熊雪梅，李可文，陳苗苗，文藝，馮文祎，鄭秋生*

（1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000）（2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150030）（3.北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023）

頭孢曲松鈉屬于第三代頭孢菌素類藥物，能夠抑制細(xì)胞壁的合成發(fā)揮抗菌作用[1]，對(duì)革蘭氏(+)菌、革蘭氏(-)菌都能發(fā)揮殺菌作用，在臨床上可以用于治療金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、屎腸球菌、大腸埃希菌、產(chǎn)氣腸桿菌等敏感菌導(dǎo)致的各種感染[2]。長期使用頭孢曲松鈉會(huì)引起腸道菌群失調(diào)、腸道組織病變及脾臟指數(shù)降低等[3]。研究結(jié)果表明，廣譜抗生素可以影響腸道中大約三分之一的細(xì)菌類群的豐度，導(dǎo)致分類豐富度、多樣性和均勻性迅速而顯著地發(fā)生變化[4]。腸道菌群平衡是維持人體微生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定的重要條件，與機(jī)體的免疫、代謝等密切相關(guān)[5]，其組成和豐度變化可能會(huì)造成與腸道菌群改變相關(guān)的疾病，如代謝綜合征、過敏、Ι 型糖尿病、癌癥等[6,7]。

通過補(bǔ)充益生菌能夠?qū)股卦斐傻哪c道微生物紊亂起到一定的調(diào)節(jié)作用[8]。蔣豐嶺等[9]研究證明益生菌復(fù)合制劑的使用可通過增加雙歧桿菌、減少某些致病菌的方式一定程度上改善頭孢曲松導(dǎo)致的菌群紊亂。陳大衛(wèi)等[10]研究證實(shí)混合乳酸菌能夠混合乳酸菌菌懸液及其發(fā)酵乳可以改善由鹽酸林可霉素誘導(dǎo)的小鼠腸道菌群紊亂。根據(jù)2002年世界衛(wèi)生組織的定義，益生菌是給予適量的時(shí)候能夠?qū)λ拗鹘】涤蟹e極影響的活的微生物[11]。在臨床實(shí)踐中，最常用的益生菌是乳酸菌屬、雙歧桿菌屬、鏈球菌屬以及酵母菌屬，而人類正常的胃腸道菌群主要有乳桿菌屬、雙歧桿菌屬等[12]。益生菌調(diào)節(jié)和重建宿主腸道微生物群的功效已得到公認(rèn)，如加強(qiáng)腸道屏障、抑制腸道黏膜炎癥等[13]。一些報(bào)道證實(shí)了益生菌在各種疾中的臨床有效性，包括急性胃腸道感染和炎癥性腸病[14,15]，以及調(diào)節(jié)抗生素導(dǎo)致的腸道內(nèi)菌群失調(diào)來增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。乳雙歧桿菌 V9（Bifidobacterium lactisV9）是從蒙古族健康兒童腸道中分離得到的一株益生菌，是動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種，對(duì)人工胃液，腸液以及膽鹽有良好的耐受性，具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、抗炎、防止腹瀉、增強(qiáng)免疫的功能[16,17]。

因此，本實(shí)驗(yàn)通過給予小鼠頭孢曲松鈉建立腸道菌群失調(diào)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，乳雙歧桿菌V9 灌胃，同時(shí)采用高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定小鼠糞便菌群以分析灌胃前后的腸道菌群差異，HE 染色法觀察小腸組織病理學(xué)改變，免疫組化法檢測(cè)IL-1β、IL-6 和TNF-α表達(dá)，從而探討益生菌乳雙歧桿菌V9 對(duì)小鼠腸道菌群失衡的恢復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60 只健康SPF 清潔級(jí)BALB/c 雄性小鼠，體質(zhì)量18～20 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（京）2017-0038。所有小鼠飼養(yǎng)于北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院保健食品功能檢測(cè)中心SPF 級(jí)動(dòng)物室，溫度（20±2）℃，相對(duì)濕度46%～60%。本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案符合北京聯(lián)合大學(xué)倫理委員會(huì)審核標(biāo)準(zhǔn)（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)意見書編號(hào)2021-5）。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

頭孢曲松鈉，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乳雙歧桿菌V9，北京科拓恒通生物技術(shù)股份有限公司；伊紅美藍(lán)（EMB）瓊脂培養(yǎng)基、疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷（BEA）瓊脂培養(yǎng)基、雙歧桿菌（BS）瓊脂培養(yǎng)基、乳酸桿菌選擇性（LBS）瓊脂培養(yǎng)基、產(chǎn)氣莢膜梭菌選擇性培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；IL-2、IL-6、IL-1β、TNF-α，武漢華美生物工程有限公司；MDA、SOD、GSH、GSH-PX 測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所有限公司；Qiagen Gel Extraction Kit 試劑盒，QIAgen 公司；Gene JETTMGel Extraction Kit 試劑盒，Thermo Fisher scientific 公司；TruSeq PCR-Free DNA 建庫試劑盒，Illumina 公司；HE 染液，武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備

TECAN 酶標(biāo)儀，廣州深華公司；電子分析天平，Sartorius 公司；高壓滅菌鍋，Zealway 公司；低溫超高速臺(tái)式離心機(jī)，Eppendorf 公司；漩渦振蕩器，IKA 公司；紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；Qubit@2.0 熒光儀，Thermo Fisher scientific 公司；Donatello 脫水機(jī)、Giotto 染色機(jī)，DANJIER 公司；RM2016 病理切片機(jī)，上海徠卡儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物及樣品處理

將60 只雄性BALB/c 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后隨機(jī)抽12 只作為對(duì)照組，其余48 只小鼠用200 mg/mL 頭孢曲松鈉（0.2 mL/d）連續(xù)灌胃5 d，然后隨機(jī)分為4 組，每組12 只，分別為模型組、低（乳雙歧桿菌1.3×108CFU/kg）、中（乳雙歧桿菌2.6×108CFU/kg）、高（乳雙歧桿菌8.0×108CFU/kg）劑量組，每只灌胃0.2 mL/d，連續(xù)灌胃23 d。在此期間每天測(cè)量小鼠體重和記錄攝食情況。灌胃益生菌23 d 結(jié)束后，將小鼠脫頸處死，腹主動(dòng)脈取適量血，4 ℃靜置后離心，取上清，分裝，保存于-80℃冰箱備用。取全部小鼠的心、肝、脾、肺、腎、空腸及小腸組織，部分用多聚甲醛固定，剩余部分保存于-80 ℃冰箱備用。計(jì)算臟器系數(shù)及小腸重量和長度。

1.2.2 血清細(xì)胞因子含量測(cè)定

取出保存于-80 ℃冰箱中的血清，按照ELISA 試劑盒說明書要求測(cè)定血清中IL-1β、IL-6、TNF-α及IL-2 含量。

1.2.3 小腸及肝臟抗氧化水平測(cè)定

取出保存于-80 ℃冰箱中的小腸及肝臟組織，稱取約0.2 g，加入預(yù)冷的PBS 緩沖液，勻漿，制備成10%的組織勻漿液，離心，取上清，按照試劑盒說明書測(cè)定小腸及肝臟組織中SOD、MDA、GSH 及GSH-Px 含量。

1.2.4 小腸組織病理學(xué)觀察

多聚甲醛固定空腸組織24 h 后，石蠟包埋切片，HE染色，脫水封片，在顯微鏡下觀察空腸組織形態(tài)學(xué)改變。

1.2.5 糞便活菌計(jì)數(shù)

在無菌條件下分別收集灌胃益生菌第0、23 天的小鼠糞便，與稀釋液充分混合，依10倍系列稀釋至10-8，分別接種于選擇性培養(yǎng)基上，采用平板活菌計(jì)數(shù)法計(jì)算菌落數(shù)，計(jì)算每克糞便中的活菌數(shù)（CFU/g）。腸桿菌：接種在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃有氧培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)發(fā)酵乳糖、G-桿菌的所有菌落。腸球菌：接種在疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃有氧培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)有明顯褐色圈、G+球菌的所有菌落。乳桿菌：接種在LBS 瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃有氧培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)過氧化氫酶試驗(yàn)陰性、G+無芽孢桿菌的所有菌落。雙歧桿菌：接種在雙歧桿菌瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)過氧化氫酶試驗(yàn)陰性、G+無芽孢多形態(tài)桿菌的所有菌落。產(chǎn)氣莢膜梭菌：接種在胰眎-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸（TSC）培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)所有在紫外光下有熒光的黑色菌落。

1.2.6 糞便DNA 提取及高通量測(cè)序

連續(xù)灌胃23 d 后，無菌條件下收集各組小鼠糞便置于干燥的滅菌試管中，-40 ℃凍存?zhèn)溆?，采用CTAB 法提取樣品的基因組DNA 并用2wt%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)其濃度和純度，然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和測(cè)序。16S rDNA V3-V4 區(qū)域擴(kuò)增，上游引物為：5’-CCTAYGGGR BGCASCAG-3’，下游引物為3’-GGACTACNNGGGT ATCTAAT-5’，使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，通過Illumina NovaSeq6000 對(duì)該文庫進(jìn)行雙末端測(cè)序，將數(shù)據(jù)結(jié)果處理過濾后，對(duì)樣品進(jìn)行物種多樣性和菌群構(gòu)成進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（±s）表示，并使用SPSS Statistics 21.0和Origin 2021統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間的比較采用單因素方差分析。p＜0.05 即認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠的攝食與體重

如圖1a 和圖1b 所示，與對(duì)照組相比，抗生素干預(yù)后各組小鼠的體重有輕微的降低，停止抗生素干預(yù)后體重逐漸恢復(fù)正常，且在正常范圍內(nèi)逐漸增加，而灌胃后各組小鼠攝食量隨著天數(shù)逐漸增加，與對(duì)照組小鼠趨勢(shì)一致，表明益生菌干預(yù)對(duì)小鼠體重及攝食均無影響。

圖1 乳雙歧桿菌V9 對(duì)小鼠體重（a）和（b）攝食影響Fig.1 Effect of Bifidobacterium lactis V9 on body weight (a) and food intake (b) level of mice

2.2 乳雙歧桿菌V9 對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響

如圖2b 所示，與模型組相比，中劑量組小鼠肝系數(shù)有一定差異（p＜0.05）。說明頭孢曲松鈉對(duì)小鼠肝系數(shù)有一定影響。由圖2a、2c、2d、2e、2f 可知，與模型組相比，各劑量組小鼠的心、肝臟、脾臟、肺、腎、胸腺系數(shù)不存在顯著性差異，說明乳歧桿菌V9 對(duì)小鼠臟器系數(shù)基本無影響。

圖2 乳雙歧桿菌V9 對(duì)小鼠心（a）、肝（b）、脾（c）、肺（d）、腎（e）和胸腺（f）臟器系數(shù)的影響Fig.2 Effects of Bifidobacterium lactis V9 on organ coefficients of heart (a),liver (b),spleen (c),lung (d),kidney (e) and thymus (f) in mice

2.3 乳雙歧桿菌V9 對(duì)小鼠小腸重量及長度的影響

如圖3a、3b 所示，對(duì)照組、模型組和各劑量組小鼠小腸的重量和長度沒有顯著性差異，說明灌胃頭孢曲松鈉和乳雙歧桿菌V9 對(duì)小鼠小腸重量和長度沒有影響。

圖3 乳雙歧桿菌V9 對(duì)小鼠小腸重量（a）和長度（b）影響Fig.3 Effect of Bifidobacterium lactis V9 on weight (a) and length (b) of mice

2.4 乳雙歧桿菌V9 對(duì)小鼠血清中細(xì)胞因子的影響

腸道菌群失調(diào)會(huì)導(dǎo)致多種促炎因子的產(chǎn)生，如IL-1β、IL-6、TNF-α及IL-2，它們與炎癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，參與介導(dǎo)炎癥細(xì)胞的激活。在正常機(jī)體中含量非常低，但是當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)水平會(huì)有明顯升高[8]。

如表1可知，與對(duì)照組比較，模型組IL-1β、IL-6、TNF-α及IL-2 的含量極顯著升高（p＜0.01），分別增加48.22、7.35、7.37 及18.48 pg/mL；與模型組相比，低劑量組血清細(xì)胞因子IL-6、TNF-α含量極顯著降低（p＜0.01），IL-1β含量顯著降低（p＜0.05），IL-2 的含量有降低的趨勢(shì)，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）；中劑量組以及高劑量組血清細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α及IL-2 的含量均極顯著降低（p＜0.01），分別降低31.73、17.04、12.57 及31.71 pg/mL。以上結(jié)果表明，抗生素頭孢曲松鈉引起促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α及IL-2 水平升高，使得機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，而乳雙歧桿菌V9 可顯著降低血清中炎癥因子水平，使炎癥反應(yīng)得到有效改善。這與Azad 等[18]的研究一致，益生菌能夠降低機(jī)體炎癥因子水平。

表1 小鼠血清中各細(xì)胞因子的含量Table 1 The content of each cytokine in mouse serum (pg/mL, n=12)

2.5 乳雙歧桿菌V9 對(duì)小鼠小腸及肝臟組織抗氧化的影響

大量研究的表明，腸道菌群失調(diào)大多和體內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基有關(guān)。在正常情況下，動(dòng)物機(jī)體內(nèi)都存在自由基清除系統(tǒng)，SOD、GSH 和GSH-Px 酶可以清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基，MDA 是脂類物質(zhì)氧化應(yīng)激的終產(chǎn)物，可以反映機(jī)體損傷程度。當(dāng)機(jī)體受到刺激損傷時(shí)，SOD、GSH 和GSH-Px 酶活性顯著降低，MDA 水平顯著升高[19]，因此聯(lián)合測(cè)定這4 個(gè)指標(biāo)可衡量機(jī)體的抗氧化能力。

如表2所示，在肝臟中，與對(duì)照組比較，模型組GSH 及GSH-Px 的含量極顯著降低（p＜0.01），SOD含量顯著降低（p＜0.05），MDA 含量顯著升高（p＜0.05）。與模型組相比，中、高劑量組SOD、GSH 及GSH-Px的含量均極顯著升高（p＜0.01），在小腸中分別增加122.34 U/mg prot、13.93 mg GSH/mg prot 及13.29 U/mg prot，在肝臟中分別增加90.9 U/mg prot、4.97 mg GSH/mg prot 及13.21 U/mg prot；高劑量組MDA 含量極顯著降低（p＜0.01），小腸中降低1.31 nmol/mg prot，肝臟中降低1.0 nmol/mg prot。以上結(jié)果表明，頭孢曲松鈉可抑制機(jī)體抗氧化物質(zhì)SOD、MDA、GSH 及GSH-Px 產(chǎn)生，而乳雙歧桿菌V9 可顯著恢復(fù)抗氧化物質(zhì)在體內(nèi)的水平，說明乳雙歧桿菌V9可增強(qiáng)小鼠機(jī)體清除自由基的能力，提高機(jī)體抗活性氧損傷的能力。

表2 乳雙歧桿菌V9 對(duì)小鼠小腸組織SOD、MDA、GSH 和GSH-Px的測(cè)定Table 2 Determination of SOD,MDA,GSH and GSH-PX in small intestine of mice by Bifidobacterium lactis V9

2.6 乳雙歧桿菌V9 對(duì)小鼠小腸組織病理學(xué)改變的影響

如圖4所示，對(duì)照組、抗生素干預(yù)后模型組以及益生菌灌胃后各劑量組小腸病理切片圖可知，各組小腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，絨毛細(xì)長且密集，柱狀細(xì)胞和上皮細(xì)胞，未見明顯炎癥。說明短時(shí)間頭孢曲松鈉灌胃對(duì)小腸絨毛沒有影響，各劑量乳雙歧桿菌V9 灌胃對(duì)小腸組織形態(tài)也無明顯影響。

圖4 小腸蘇木精和伊紅染色光鏡圖Fig.4 Light micrograph of the small intestine stained with hematoxylin and eosin

2.7 乳雙歧桿菌V9 對(duì)小鼠腸道菌群的影響

2.7.1 糞便活菌數(shù)分析

由表3可知，用抗生素造成腸道菌群紊亂后，與對(duì)照組相比，模型組腸桿菌、腸球菌、乳桿菌、雙歧桿菌數(shù)量顯著降低（p＜0.01），分別減少2.68、2.93、2.84、17.07 lg cfu/g。產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量無顯著差異（p＞0.05）。灌胃益生菌后，與模型組比較，高劑量組腸桿菌的數(shù)量顯著降低（p＜0.01），降低0.34 lg cfu/g。乳桿菌以及雙歧桿菌的數(shù)量顯著增加（p＜0.01），分別增加0.40 lg cfu/g 和0.26 lg cfu/g。各劑量組腸球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量均無顯著性差異（p＞0.05）。以上結(jié)果表明乳雙歧桿菌V9 可以抑制腸桿菌生長，顯著促進(jìn)乳桿菌和乳雙歧桿菌生長，對(duì)腸球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌無明顯影響。說明乳雙歧桿菌V9 具有促進(jìn)有益菌的生長，抑制有害菌的生長，對(duì)腸道菌群有一定的調(diào)節(jié)作用。

表3 0 d 和23 d 糞便腸道菌群計(jì)數(shù)Table 3 Count of fecal intestinal flora at 0 d and 23 d (lg cfu/g)

2.7.2 Alpha 多樣性分析

Alpha 多樣性主要關(guān)注局域均勻生境下的物種數(shù)目，可以衡量物種分布的多樣性和均勻度，并直接反映測(cè)序的深度和數(shù)量，包括Observed-species、ACE、Chao1、Shannon 和Simpson 等多樣性指數(shù)[20]。ACE 指數(shù)和Chao1 指數(shù)可以評(píng)估樣本的菌群豐度，Shannon指數(shù)和Simpson 指數(shù)評(píng)估樣本菌群多樣性[21]。

由表4可知，與對(duì)照組相比，短時(shí)間灌胃頭孢曲松鈉使小鼠腸道菌群的豐度和多樣性異常升高（p＞0.05），而益生菌乳雙歧桿菌V9 灌胃可顯著改善此現(xiàn)象（p＜0.01）。

表4 各組腸道菌群α 多樣性Table 4 Alpha diversity of intestinal microbial flora among groups (±s)

表4 各組腸道菌群α 多樣性Table 4 Alpha diversity of intestinal microbial flora among groups (±s)

組別 OTU Shannon Simpson Chao1 ACE Good-Coverage對(duì)照組 683.83 5.93 0.94 860.79 873.98 0.99模型組 1053.83 6.60 0.97 1400.68 1394.50 0.99低劑量組 454.83** 5.35** 0.91* 528.20** 538.58** 1.00**中劑量組 521.33** 5.60* 0.93 650.11** 654.11** 1.00**高劑量組 526.67** 5.48** 0.93* 668.04** 667.53** 1.00**

2.7.3 菌群構(gòu)成分析

正常的健康腸道菌群主要由厭氧菌組成，主要由擬桿菌門（Bacteroidota）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobiota）組成，其中前4 個(gè)菌門占腸道總菌群的98%。腸道菌群按照功能可以分為有益菌、有害菌和條件致病菌，主要集中在厚壁菌門和擬桿菌門，其他細(xì)胞只占很小的比例[22]。

由表5和圖5可知，在門水平上，各組樣本主要優(yōu)勢(shì)菌門為擬桿菌門和厚壁菌門，它們?cè)谀c道中通常是占主導(dǎo)地位的[23]，它們能夠參與能量的供應(yīng)及腸道中多糖的發(fā)酵[24]?？股靥幚砗螅Ｐ徒M小鼠腸道菌群中unidentified_Bacteria 和酸桿菌門Acidobacteriota豐度顯著增加（p＜0.05），分別增加2.23%、0.66%。乳雙歧桿菌V9 處理后，Acidobacteriota、脫鐵桿菌門Deferribacteres 和Others 豐度顯著減少（p<0.01），分別減少0.83%、0.01%、2.77%，Proteobacteria 和Firmicutes豐度顯著減少（p＜0.05），分別減少3.14%、9.28%。門水平結(jié)果說明乳雙歧桿菌 V9 可以抑制Acidobacteriota 的生長。

表5 門水平各組間腸道菌群分析Table 5 Analysis of intestinal microbial flora among groups in phylum level (±s)

表5 門水平各組間腸道菌群分析Table 5 Analysis of intestinal microbial flora among groups in phylum level (±s)

相對(duì)豐度/%菌群 對(duì)照組 模型組 低劑量組 中劑量組 高劑量組Bacteroidota 50.78±18.40 52.72±5.03 44.29±9.18 56.80±14.60 61.24±12.23 Firmicutes 33.88±13.45 27.63±3.96 35.24±10.83 23.87±10.87 18.35±7.71*Verrucomicrobiota 6.08±11.90 2.49±3.88 12.40±14.44 11.44±12.21 6.77±10.37 Actinobacteriota 0.94±0.53 2.52±2.23 17.29±0.59 1.44±0.73 6.02±6.49 Proteobacteria 2.68±1.47 3.47±2.08 1.00±1.64 0.33±0.39* 1.53±2.79 unidentified_Bacteria 1.87±0.90 4.10±1.35# 2.63±2.13 2.08±1.00* 2.02±1.54*Desulfobacterota 0.54±0.72 0.524±0.41 0.425±0.20 1.09±1.61 0.54±0.63 Campylobacterota 0.34±0.21 0.69±0.55 0.86±0.86 1.01±0.67 1.10±1.35 Acidobacteriota 0.19±0.27 0.85±0.43# 0.04±0.08** 0.08±0.17** 0.03±0.06**Deferribacteres 0.01±0.01 0.01±471.42 0.00±0.00** 0.02±0.02 0.17±0.34 others 2.68±1.08 5.01±2.14 1.38±0.60** 1.84±1.01* 2.24±1.56*

圖5 灌胃前后小鼠腸道菌群在門水平上的豐度變化Fig.5 Changes in the abundance of intestinal microbiota at phylum level before and after gavage

由表6和圖6知，在屬水平各組主要優(yōu)勢(shì)菌有艾克曼菌屬（Akkermansia）、杜波希氏菌屬（Dubosiella）、毛螺旋菌（Lachnospiraceae_NK4A136_group）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）。艾克曼氏菌具有抗炎，維持機(jī)體腸道健康和調(diào)節(jié)代謝紊亂的作用[25,26]。杜波希氏菌屬與大多數(shù)差異脂類代謝產(chǎn)物顯著相關(guān)[27]。乳酸桿菌屬能夠改善腸道屏障功能，抑制腸道病原菌的繁殖[28]?？股靥幚砗?，模型組擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）數(shù)量極顯著增加（p＜0.01），增加5.07%；而乳雙歧桿菌V9 灌胃后，Bifidobacterium數(shù)量顯著增加（p＜0.05），增加0.68%，理研菌（Alistipes）數(shù)量極顯著增加（p＜0.01），增加2.91%，Alloprevotella數(shù)量顯著減少（p＜0.05），減少3.86%，Others數(shù)量極顯著減少（p＜0.01），減少17.07%。上述結(jié)果說明乳雙歧桿菌V9 可以促進(jìn)腸道內(nèi)Alistipes增殖。Dziarski 等[29]研究表明，Alistipes finegoldii可以減緩腸道炎癥，降低炎癥性腸病的發(fā)病率。此外，有資料研究證明[30]，Alistipes屬數(shù)量減少可能引發(fā)Clostridium difficile感染。

表6 屬水平各組間腸道菌群分析Table 6 Analysis of intestinal microbial flora among groups in genus level (±s)

表6 屬水平各組間腸道菌群分析Table 6 Analysis of intestinal microbial flora among groups in genus level (±s)

相對(duì)豐度/%菌群 對(duì)照組 模型組 低劑量組 中劑量組 高劑量組Akkermansia 6.04±11.92 2.43±3.89 12.40±14.43 11.43±12.21 6.77±10.37 Dubosiella 3.87±4.60 0.34±0.27 12.25±13.67 5.92±7.77 0.52±0.303 Lachnospiraceae_NK4A136_group 7.30±7.28 5.76±4.97 2.31±1.12 3.50±3.68 3.26±3.15 Lactobacillus 8.03±5.54 6.30±4.49 10.06±6.80 5.09±4.77 5.09±4.77 Bifidobacterium 0.18±0.34 0.04±0.02 0.72±0.51* 0.72±0.73 5.39±6.40 Alloprevotella 0.24±0.07 5.31±2.84## 1.19±0.74* 6.14±6.97 1.45±0.77*Bacteroides 1.00±0.49 1.50±0.76 1.85±0.64 2.21±0.81 4.63±4.70 Alistipes 0.84±0.46 0.66±0.27 6.08±2.68** 3.57±1.80** 1.79±1.65 Prevotellaceae_UCG-001 0.51±0.31 0.84±0.47 0.83±0.45 1.06±0.37 0.88±0.67 Desulfovibrio 0.49±0.71 0.47±0.41 0.42±0.20 1.07±1.60 0.52±0.62 Others 71.48±15.37 76.36±6.95 51.90±10.44** 59.29±13.87* 69.08±11.89

圖6 灌胃前后小鼠腸道菌群在屬水平上的豐度變化Fig.6 Changes in the abundance of intestinal microbiota at genus level before and after gavage

對(duì)各組物種進(jìn)行差異分析，如圖7所示，抗生素灌胃導(dǎo)致模型組有害菌擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）極顯著增加（p＜0.01），丹毒莢膜菌屬（Erysipelatoclostridium）、庫特氏菌屬（Kurthia）顯著增加（p＜0.05），氣味桿菌Odoribacter極顯著降低（p＜0.01）。

圖7 差異物種相對(duì)豐度聚類熱圖Fig.7 Species relative abundance clustering heat map

乳雙歧桿菌V9 灌胃后，低劑量組擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）、Mucispirillum、乳酸桿菌屬、魏斯氏菌（Weissella）、（Prevotellaceae_Ga6A1_group）、Oscillibacter、Enterobacter極顯著降低（p＜0.01），Muribaculum、[Eubacterium]_siraeum_group、Kurthia、[Eubacterium]_xylanophilum_group、Enterococcus顯著降低（p＜0.05），Alidlipes、雙歧桿菌Bifidobacterium極顯著提高（p＜0.01）。Dubosiella顯著提高（p＜0.05）。中劑量組乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、Weissella、（Prevotellaceae_Ga6A1_group）、（Enterobacter）極顯著降低（p＜0.01 ）。Kurthia、[Eubacterium]_xylanophilum_group、Enterococcus、Colidextribacter顯著降低（p＜0.05），Alidlipes極顯著提高（p＜0.01），雙歧桿菌顯著提高（p＜0.05）。高劑量組擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）、乳酸桿菌屬、Weissella、Prevotellaceae_Ga6A1_group、Enterobacter極顯著降低（p＜0.01），Enterococcus顯著降低（p＜0.05）。

根據(jù)上述結(jié)果可知，頭孢曲松鈉處理后，有害菌擬普雷沃菌等致病菌的豐度增加，雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量顯著降低，使得腸道菌群嚴(yán)重失衡。研究資料表明，擬普雷沃菌屬是臨床上較常見的條件致病菌，常引起女性生殖道及口腔感染，與結(jié)締組織的分解有關(guān)，其豐度的增加與有利于腸道健康和代謝內(nèi)毒素的異常產(chǎn)生有關(guān)[31]。乳雙歧桿菌V9 處理后擬普雷沃菌數(shù)量顯著降低，說明乳雙歧桿菌V9 能夠抑制其生長。與表3糞便活菌計(jì)數(shù)結(jié)果一致，乳雙歧桿菌V9 能夠促進(jìn)雙歧桿菌等有益菌的生長，雙歧桿菌、乳酸菌和疣微菌是腸道的重要生理菌群，能夠降低腸道內(nèi)環(huán)境的pH值，抑制有害菌的生長，具有抗氧化及提高機(jī)體免疫力的能力，與肥胖、糖尿病和過敏等各種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，被認(rèn)為是健康腸道的重要標(biāo)志[32-34]。魏斯氏菌能夠引起菌血癥、膿腫、假體關(guān)節(jié)感染和感染性心內(nèi)膜炎[35]。這說明乳雙歧桿菌V9 在一定程度上促進(jìn)了增加有益菌數(shù)量，抑制有害菌生長，從而對(duì)機(jī)體腸道菌群失調(diào)起到調(diào)節(jié)作用。

3 結(jié)論

綜上所述，乳雙歧桿菌V9 的干預(yù)使得頭孢曲松鈉導(dǎo)致的小鼠腸道炎癥得到緩解，抗氧化能力恢復(fù)，以及腸道菌群有益菌雙歧桿菌、疣微菌門豐度增加，并且抑制了有害菌擬普雷沃菌的增長，改善微生物群落。說明乳雙歧桿菌V9 能夠抑制炎癥反應(yīng)以及在一定程度上調(diào)節(jié)腸道菌群。