劉悅，楊慧文，林榆子，潘靜華，廖程娟，潘育方

（廣東藥科大學藥學院，廣東廣州 510006）

2 型糖尿?。═ype 2 Diabetes Mellitus，T2DM）屬于慢性代謝紊亂疾病，患者因肝臟糖脂代謝受損，從而導致胰島素抵抗和血糖升高[1]。最新流行病學調查數(shù)據(jù)顯示[2]，截至2020年我國的2 型糖尿病患病率已高達11.2%，患病人數(shù)位居世界第一。為了應對糖尿病，全球每年的投入超過8270 億美元，其中中國政府每年投入近250 億美元，占醫(yī)療總支出的13%，可見我國糖尿病防治工作仍面臨巨大挑戰(zhàn)。天然植物多糖是由10 個以上單糖分子通過糖苷鍵連接而成的天然高分子聚合物[3]，參與生物體各項生命活動，來源廣泛、低毒、副作用小，越來越多的研究表明，天然植物多糖具有良好的降糖效果，探究其在防治糖尿病方面的應用已成為熱點。

白簕（Acanthopanax trifoliatus(L.) Merr）為五加科五加屬攀援狀灌木，民間以“簕菜”而著名。簕菜是人們日常生活中喜愛吃的野生蔬菜和營養(yǎng)保健食品，其作為蔬菜用于食療有著悠久的歷史。目前恩平簕菜已被評為“國家農(nóng)產(chǎn)品地理標志產(chǎn)品”。本課題組在對白簕粗多糖進行分離純化后，得到均一組分白簕中性多糖ATP1-1，其重均相對分子質量Mw為2,310，分布系數(shù)D為1.02，主要由葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖組成，摩爾比為5.52:0.63:0.62:0.56[4]。前期研究發(fā)現(xiàn)，ATP1-1 具有降糖功效，是一種潛在的降糖保健食品。然而由于較大的分子量和良好的水溶性，天然活性多糖大多口服生物利用度較差[5,6]，ATP1-1 也具有類似的特點，因此通過腸道相關靶點發(fā)揮降糖作用可能是ATP1-1 改善糖尿病的機制之一。腸道上的α-葡萄糖苷酶是治療2 型糖尿病的一個重要靶點，其活性增加可加速碳水化合物在腸道內的分解，使腸道對糖的吸收加快，最終引起餐后血糖升高[7,8]。小腸刷狀緣上皮細胞上的二糖酶-蔗糖酶、麥芽糖酶皆屬于α-葡萄糖苷酶，研究表明[9-11]，植物多糖多具有較強的二糖酶抑制活性，其可通過抑制該酶使碳水化合物的消化延遲，進而導致小腸分泌細胞碳水化合物濃度增加，小腸分泌細胞中富含胰高血糖素樣肽-1（GLP-1），碳水化合物的濃度增加可通過滲透作用進一步刺激GLP-1 的分泌，從而促進胰島素生成和降低胰高血糖素分泌[12,13]。基于以上，本研究擬探討ATP1-1 對2型糖尿病小鼠腸黏膜上二糖酶的影響，并對腸道上GLP-1 的表達進行測定，考察ATP1-1 是否通過影響腸道二糖酶進而對機體血糖產(chǎn)生多方面的調節(jié)作用，為白簕多糖在開發(fā)保健食品方面的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設備

超低溫冰箱，中科美菱低溫科技有限公司；5418R低溫高速離心機，德國Eppendorf 公司；FA1004 分析天平，上海右一儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，北京精科華瑞儀器有限公司；Thermo Scientific Mulitskan Sky 全波長酶標儀，賽默飛（中國）有限公司；JXFSTPRP-24 全自動樣品快速研磨儀，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；Nano-100 微量分光光度計，杭州奧盛儀器有限公司；C1000TMThermal cycle PCR、C1000TouchTMThermal cycle 熒光定量PCR 儀，美國Bio-Rad 公司。

1.1.2 藥物與試劑

白簕采購于廣東省恩平市，經(jīng)廣東藥科大學劉基柱副教授鑒定為五加科植物白簕（Acanthopanax trifoliatus(L.) Merr.），標本保存于廣東藥科大學中藥學院標本館。白簕中性多糖ATP1-1 具體提取方法見文獻[4]。

鏈脲佐菌素，美國Sigma 公司；檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 值4.5，vigonob）；阿卡波糖，上海麥克林生化科技有限公司；葡萄糖、蔗糖，廣東光華科技股份有限公司；麥芽糖，天津市大茂化學試劑廠；蔗糖酶、麥芽糖酶活性測定試劑盒、葡萄糖測定試劑盒、蛋白測定試劑盒，南京建成生物有限公司；磷酸鉀緩沖液，北京雷根生物技術有限公司；血糖試紙、血糖儀（安穩(wěn)型），長沙三諾生物傳感技術股份有限公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒、SYBR Green Pro Taq HS 預混型qPCR 試劑盒，武漢艾瑞科生物科技有限公司。

1.1.3 動物及飼料

SPF 級C57BL/6 雄性小鼠購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心，（18.0±2.0）g，實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK（粵）2018-0002。所有動物均飼養(yǎng)于廣東藥科大學實驗動物中心，實驗動物使用許可證編號：SYXK（粵）2017-0125。所有方案均通過廣東藥科大學實驗動物中心倫理委員會批準。

基礎飼料購自廣東省廣州市廣東藥科大學動物實驗中心。高脂飼料脂肪質量分數(shù)為33.8%，由北京博愛港生物技術有限公司制備。所用配方在文獻[14]的基礎上進行調整（質量分數(shù)）：基礎飼料58.5%、蔗糖15%、豬油10%、酪蛋白10%、奶粉5%、膽固醇1%、膽酸鈉0.05%。

1.2 方法

1.2.1 模型制備

按文獻[15]所述方法采用高脂飼料聯(lián)合一次大劑量注射鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）誘導2 型糖尿病小鼠模型。選取60 只C57BL/6 雄性小鼠，SPF環(huán)境普通飼料適應性喂養(yǎng)1 周后，按體重隨機分為正常組（n=10）和造模組（n=50）。正常組飼喂普通飼料，造模組飼喂高脂飼料。4 周后，小鼠禁食不禁水過夜，造模組腹腔注射STZ（130 mg/kg，pH 值為4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液避光冰浴配制，現(xiàn)配現(xiàn)用），于注射后第7 天、第10 天將小鼠禁食6 h，測量其空腹血糖值（FBG），以FBG≥16.7 mmoL/L 篩選成模小鼠。

1.2.2 給藥治療

將成模小鼠按血糖隨機均分為四組：模型組、二甲雙胍組（185 mg/(kg·d)）、ATP1-1 高劑量組（80 mg/(kg·d)）、ATP1-1 低劑量組（40 mg/(kg·d)），另設正常組，給藥8 周，模型組與正常組灌胃等量的生理鹽水。實驗期間每7 d 測量并記錄小鼠體重、飲食飲水及空腹血糖。給藥期間所有成模小鼠均持續(xù)以高脂飼料喂養(yǎng)。

1.2.3 口服葡萄糖、蔗糖、麥芽糖耐量試驗

1.2.3.1 口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）

于給藥第8 周，小鼠禁食不禁水6 h，測定所有小鼠空腹血糖值作為0 min血糖值，隨后灌胃給予2.0 g/kg葡萄糖，測定15、30、60、90、150 min 的血糖值，并計算血糖-時間曲線下面積（AUC）評價糖耐量：

式中：

A、B、C、D、E、F——分別代表0、15、30、60、90、150 min 的血糖值。

1.2.3.2 口服蔗糖耐量試驗（OSTT）

于給藥第8 周，小鼠隔夜禁食不禁水12 h，測定所有小鼠空腹血糖值作為0 min 血糖值，隨后各組小鼠灌胃給藥，并于30 min 后給予4.0 g/kg 蔗糖溶液，測定30、60、90、120、150、180 min 的血糖值，并計算血糖-時間曲線下面積AUC評價糖耐量：

式中：

A、B、C、D、E、F、G——分別代表0、30、60、90、120、150、180 min 的血糖值。

1.2.3.3 口服麥芽糖耐量試驗（OMTT）

于給藥第8 周，小鼠隔夜禁食不禁水12 h，測定所有小鼠空腹血糖值作為0 min 血糖值，隨后各組小鼠灌胃給藥，并于30 min 后給予3.0 g/kg 麥芽糖溶液，測定30、60、90、120、180 min 的血糖值，并計算血糖-時間曲線下面積AUC評價糖耐量：

式中：

A、B、C、D、E、F——分別代表0、30、60、90、120、180 min 的血糖值。

1.2.4 ATP1-1 對蔗糖酶、麥芽糖酶活性的體內抑制作用

于給藥治療結束后，取小鼠的十二指腸、空腸、回腸各2 cm，生理鹽水沖洗內容物并進行稱重。沿中線縱向剪開各腸段，載玻片輕輕刮取腸黏膜，隨后用預冷的生理鹽水（m:V=1:9）沖洗至1.5 mL 離心管中，研磨儀-30 ℃，60 Hz，60 s，連續(xù)勻漿2 次。勻漿混懸液4 ℃，4 000 r/min，離心10 min，吸取上清。用Bradford 蛋白試劑盒測定上清液蛋白含量，并根據(jù)二糖酶活性試劑盒測定各腸段蔗糖酶、麥芽糖酶的活性情況。以在37 ℃ pH 值為6.0 的條件下，每毫克蛋白組織每分鐘水解1 nmol蔗糖或麥芽糖定義為1個酶活力單位。

1.2.5 ATP1-1 對回腸上SI、GLP-1 表達的影響

取小鼠回腸測定蔗糖酶-異麥芽糖酶復合物（Sucrase-Isomaltase，SI）和GLP-1 的mRNA 表達，采用Trizol 試劑法提取總RNA，利用微量分光光度計檢測樣本核酸的OD 值，根據(jù)PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒合成cDNA，反應條件為：42 ℃，2 min。運用SYBR 法測定各基因表達情況，實時熒光定量PCR（qRT-PCR）反應條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40 個循環(huán)。以β-actin 為內參基因，引物序列見表1。各目的基因的相對表達量采用2-??Ct法測定。

表1 引物序列Table 1 Sequences of the primers

1.2.6 ATP1-1 對蔗糖酶、麥芽糖酶活性的體外抑制作用

試驗參照文獻[16]并稍加修改，取健康C57BL/6 小鼠十二指腸，加入10 倍預冷的磷酸鉀緩沖液，研磨儀-30 ℃，60 Hz，60 s，連續(xù)勻漿3 次。勻漿混懸液4 ℃，2 500 r/min，離心15 min，吸取上清液作為酶溶液。

10 mL 試管中加入緩沖液、各濃度白簕中性多糖溶液（10 000、7 000、5 000、4 000、3 000、2 000、1 000、400、200、50、10、4 μg/mL）或阿卡波糖溶液（400、300、200、100、50、25、10 μg/mL）、蔗糖56 mmol/L 或麥芽糖7 mmol/L 各500 μL，37 ℃水浴孵育5 min，添加500 μL 酶液，在37 ℃水浴下反應45 min，最后，沸水浴5 min 進行滅酶。以底物水解生成葡萄糖的量反映蔗糖酶和麥芽糖酶的活性。通過不同濃度ATP1-1 對蔗糖酶或麥芽糖酶的活性抑制率計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。抑制率計算公式為：

式中：

H——抑制率，%；

A1——樣品組吸光度；

A2——樣品對照組吸光度；

A0——空白組吸光度；

A3——陰性對照組吸光度。

以阿卡波糖代替白簕中性多糖作為陽性對照。樣品組：樣品+底物+酶液；樣品對照組：樣品+底物+緩沖液；空白組：緩沖液+底物+酶液；陰性對照組：緩沖液+底物+緩沖。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 和Graphpad prism 6.0 進行統(tǒng)計分析和作表作圖，數(shù)據(jù)處理后表示為平均值±標準差（X±SD）。兩組數(shù)據(jù)采用Dunnet-t 進行比較，組間多組數(shù)據(jù)采用LSD 法進行多重比較。

2 結果與討論

2.1 ATP1-1 對糖尿病小鼠體重、飲食飲水的影響

“三多一少”癥狀是觀察糖尿病最直觀的指標。如表2所示，與正常組小鼠相比，造模成功的小鼠體重下降了14.70%，飲食量、飲水量分別增加了18.89%、224.55%，具有明顯的糖尿病多飲、多食、體重減輕癥狀。給藥8 周后，各給藥組小鼠與模型組小鼠相比，體重明顯上升（p＜0.05），飲食飲水量顯著下降（p＜0.01），且ATP1-1 高、低劑量組與二甲雙胍組相比各指標均無顯著性差異（p＞0.05），其中各給藥組對小鼠飲水量的改善最為明顯，與模型組相比分別下降了40.66%、34.15%、37.58%。宿世震等[17]在研究南瓜多糖對2 型糖尿病小鼠糖脂代謝的影響中發(fā)現(xiàn)，造模后糖尿病小鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿、體重減輕的現(xiàn)象，且在給予南瓜多糖治療后，以上癥狀均得到明顯改善，這與本研究的結果相似，說明ATP1-1 可使糖尿病小鼠的體重及飲食飲水量趨向于正常小鼠。

表2 ATP1-1 對糖尿病小鼠的體重、飲食飲水的影響Table 2 Effects of ATP1-1 on body weight,diet and water intake in diabetic mice

2.2 ATP1-1 對糖尿病小鼠空腹血糖的影響

連續(xù)8 周監(jiān)測各組小鼠血糖變化情況，如圖1所示，與正常組相比，造模后各組小鼠空腹血糖值均明顯升高，表現(xiàn)為高血糖。給藥治療8 周后，模型組血糖為23.65 mmol/L，與模型組相比，各給藥組血糖均明顯下降，二甲雙胍效果最優(yōu)，下降了40.94%，ATP1-1高、低劑量組血糖濃度分別下降了27.06%、19.96%（p＜0.01）。正常組始終維持在5.73 mmol/L，給藥治療后雖未能達到正常水平，但有明顯的改善效果。與化學藥物相比，植物多糖[18]療效好、毒副作用小、不良反應少，其在2 型糖尿病治療方面應用的研究日漸增多，如沙蒿籽多糖、羊棲菜多糖、靈芝多糖、黃秋葵多糖、太子參多糖等[19-23]，本實驗結果表明白簕中性多糖ATP1-1 也可以有效降低2 型糖尿病小鼠空腹血糖值，具有開發(fā)價值。

圖1 ATP1-1 對糖尿病小鼠空腹血糖的影響Fig.1 Effects of ATP1-1 on FBG in diabetic mice

2.3 ATP1-1 對小鼠糖耐量的調節(jié)作用

為了測定ATP1-1 對葡萄糖、蔗糖及麥芽糖耐受的影響，對各組小鼠進行了口服葡萄糖、蔗糖及麥芽糖耐量實驗。如圖2所示，在OGTT 試驗中，口服給予葡萄糖15 min 后各組小鼠血糖達到峰值。30 min 后二甲雙胍組與ATP1-1 高劑量組血糖開始回落，1 h 后各給藥組血糖值明顯下降。計算AUC 可知，模型組AUC 約為正常組的3.08 倍（p＜0.01），給藥治療后，與模型組相比各組小鼠AUC 均明顯降低（p＜0.01），且ATP1-1 高、低劑量組結果與二甲雙胍組相比均無明顯差異（p＞0.05），二者相比模型組，AUC 分別降低了17.67%、9.50%。葡萄糖耐量可反應機體對葡萄糖的耐受能力，葡萄糖耐量異常提示胰島素敏感性降低和β細胞功能受損，此為2 型糖尿病發(fā)病的病理生理學基礎上的關鍵決定因素[24]。AUC 作為反映血糖的一種指標，其比單點的血糖值更能全面地分析血糖波動的時間和程度，該值越小，表明糖耐量改善程度越高，機體血糖恢復能力強[25]。本實驗結果提示ATP1-1 可改善2 型糖尿病小鼠葡萄糖耐量，且在該實驗條件下，效果與玉米須多糖（20.05%）[26]、南瓜多糖（15.07%～27.97%）[17]等類似。

圖2 各組小鼠葡萄糖耐量水平Fig.2 Oral glucose tolerance of different group mice

圖3、圖4分別為OSTT、OMTT 試驗結果，口服給予蔗糖或麥芽糖30 min 后，各組小鼠血糖值達到峰值，其后給藥組均以大于模型組的幅度下降，AUC均明顯降低（p＜0.05），尤其對蔗糖糖耐量效果最為明顯（p＜0.01）。高、低劑量ATP1-1 對蔗糖耐量實驗的AUC 與模型組相比分別下降了16.19%、12.11%。2 型糖尿病小鼠的蔗糖糖耐量增高，意味著機體對高糖飲食中蔗糖的吸收調節(jié)能力增強，從而可抑制高糖飲食引起的循環(huán)血糖增高[27]；糖尿病小鼠的麥芽糖耐量提高則意味著機體對麥芽糖的耐受力增加，可減緩麥芽糖的消化和吸收，改善胰島素抵抗[28]。蔗糖、麥芽糖消化吸收下降可降低葡萄糖入血從而降低血糖，ATP1-1 可通過加快餐后血糖下降速率改善蔗糖與麥芽糖耐受，且呈劑量依賴性，該作用往往與減緩機體對二糖的消化，延遲吸收從而調節(jié)腸道上的葡萄糖攝取有關。

圖3 各組小鼠蔗糖耐量水平Fig.3 Oral sugar tolerance of different group mice

圖4 各組小鼠麥芽糖耐量水平Fig.4 Oral maltose tolerance of different group mice

2.4 ATP1-1 對T2DM 小鼠腸道二糖酶活性的影響

從表3可知，糖尿病小鼠各腸段的蔗糖酶活性、麥芽糖酶活性均明顯高于正常組（p＜0.05），給藥治療8 周后，ATP1-1 高、低劑量組各腸段的蔗糖酶、麥芽糖酶活性被顯著抑制（p＜0.05）。其中，高劑量ATP1-1 對十二指腸、空腸、回腸的蔗糖酶抑制率分別為48.29%、75.09%、31.41%；對麥芽糖酶抑制率分別為26.23%、18.34%、34.18%。ATP1-1 對蔗糖酶的活性抑制作用在空腸上最為明顯（p＜0.01），對麥芽糖酶的活性抑制作用在回腸上最為明顯（p＜0.01），且回腸上高、低劑量治療后其二糖酶活性與正常組相比差異無統(tǒng)計學意義（p＞0.05）。

表3 ATP1-1 對小鼠腸黏膜蔗糖酶、麥芽糖酶活性的影響Table 3 Effects of ATP1-1 on the activities of invertase and maltase in mouse intestinal mucosa

α-葡萄糖苷酶位于小腸刷狀緣膜上皮細胞，是水解蔗糖、麥芽糖等雙糖的關鍵酶，是眾多經(jīng)典糖尿病治療藥物的作用靶點，在糖尿病的治療中起著重要的作用[29]。糖尿病患者中α-糖苷酶活性與正常人相比會異常升高，抑制腸黏膜刷狀緣α-糖苷酶活性，可減緩寡糖、雙糖水解為單糖的速度，減緩單糖吸收入血，從而降低血糖[8]。蔗糖酶、麥芽糖酶均屬于α-葡萄糖苷酶，顧舒靜等[30]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷對大鼠十二指腸、空腸和回腸的蔗糖抑制率分別為47.2%、14.4%和34.8%，對麥芽糖酶沒有抑制作用；本試驗結果表明，ATP1-1 對蔗糖酶、麥芽糖酶活性均有抑制作用，有助于延緩碳水化合物分解成單糖，抑制腸道對糖的吸收，維持血糖在正常水平。

2.5 ATP1-1 對回腸上GLP-1、SI 表達的影響

如圖5、圖6所示，糖尿病小鼠SI mRNA 表達量明顯高于正常小鼠（p＜0.01），GLP-1 mRNA 表達量明顯低于正常組（p＜0.01）。給藥8 周后，與模型組相比，ATP1-1 高、低劑量組SI 表達分別降低了64.90%、24.87%（p＜0.01）；高劑量組GLP-1 表達增加了156.46%（p＜0.01），低劑量組有上升趨勢但無統(tǒng)計學意義。SI 存在于小腸絨毛刷狀緣的黏膜表面，伴隨著小腸上皮的成熟逐漸形成，包含了約60%～80%的麥芽糖酶活性、所有的蔗糖酶活性以及大部分的異麥芽糖酶活性[31]。GLP-1 可刺激胰島素分泌、減少胰高血糖素的分泌、增強β細胞的增殖，抑制胃排空和增加飽腹感來減少對食物的攝入[32]。糖尿病小鼠中SI的表達增加，刺激了腸黏膜細胞膜的轉運系統(tǒng)，導致小腸內單糖轉運升高[33]。同時，抑制α-葡萄糖苷酶活性可導致回腸遠端碳水化合物濃度增加，通過滲透作用，進一步刺激小腸腸促胰島素GLP-1 的分泌增加[10]。結合本實驗結果可見，ATP1-1 可通過下調SI表達，上調GLP-1 表達，從而影響腸道糖的吸收和機體糖代謝。

圖5 各組小鼠回腸組織SI mRNA 表達水平Fig.5 The mRNA expression levels of SI in ileum tissues of different group mice

圖6 各組小鼠回腸組織GLP-1 mRNA 表達水平Fig.6 The mRNA expression levels of GLP-1 in ileum tissues of different group mice

2.6 ATP1-1 對蔗糖酶、麥芽糖酶活性的體外抑制能力

α-葡萄糖苷酶抑制劑可通過延遲碳水化合物的腸道吸收，從而抑制餐后血糖水平的升高[34]。為了進一步驗證ATP1-1 是否能直接抑制小鼠腸二糖酶，分別以蔗糖、麥芽糖作為底物，研究了ATP1-1 對小鼠十二指腸勻漿中蔗糖酶、麥芽糖酶活性抑制的影響。所有數(shù)據(jù)平行測定3 次，以阿卡波糖為陽性對照，結果如圖7、圖8所示，根據(jù)抑制率-濃度曲線計算半數(shù)抑制濃度IC50，阿卡波糖和ATP1-1 對麥芽糖酶的IC50值分別為42.61 μg/mL、265.00 μg/mL，對蔗糖酶的IC50值分別為2.16 μg/mL、3 381.00 μg/mL，提示ATP1-1 對此兩種酶均有直接抑制作用，但抑制能力弱于阿卡波糖。ATP1-1 抑制麥芽糖酶的IC50遠小于蔗糖酶，但當ATP1-1 濃度為10 mg/mL 時，其對蔗糖酶的抑制率可達46.80%，遠高于對麥芽糖酶的抑制率15.92%，結果與體內活性抑制率相似，且植物多糖如綠茶多糖[35]對蔗糖酶的抑制率小于40%，番石榴葉多糖[36]對蔗糖酶、麥芽糖酶的抑制率僅為29.3%、20.6%，可見ATP1-1 不僅與上述多糖相似可直接抑制小鼠腸二糖酶活性，還具有較好的抑制效果。

圖7 ATP1-1 及阿卡波糖對蔗糖酶的抑制率曲線Fig.7 Inhibition effects of ATP1-1 and acarbose on sucrase

圖8 ATP1-1 及阿卡波糖對麥芽糖酶的抑制率曲線Fig.8 Inhibition effects of ATP1-1 and acarbose on maltase

3 結論

白簕廣泛分布于中國中部和南部，具有豐富的營養(yǎng)價值，在民間流行以簕菜作為保健蔬菜，是開發(fā)保健性食品的理想原料。本研究表明，白簕中性多糖ATP1-1 可抑制2 型糖尿病小鼠腸道二糖酶活性、下調SI表達，進一步影響GLP-1的表達及腸道上的糖吸收，從而改善2 型糖尿病小鼠的高血糖狀態(tài)。