吳欣園，朱晨陽，薛永常

（大連工業(yè)大學生物工程學院，遼寧大連 116034）

放線菌是諸多天然生物活性物質(zhì)的重要來源，目前已從放線菌中發(fā)現(xiàn)了10 000 多種生物活性化合物[1]，具有廣泛實際用途和巨大經(jīng)濟價值。海洋放線菌尤其是鏈霉菌具有陸地微生物所不具備的適應性[2,3]，能在高鹽、高壓、低溫和寡營養(yǎng)等條件下產(chǎn)生具有特殊化學結構的次級代謝產(chǎn)物[4,5]，其大都是通過非核糖體肽合成酶（Non-Ribosomal Peptide Synthetase，NRPS）和聚酮合酶途徑產(chǎn)生[6]。NRRS 是一種多功能大型合成酶，由執(zhí)行不同功能的結構域組成的模塊按特定順序排列而成[7-10]（圖 1），NRPS 體系除了腺苷化（Adenylation，A）結構域、肽基載體蛋白（Peptidyl Carrier Protein Domain，PCP）、縮合（Condensation，C）結構域等三個必需的核心結構域外，還有差向異構（Epimerization，E）結構域、硫酯酶（Thioesterase，TE）等修飾性結構域[11]，共同完成非核糖多肽（Non-Ribosomal Peptide，NRP）的生物合成及組裝。在細菌、藍藻和真菌中NRPs 具有抗真菌、抗病毒、抗腫瘤和免疫抑制劑等非常重要的藥理活性[12-14]，廣泛應用于醫(yī)藥領域。

圖1 NRPS 模塊組成及合成機制[10]Fig.1 Module composition and synthetic mechanism of NRPS

E 結構域作為NRPS 組成模塊中常見的修飾性結構域，能將連接在PCP 結構域上的L-氨基酸（L-Amino Acid，L-AA）立體異構化為D-氨基酸（D-Amino Acid，D-AA），摻入到正在延伸的NRP 上，從而增加了NRP組成的多樣性[15]。由E 結構域催化引入的D-AAs 不僅影響產(chǎn)物肽的最終構象以及下游加工單元模塊（如硫酯酶結構域）的接受性[16]，還在確保延伸模塊的正常工作方面發(fā)揮重要作用[17]。在增加NRP 功能和結構多樣性的同時還降低其蛋白水解敏感性，提高了NRP 的抗癌抑菌活性[18]。目前，在E 結構域異構化機制及其晶體結構已有所研究，Stachelhaus 等[19]研究短桿菌素S合成酶GrsA E 結構域的突變時發(fā)現(xiàn)753His 和892Glu 影響異構化活性。而Samel 等[16]解析了酪氨酸合成酶的E結構域晶體結構，發(fā)現(xiàn)822Glu 可能作為酸堿催化劑起作用，743His 則是用來穩(wěn)定異構化過程中產(chǎn)生的瞬時烯醇中間體。在GrsA 的PCP-E 雙結構域中，753His 的咪唑側鏈與磷酸泛酰巰基乙胺基（4′-Phosphopantetheinyl，Ppant）的硫原子相連[20]。Kim 等[21]則在研究GrsA 的E結構域催化機制發(fā)現(xiàn)，只有753His 能與氯乙烯基甘氨酸形成穩(wěn)定的酶探針加合物，進一步證實了His 在異構化過程中的重要地位。隨著對NRPS 高級結構研究的深入，各結構域間的相互作用機制受到廣泛關注。Chen等[20]研究GrsA 的PCP-E 雙結構域時首次提出了PCP與E 結構域之間是通過613Arg/788Asp、614Arg/785Glu 兩個鹽橋提供的靜電相互作用發(fā)生結合的。由于E 結構域與上下游結構域的供體位置相互作用以及其底物識別和催化機理尚不透徹，E 結構域與PCP 結構域的具體作用還需進一步剖析。而對E 結構域的分子機理和生物學作用的研究，對揭示NRPS 模塊間的通信機制、NRPS 的結構域操縱和重排以及新藥的研發(fā)都有重要意義。本研究通過從實驗室保存的具有完整NRPS 基因簇的海洋鏈霉菌基因組DNA 中擴增E結構域基因，并進行生物信息學分析，以期對隨后深入研究其結構與功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本文鏈霉菌Streptomycessp.X66 是由實驗室保藏菌株[22]，大腸埃希菌（Escherichia coli）DH5α、BL21（DE3），表達載體pET-32a(+)均為實驗室保存。pMDTM19-T 載體購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB 液體培養(yǎng)基、LB 固體培養(yǎng)基、高氏一號固體培養(yǎng)基配置參考文獻[23]。

1.1.3 試劑與儀器

細菌基因組DNA 提取試劑盒、柱式DNA 膠回收試劑盒，生工生物工程（上海）有限公司；FastPure 質(zhì)粒提取試劑盒、DNA Marker DL2000，南京諾唯贊生物科技有限公司；QuickCutTMEcoRⅠ（15 U/μL）、QuickCutTMHind Ⅲ（15 U/μL）、PrimeSTAR?Max DNA Polymerase，寶生物工程（大連）有限公司；DNA MarkerⅣ，天根生化科技（北京）有限公司；PCR Thermal Cycler Dice TP610，日本TaKaRa。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計

參考GenBank 數(shù)據(jù)庫中Streptomyces albidoflavusstrain W68（登錄號：CP064783.1）NRPS 中E 結構域基因序列，使用Primer Premier 5.0 軟件設計特異性引物。同時在引物的5′端添加EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ酶切位點，所設計引物為：

E-F：5′-CGGAATTCATGCTGCGCGCCGTCTAC-3′

E-R：5′-CCAAGCTTACTGAGCGCGGGAGTAGGAC-3′

由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.2.2 E 結構域基因克隆及鑒定

以Streptomycessp.X66 基因組DNA 為模板，E-F和E-R為特異引物進行PCR擴增。PCR擴增體系為20 μL：ddH2O 8.5 μL、E-F（10 μmol/L）及E-R（10 μmol/L）各0.5 μL，PrimeSTAR?Max Premix 10 μL，基因組DNA 0.5 μL。1wt%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，回收目的片段與pMDTM19-T載體連接，并轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。陽性重組質(zhì)粒經(jīng)特異引物PCR、雙酶切及測序鑒定。

1.2.3 E 結構域基因生物信息學分析

利用NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫Nucleotide Blast 對測序結果進行比對；ORF Finder對該擴增序列進行翻譯，獲得其擬編碼的氨基酸序列；使用ExPASy ProtParam[24]和Protscale[25]對擬編碼的氨基酸序列的理化性質(zhì)及親/疏水性分析；采用TMHMM 2.0 Server[26]、SignalP 6.0 Server[27]在線工具對蛋白的跨膜結構域、信號肽進行預測；采用SOPMA[28]和SWISS-MODEL[29]預測其二級結構以及三級結構模型；NCBI 數(shù)據(jù)庫中的CDD 工具預測該蛋白的保守區(qū)域；Protein Blast 搜索E 結構域的同源蛋白，選取相似性＞85%的蛋白利用DNAMAN 軟件進行氨基酸多重序列比對分析；利用MEGA X[30]軟件基于鄰接法分析E結構域蛋白和其他物種E結構域蛋白的系統(tǒng)發(fā)生關系。

1.2.4 E 結構域蛋白的異源表達

利用QuickCutTMEcoR Ⅰ和QuickCutTMHind Ⅲ對pET-32a(+)及構建的重組質(zhì)粒pMDTM19-T-E進行雙酶切，回收目的片段，連接并轉入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞。分別培養(yǎng)只含pET-32a(+)單克隆菌及含有重組子pET-32a(+)-E單克隆菌落，待OD600為0.6 時，加入IPTG 使反應終濃度達到0.5 mmol/L，16 ℃誘導12 h 后，進行SDS-PAGE 分析目的基因的表達。

2 結果與分析

2.1 E 結構域基因的克隆

以Streptomycessp.X66 基因組DNA 為模板，E-F和E-R 為特異引物擴增目的基因片段。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖2），在1 100 bp 左右有單一清晰擴增條帶，與預期的E 結構域基因片段大小基本一致。

圖2 E 結構域基因擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of E domain gene fragment

回收目的片段與pMDTM19-T 載體連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，選取陽性菌落提取質(zhì)粒。電泳發(fā)現(xiàn)能夠在3 500 bp 左右出現(xiàn)了一條清晰明亮條帶（圖3），這與預期的質(zhì)粒大小一致。

圖3 質(zhì)粒DNA 電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of recombinant plasmid

以重組質(zhì)粒DNA 為模板進行特異性擴增（圖4），擴增的條帶大小在1 100 bp 左右，與目的條帶的大小相符，說明該重組質(zhì)粒含有目的片段。將該重組質(zhì)粒命名為pMDTM19-T-E。

圖4 質(zhì)粒DNA 中擴增E 結構域基因電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of E domain gene amplified from recombinant plasmid DNA

用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ雙酶切重組質(zhì)粒（圖5），在3 000 bp 左右與1 100 bp 左右各得到一條清晰條帶，符合預期的結果，證明目的基因成功插入T-載體中。將重組質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

圖5 重組質(zhì)粒雙酶切電泳圖Fig.5 Recombinant plasmid cut by Hind III and EcoR I

測序結果得知，該插入片段為1 099 bp。Blast 序列比對表明其與Yao 等[31]公布的Streptomyces albidoflavusstrain W68 的E 結構域基因序列相似度達99%以上（圖6），證明擴增的基因片段為E 結構域基因序列。

2.2 E 結構域基因生物信息學分析

通過ProtParam 工具對該擴增序列編碼的氨基酸進行分析，該E 結構域基因共擬編碼366 個氨基酸，分子式為C1752H2738N510O523S3，理論等電點為5.69，不穩(wěn)定指數(shù)為32.68，平均親水系數(shù)為-0.15。該E 結構域蛋白的等電點小于7，不穩(wěn)定指數(shù)小于40 且平均親水系數(shù)為負值，推測該蛋白可能是一個酸性親水穩(wěn)定蛋白。

蛋白質(zhì)的親疏水性決定了它在水中的可溶解性，高度可溶的蛋白質(zhì)一般都是親水性的部分裸露在最外面，而疏水性氨基酸在內(nèi)部。利用Protscale 軟件，選用默認Kyte & Doolittle 計算方法分析該蛋白的親疏水性（圖7），發(fā)現(xiàn)在E 結構域蛋白序列中，在第143位氨基酸處存在最小值-2.25，此處親水性最強，疏水區(qū)在第204 位氨基酸處有最大值2.33，親水區(qū)域比疏水區(qū)域稍多一些，整體呈現(xiàn)親水性，預測該蛋白為可溶性蛋白，這也與ProtParam 中的分析結果相吻合。

圖7 E 結構域蛋白親水性/疏水性預測Fig.7 Prediction of hydrophobicity/hydrophilicity of E domain protein

跨膜結構域多為強疏水性氨基酸組成，根據(jù)氨基酸親疏水性結果推測，擬翻譯的蛋白不具備跨膜結構。為進一步驗證該猜想，利用TMHMM 軟件預測E結構域蛋白跨膜結構域（圖8），跨膜信號沒有波動，編碼產(chǎn)物中不存在跨膜螺旋結構，故該蛋白為非跨膜類蛋白質(zhì)。

圖8 E 結構域蛋白跨膜結構域預測Fig.8 Transmembrane domain prediction of E domain protein

信號肽通常用于指導蛋白質(zhì)的跨膜轉移或定位，運用SignalP 預測該蛋白信號肽（圖9），結果顯示該蛋白不具備信號肽。據(jù)此猜測可能是因為其不是分泌蛋白或者異構化反應中不涉及蛋白質(zhì)的轉移，所以也不會存在跨膜結構。這一結果與E結構域基因擬表達蛋白的跨膜結構預測結果相符合。

圖9 E 結構域蛋白的信號肽預測Fig.9 Signal peptide prediction of E domain protein

應用SOPM 軟件對該蛋白的二級結構進行預測（圖10）。該蛋白的二級結構由41.69%的α-螺旋、17.44%的延伸鏈、3.81%的β轉角和37.06%無規(guī)則卷曲組成。其中以穩(wěn)定的α-螺旋結構為主，說明E 結構域基因擬表達蛋白的二級結構較為穩(wěn)定，這也與ProtParam 中的理化性質(zhì)結果相吻合。以酪氨酸合成酶B 第三個模塊的差向異構化結構域TycB3(E)的晶體結構為模板構建E 結構域蛋白的三維結構，運用SWISS-MODEL 進一步分析其三級結構（圖11），發(fā)現(xiàn)序列相似性為0.37，這與Samel 等[16]和Chen 等[20]的結果基本一致，左右兩個與氯霉素乙酰轉移酶結構類似的亞域構成E 結構域的主體部分，活性位點位于兩個亞域的交界處，整體均呈“V”字型結構。該蛋白結構整體以α-螺旋為主，還包含少量的無規(guī)卷曲和延伸鏈，符合二級結構的預測結果。

圖10 E 結構域蛋白二級結構預測Fig.10 Prediction of the secondary structure of E domain protein

圖11 E 結構域蛋白三級結構預測Fig.11 The tertiary structure prediction of E domain protein

通過CDD 工具預測了E 結構域的保守區(qū)域（圖12），可以看出該序列中含有E 結構域催化的特有結構域，屬于C 結構域超家族成員，該超家族還包括環(huán)化結構域，雙重E/C 結構域，因此可以判定克隆的目的基因片段屬于E 結構域基因。

圖12 E 結構域蛋白保守結構域分析Fig.12 Domain analysis of E domain protein

用NCBI Blast 檢索工具比對E 結構域基因擬編碼的氨基酸序列，選取數(shù)據(jù)庫中相似性較高的9 個蛋白質(zhì)序列，使用DNAMAN 進行多重序列比對分析（圖13），發(fā)現(xiàn)該E 結構域的氨基酸序列與同屬其他物種的相似度較高，氨基酸序列較為保守，且含有一段E 結構域保守基序HHxxxD。

圖13 氨基酸多序列比對Fig.13 Alignment of the predicted amino acid sequences

MEGA X 構建的E 結構域蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖14）顯示該E 結構域蛋白質(zhì)序列與Streptomyces albidoflavus的NRPS 處于同一分支，同源性達到95%，親緣關系較近；與Streptomyces scopuliridisRB72的E結構域蛋白序列同源性較低，親緣關系相對較遠。

圖14 E 結構域蛋白進化樹分析Fig.14 Phylogenetic tree of E domain protein

2.3 E 結構域基因的異源表達

選取含 pET-32a(+)的單菌落及構建成功的pET-32a(+)-E陽性表達質(zhì)粒的單菌落進行低溫誘導培養(yǎng)，樣品處理后用SDS-PAGE 進行檢測，結果如圖15。

圖15 E 結構域基因擬表達蛋白SDS-PAGE 分析Fig.15 SDS-PAGE analysis of E domain gene expression

作為對照的pET-32a(+)質(zhì)粒對誘導物IPTG添加與否對其表達沒有影響。而含有pET-32a(+)-E的菌株在未加入IPTG 時，沒有目的蛋白的表達；在加入IPTG低溫誘導12 h 后，在55 ku 左右出現(xiàn)明顯的條帶，這與預測的融合蛋白大小相近，說明E結構域基因在大腸桿菌BL21（DE3）中能夠表達。

3 結論

本研究從海洋鏈霉菌Streptomycessp.X66 的基因組中擴增獲得1 099 bp 的E結構域基因序列，其編碼366 個氨基酸，生物信息學分析發(fā)現(xiàn)它具有差向異構結構域特有的保守基序HHxxxD，理論等電點為5.69，不穩(wěn)定指數(shù)為32.68，故該基因擬翻譯的蛋白為酸性穩(wěn)定的非分泌型蛋白質(zhì)。平均親水系數(shù)為-0.15，結合其親疏水性預測結果來看，該蛋白為親水性蛋白，不存在信號肽和跨膜結構域；其二級結構和三級結構顯示主要以α-螺旋和無規(guī)則卷曲結構為主，與已報道的酪氨酸合成酶B（PDB ID：6TA8）的E 結構域晶體結構具有高度相似性。同源比對和系統(tǒng)發(fā)育進化樹發(fā)現(xiàn)，在鏈霉菌屬中E 結構域基因編碼的氨基酸序列相似性較高，能看出E 結構域基因在不同種屬內(nèi)具有極高的保守性，這也對應了E 結構域蛋白保守的立體異構功能。在0.5 mmol/L 的IPTG 誘導下，目的基因能表達得到大小為55 ku 左右的融合蛋白，這為深入開展E 結構域蛋白的功能研究提供參考。