同等級普洱熟茶在代謝產(chǎn)物的表達(dá)上有呈現(xiàn)出明顯差異性。

圖5 A vs B、A vs C、B vs C 差異代謝物Fig.5 The difference metabolites of A vs B、A vs C、B vs C

2.5 不同等級普洱熟茶主要差異代謝物分析

為了進(jìn)一步找出不同等級普洱熟茶中兩組間對結(jié)果分析起貢獻(xiàn)作用的變量，采用VIP≥1、p＜0.05 且Fold Change≥2 或≤0.5 作為最終差異物篩選的條件，結(jié)果篩選鑒定出A、B 和C 三個不同等級中差異代謝物共238 個，具體結(jié)果見表附錄；其中A 組相對于B組有163 個差異代謝物，150 個成分顯著上調(diào)，13 個成分顯著下調(diào)；A 組相對于C 組有185 個差異代謝物，167 個成分顯著上調(diào)，18 個成分顯著下調(diào)；B 組相對于C 組有37 個差異代謝物，23 個成分顯著上調(diào)，14 個成分顯著下調(diào)。上調(diào)代表相對定量增加，下調(diào)代表相對定量降低。

238 個差異代謝物中有12 個在三組對比中均為差異代謝物，即為標(biāo)志性代謝物，包括1 個核苷酸及其衍生物、1 個嘌呤核苷類、3 個萜類、2 個酚類、4 個黃酮及類黃酮和1 個糖類。表3為標(biāo)志性差異代謝物的詳細(xì)信息，紅色代表差異為2 倍以上，藍(lán)色代表差異在0.5 以下。對這些標(biāo)志性差異代謝物的相對定量作出柱形圖（圖6）。結(jié)果可得：A、B 和C 三個不同等級普洱熟茶隨著等級的降低，鳥苷3',5'-環(huán)一磷酸、去氧苦地膽苦素、黃獨(dú)素B、黃獨(dú)素D、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、沒食子酸甲酯、3-沒食子?；鼘幩?、兒茶素、(-)-沒食子酸兒茶素酯、表兒茶素沒食子酸酯等這些標(biāo)志性差異代謝物的相對定量是顯著減少的，而D-麥芽糖的相對定量卻是隨著等級的降低而顯著增加。兒茶素類物質(zhì)有很強(qiáng)的抗氧化活性，是茶葉中重要的活性成分之一，根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)，兒茶素組分含量在武夷肉桂茶[20]、湖南黑毛茶[21]等不同茶類中都與等級呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)的12 個標(biāo)志性代謝物中，兒茶素類物質(zhì)占比較多，表沒食子兒茶素沒食子酸酯、兒茶素、(-)-沒食子酸兒茶素酯和表兒茶素沒食子酸酯這幾個兒茶素類物質(zhì)的相對定量都是極顯著的A 高于B 高于C，說明普洱熟茶兒茶素組分的相對定量與等級也呈正相關(guān)，等級越高兒茶素組分相對定量越高。

圖6 標(biāo)志性差異代謝物Fig.6 Marker differential metabolites

表3 標(biāo)志性差異代謝物Table 3 Marker differential metabolites

茶葉品質(zhì)研究中，氨基酸、生物堿、黃酮及類黃酮和兒茶素及其衍生物這幾類物質(zhì)對茶葉品質(zhì)的影響至關(guān)重要[22]，所以本次研究也重點(diǎn)關(guān)注到這幾類物質(zhì)在不同等級普洱熟茶中變化差異。238 個差異代謝物中共篩選出18 個氨基酸及其衍生物、18 個生物堿、19個黃酮及類黃酮和12 個兒茶素及其衍生物。表4為重點(diǎn)類物質(zhì)信息表，由表可知：18 個氨基酸及其衍生物的相對總量為A（0.053 mg/g）＞B（0.007 mg/g）＞C（0.006 mg/g）；18 個生物堿的相對總量為A（0.072 mg/g）＞B（0.042 mg/g）＞C（0.028 mg/g）；19 個黃酮及類黃酮的相對總量為A（0.516 mg/g）＞C（0.221 mg/g）＞B（0.245 mg/g）；12 個兒茶素及其衍生物的相對總量為A（1.808 mg/g）＞B（0.668 mg/g）＞C（0.482 mg/g）。這幾類物質(zhì)的相對總量變化趨勢都隨等級降低而減少，除了兒茶素及其衍生物類物質(zhì)中A、B 和C 之間具有顯著性差異（p＜0.05），其余類物質(zhì)都為A 與B和C 之間具有顯著性差異（p＜0.05），B 和C 之間無顯著性差異（p＞0.05）。

表4 重點(diǎn)類物質(zhì)信息Table 4 Information of key substances

續(xù)表4

采用繪制熱圖的方式對這些重點(diǎn)物質(zhì)的單一相對定量進(jìn)行代謝產(chǎn)物層次聚類分析，圖7中不同位置的色塊代表代謝物的相對表達(dá)量，高低表達(dá)組分交互在一起，紅色表示代謝物相對定量上調(diào)，藍(lán)色表示代謝物相對定量下調(diào)；Group 1 代表氨基酸、Group 2 代表生物堿、Group 3 代表黃酮及類黃酮和Group 4 代表兒茶素及其衍生物。熱圖分析可得：A 中氨基酸、生物堿、黃酮及類黃酮和兒茶素及其衍生物這幾類物質(zhì)大部分都呈高表達(dá)，說明A 在三個等級中這幾類重點(diǎn)物質(zhì)的相對定量較高，在B 中呈較低表達(dá)，在C 中呈低表達(dá)；B 中有生物堿Lumichrome（光色素）和黃酮及類黃酮(-)-Maackiain（高麗槐素）呈高表達(dá)，其中Lumichrome（光色素）在A 中呈較低表達(dá)，C 中呈低表達(dá)，(-)-Maackiain（高麗槐素）在C 中呈高低表達(dá)，A 中呈低表達(dá)；C 中氨基酸Levodopa（左旋多巴）、生物堿Tombozine（妥包嗪）和黃酮及類黃酮Isorhamnetin（異鼠李素）呈高表達(dá)，這三個物質(zhì)在B 中都呈較低表達(dá)，A 中呈低表達(dá)。

圖7 不同等級普洱熟茶重點(diǎn)物質(zhì)熱圖Fig.7 Heatmap of key substances of different drades of Pu'erh ripe tea

綜上所述：這幾類物質(zhì)相對總量的變化趨勢都隨等級降低而減少，在所有物質(zhì)的相對定量分析中除了氨基酸Levodopa（左旋多巴）、生物堿Tombozine（妥包嗪）和黃酮及類黃酮Isorhamnetin（異鼠李素）這三個物質(zhì)是隨著等級的降低而顯著增加，其余大部分物質(zhì)是隨著等級的降低而顯著減少。氨基酸類物質(zhì)在發(fā)酵過程中，微生物的大量繁殖需要消耗大量的氨基酸作為氮源[23]，陳保等[24]曾在不同等級原料加工普洱熟茶的化學(xué)成分變化研究中，得出三級曬青茶和葉片粗老的老黃片在游離氨基酸總量的變化上隨等級的降低呈下降趨勢的結(jié)論；薛晨[25]得出不同等級普洱茶中各氨基酸組分隨級別的降低總體呈下降趨勢，本實(shí)驗(yàn)中氨基酸的相對總量變化趨勢也隨等級降低而減少，以上結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，意味著不同等級曬青茶的發(fā)酵影響著氨基酸總量的消耗。呂海鵬等[26]研究得出高等級普洱茶中的黃酮總量（1.39%）明顯低于中、低等級普洱茶（分別為1.54%和1.58%），中、低級別普洱茶差異不明顯（p＞0.05）；而趙熙[27]等在研究不同等級茯磚茶化學(xué)成分變化中，卻得到一級料茯磚茶（2.72%）的黃酮類物質(zhì)含量高于三級料茯磚茶（2.15%），本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中黃酮及類黃酮的相對總量變化趨勢為A（0.516 mg/g）＞C（0.245 mg/g）＞B（0.221 mg/g），A明顯高于B 和C，但B 和C 之間差異較小，與以上結(jié)論存在異同點(diǎn)。

2.6 差異代謝物相關(guān)通路分析

通過京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫[28]對所有差異顯著的代謝物質(zhì)進(jìn)行通路富集分析，結(jié)果如圖8顯示，氣泡圖中每一個氣泡代表一個代謝通路，氣泡所在橫坐標(biāo)和氣泡大小表示該通路在拓?fù)浞治鲋械挠绊懸蜃哟笮?，氣泡越大影響因子越大；氣泡所在縱坐標(biāo)和氣泡顏色表示富集分析的P 值（取負(fù)自然對數(shù)，即-ln P-value），顏色越深P 值越小，富集程度越顯著。代謝產(chǎn)物主要分布在15 條代謝途徑中，基于富集分析得到的P 小于0.05 對關(guān)鍵代謝途徑進(jìn)行篩選，得到1 條差異代謝物數(shù)量富集相關(guān)性較強(qiáng)的通路，該差異代謝物富集通路為苯丙氨酸代謝，包括L-苯丙氨酸、2-苯乙胺、2-苯乙酰胺和4-羥基肉桂酸等4種代謝物質(zhì)。

圖8 差異代謝物KEGG 富集通路氣泡圖Fig.8 Bubble diagram of differential metabolite KEGG enrichment pathway

3 結(jié)論

A、B 和C 三個不同等級普洱熟茶的感官審評結(jié)果可得B 的品質(zhì)在三個等級中最優(yōu)；A 的原料等級最高，導(dǎo)致發(fā)酵程度較低，品質(zhì)受影響。代謝物差異分析可得：三個試樣經(jīng)廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)鑒定，共檢測到1 073 種物質(zhì)，已確定1 048 種代謝物，采用VIP≥1、p＜0.05 且Fold Change≥2 或≤0.5 作為最終差異物篩選的條件，結(jié)果篩選鑒定出A 相對于B、A 相對于C和B 相對于C 三個組間差異代謝物共238 個；共含有12 個標(biāo)志性代謝物，其中鳥苷3',5'-環(huán)一磷酸、去氧苦地膽苦素、黃獨(dú)素B、黃獨(dú)素D、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、沒食子酸甲酯、3-沒食子?；鼘幩帷翰杷?、(-)-沒食子酸兒茶素酯、表兒茶素沒食子酸酯等這些標(biāo)志性差異代謝物的相對定量與等級之間呈正相關(guān)，隨等級的降低是顯著減少的，而D-麥芽糖的相對定量卻是與等級之間呈負(fù)相關(guān)，隨等級的降低而顯著增加；238個差異代謝物中共篩選出18個氨基酸及其衍生物、18 個生物堿、19 個黃酮及類黃酮和12 個兒茶素及其衍生物，這幾類物質(zhì)相對總量的變化趨勢都隨等級降低而減少；在所有物質(zhì)的相對定量分析中除了氨基酸Levodopa（左旋多巴）、生物堿Tombozine（妥包嗪）和黃酮及類黃酮Isorhamnetin（異鼠李素）這三個物質(zhì)是隨著等級的降低而顯著增加，其余大部分物質(zhì)是隨著等級的降低而顯著減少；代謝產(chǎn)物主要分布在15 條代謝途徑中，其中苯丙氨酸代謝是相關(guān)性較強(qiáng)的通路，包括L-苯丙氨酸、2-苯乙胺、2-苯乙酰胺和4-羥基肉桂酸等4 種代謝物質(zhì)?？傊?，同種原料的不同等級普洱熟茶之間代謝物在組成上有所不同，并且隨著茶葉等級的降低，各類代謝物所占的相對定量也存在著差異，說明機(jī)采機(jī)制曬青茶的不同分級處理對后續(xù)普洱茶代謝物形成具有重要影響。