文培培,高 宇,王曉云,劉益兵,池紅萬

(鄭州市骨科醫(yī)院，河南 鄭州 450052)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)屬于慢性、系統(tǒng)性及免疫性疾病，病理特征是滑膜組織存在慢性炎性增生可導(dǎo)致不可逆的軟骨損傷[1]。全球范圍內(nèi)RA發(fā)病率較高，發(fā)病人群為女性多發(fā)，致殘率可高達(dá)20%，嚴(yán)重威脅患者身心健康[2]。到目前為止，RA的發(fā)病原因尚不清楚，但認(rèn)為與免疫系統(tǒng)、感染等多種復(fù)雜原因相關(guān)。相關(guān)研究表示，滑膜細(xì)胞異常增殖是RA病發(fā)過程的主要原因，因滑膜細(xì)胞存在與腫瘤細(xì)胞相似特性可釋放大量炎性因子致滑膜組織增生肥大并促使VEGF表達(dá)增加血管翳形成進(jìn)一步加重病情[3]。近年相關(guān)研究表示，RA發(fā)生發(fā)展與多種信號通路異常相關(guān)，1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine 1-phosphate,S1P)在RA中異常表達(dá)，可作為細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)信使作用于不同蛋白而發(fā)揮細(xì)胞活性調(diào)節(jié)作用[4]。鞘氨醇激酶1(Sphingosine kinase 1，SphK1)是在哺乳動物中被發(fā)現(xiàn)的鞘氨醇激酶,能夠通過磷酸化Sp生成S1P，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活及增殖[5]。在RA疾病中已經(jīng)證實(shí)SphK1/S1P/S1PR1信號通路表達(dá)激活發(fā)揮促炎作用。

針灸治療RA歷史悠久，針灸治療方法具有多樣性，例如蜂針、溫針與電熱灸等。在RA中溫針具有疏經(jīng)通絡(luò)、散寒利濕等作用，已經(jīng)證實(shí)能夠改善RA疾病并受到醫(yī)學(xué)界廣泛認(rèn)可[6]。豨薟草屬于草本植物，主要生長在我國東北及華北，具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)與清熱解毒等功效，常被用來治療風(fēng)濕麻痹、肢體麻木及中風(fēng)等疾病[7]。目前針灸聯(lián)合中藥成為醫(yī)學(xué)界治療RA的研究熱點(diǎn)，本研究基于此觀察溫針療法聯(lián)合豨薟草對RA大鼠滑膜細(xì)胞活性及SphK1/S1P/S1PR1信號的影響，為RA治療提供新的治療方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)大鼠

SPF級SD雌性大鼠，鼠齡6周，共50只均選自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，體質(zhì)量200～300 g，許可證號：SCXK(浙)2019-000l，濕度為55%，溫度25 ℃，模擬黑白交替無菌飲食2周，定時(shí)清洗、消毒鼠籠，實(shí)驗(yàn)要求符合《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》規(guī)定管理規(guī)定。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照科技部[(2006)398號]《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》文件要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物、試劑與儀器

豨薟草藥材飲片(亳州市仁惠堂中藥材銷售有限公司，批號：190807)，樣品經(jīng)本省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院主任藥師鑒定為菊科植物豨薟草(HerbaSiegesbec-kiae)；試劑：弗氏不完全佐劑(北京伊塔生物科技有限公司，F(xiàn)5506)；SPHK1單抗(卡梅德生物，KMPH5200);S1PR1單抗(艾美捷科技有限公司 ，QrPrEST23593)；ERK1/2抗體(上海雅吉生物科技有限公司 ，s-0022R)；DMEM高糖培養(yǎng)基(上海聯(lián)碩寶為生物科技有限公司，F(xiàn)B8025)；胎牛血清[愛必信(上海)生物科技有限公司]；0.25%胰蛋白酶(上海信裕生物科技有限公司，XY6020)；噻唑藍(lán)MTT試劑(北京索萊寶科技有限公司，M8180-1)，二甲基亞砜(DMSO)(北京德航五洲科技有限公司 ，MB1315T)；0.30 mm×15 mm華佗牌毫針(河南省安邦衛(wèi)材有限公司，00056)；DB022型足趾容積測量儀(北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司，1545125)；蛋白電泳儀(北京六一，DYY-7C)。

1.3 豨薟草提取物的制備

將豨薟草藥材干燥后粉碎，在1 kg的藥物中加入8 L 95%濃度的醫(yī)用酒精過夜，加熱回流2次，采用等體積的80%的醫(yī)用酒精提取藥物殘?jiān)?，?jīng)過濾、濃縮、水浴及蒸干后得到總提取物212 g，0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液稀釋至所需濃度。

1.4 RA模型建立

RA模型建立參考文獻(xiàn)[6]，取2 mg的牛Ⅱ型膠原溶于2 mg的0.5 mol/L乙酸中，4 ℃下靜置24 h溶化，再取相同劑量的弗氏不完全佐劑冰浴下制成乳化劑。大鼠腹腔注射0.3 mL/100 g濃度為10%的戊巴比妥鈉麻醉后，取0.1 mL的上述乳化劑在大鼠足底部位皮下接種，1次/d，連續(xù)21 d。建模后大鼠足部明顯紅腫、體積增大，表明建模成功。

1.5 分組及干預(yù)方法

將50只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為正常組、RA組、溫針組、藥物組及聯(lián)合組，各10只。除正常組外其余大鼠均建立RA大鼠模型。建模成功后，溫針組大鼠進(jìn)行溫針治療：固定大鼠穿自制鼠衣，穴位參考中國針灸學(xué)會實(shí)驗(yàn)針灸研究會制定的“實(shí)驗(yàn)動物針灸穴位圖譜”，穴位包含足三里、腎盂與懸鐘,采用0.30 mm×15 mm的毫針針刺上述部位，深度約為5 mm，強(qiáng)度以大鼠耐受為度，采用香煙型純艾條在距離的2 cm處進(jìn)行懸灸。1次/d，1次5min，連續(xù)治療21 d。藥物組灌胃1.6 g·kg-1的豨薟草提取物，每次灌胃1次，連續(xù)21 d。聯(lián)合組溫針治療后灌胃豨薟草提取物，其余組灌胃同體積的生理鹽水。

1.6 大鼠足部體積檢測

干預(yù)后14 d、18 d及21 d采用排水法檢測各組大鼠足部體積，具體方法：將大鼠足部插入灌滿水的特制量筒中，保持水面與膝關(guān)節(jié)上2 cm持平，從量筒側(cè)口接排出的水，水的體積則為所測大鼠足跖部的體積。每只大鼠每次分別測量3次，取其均值。

1.7 HE染色觀察滑膜組織病理形態(tài)

上述實(shí)驗(yàn)完成后，選用2%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉處死大鼠，取左足跖關(guān)節(jié)組織石蠟包埋，10%的甲醛溶液中，固定過夜，自來水沖洗，浸泡于14%的EDTA溶液中脫鈣，逐層脫水與石蠟包埋后4 μm切片后備用。各組大鼠牙髓組織切片放入37 ℃復(fù)溫15 min，二甲苯脫蠟后按照100%-95%-85%及75%乙醇進(jìn)行逐層脫水，蘇木精染色10 min，鹽酸(1%)處理，伊紅復(fù)染，100%-95%-85%及75%乙醇脫水，封片后觀察組織形態(tài)。

1.8 滑膜細(xì)胞分離提取

提取各組大鼠滑膜組織，去除脂肪及纖維組織，在含有100 KU/L的青霉素及100 mg/L的鏈霉素的D-Hanks液沖洗3次，后剪碎1～3 mm3的小塊，加入濃度為2%的4 mL的Ⅱ型膠原酶DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，將未貼壁的細(xì)胞移至離心管中，按1 500 r/min，離心15 min，棄上清加入0.25%的胰蛋白酶40 mL消化10 min，再次離心，加入D-Hanks液制成單細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.9 MTT法檢測各組滑膜細(xì)胞存活率

6孔板中每孔均加入150 μL滑膜細(xì)胞懸液，數(shù)目5×103，每組設(shè)置6孔，加入MTT(5 g·L-1)，每孔20 μL，遮光條件下加入200 μL的DMSO溶液，輕微搖晃15 min后促使充分溶解后，在24 h、48 h、72 h及96 h時(shí)應(yīng)用波長490 nm檢測吸光度(OD值)。

1.9.1 Hoechst檢測各組滑膜細(xì)胞凋亡率 用24孔板培養(yǎng)各組細(xì)胞，滑膜細(xì)胞數(shù)目分別為1×105，采用40 g/L的多聚甲醛固定0.5 h，采用TrintonX-100透明處理，加入濃度為5 mg/L的Hoechst熒光材料染色，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min，熒光顯微鏡觀察到凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)顆粒熒光，未凋亡呈現(xiàn)低密度熒光，隨機(jī)拍照選擇5個(gè)高倍鏡視野，應(yīng)用ImageJ1.47i軟件計(jì)算平均熒光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，凋亡率=凋亡細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.9.2 免疫印跡檢測各組滑膜細(xì)胞SPHK1、S1PR1及ERK1/2蛋白表達(dá) 各組滑膜細(xì)胞移入孔6板中，細(xì)胞濃度為2.5×104個(gè)mL，PBS沖洗，加入150 μL RIPA的裂解液，12 000 r/min離心15 min后，放入樣孔中，進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。PVDF膜TBS浸泡10 min，反復(fù)PBS沖洗，5 min/次，加入SPHK1(1∶1 000)及S1PR1(1∶1 000)及ERK1/2(1∶1 000)和內(nèi)參GAPDH抗體(1∶2 000)，TBS沖洗3次后，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔(1∶5 000)，雜交沖洗。后將膜浸入ECL工作液，隨后進(jìn)行檢測，獲取圖像。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS23.0軟件對本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各組數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，多組間比較采用方差分析，事后檢驗(yàn)采用Bonferroni法進(jìn)行組間兩兩比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)設(shè)定的水準(zhǔn)為0.05，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠足部體積比較

與正常組比較，RA大鼠治療14 d、18 d及21 d的足部體積均升高(P<0.05)，與RA組比較，溫針組、藥物組及聯(lián)合組大鼠治療14 d、18 d及21 d的足部體積均降低(P<0.05)，與溫針組、藥物組比較，聯(lián)合組大鼠足部體積降低(P<0.05)，其余自制差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠關(guān)節(jié)病理組織形態(tài)比較

正常組大鼠踝關(guān)節(jié)面光滑、滑膜完整、無炎癥浸潤及水腫;RA組大鼠踝關(guān)節(jié)炎性細(xì)胞浸潤嚴(yán)重，滑膜組織增厚，關(guān)節(jié)腔隙狹窄及軟骨破壞;溫針組及藥物組大鼠踝關(guān)節(jié)炎性浸潤減少，滑膜增生降低;與藥物組相比，聯(lián)合組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜厚度未見增厚,炎性細(xì)胞浸潤減少。見圖1。

表1 各組大鼠足部體積比較

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)病理組織形態(tài)比較(200×)

2.3 滑膜細(xì)胞生長

滑膜組織中分離的滑膜細(xì)胞在24 h時(shí)細(xì)胞的分布較為稀疏，呈現(xiàn)細(xì)紡錘形生長，48 h時(shí)細(xì)胞間細(xì)長的突起相連并交織成網(wǎng)狀排列，單層生長，細(xì)胞核明顯，可進(jìn)行傳代。見圖2。

圖2 24 h及48 h滑膜細(xì)胞生長(200×)

2.4 MTT法檢測各組滑膜細(xì)胞存活

MTT結(jié)果顯示：與正常組比較，RA組24 h、48 h、72 h及96 h的滑膜細(xì)胞OD值升高(P<0.05);與RA組比較，溫針組24 h、48 h、72 h及96 h的滑膜細(xì)胞OD值均降低(P<0.05);與溫針組比較，聯(lián)合組細(xì)胞OD值明顯較低(P<0.05);其余組別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

組內(nèi)不同時(shí)間相比，正常組的24 h、48 h、72 h及96 h的滑膜細(xì)胞株存OD值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余組別滑膜細(xì)胞OD值隨著時(shí)間延長而不斷升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組滑膜細(xì)胞24 h、48 h、72 h及96 h細(xì)胞OD值比較

2.5 各組滑膜細(xì)胞凋亡率比較

正常組、RA組、溫針組、藥物組及聯(lián)合組的滑膜細(xì)胞凋亡率分別為(2.54±0.60)%、(2.88±0.55)%、(12.55±1.47)%、(13.03±1.32)%及(20.14±3.05)%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=202.400，P<0.001)。進(jìn)一步兩兩比較，與RA組比較，溫針組滑膜細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);與溫針組、藥物組比較，聯(lián)合組凋亡率升高(P<0.05);其余組別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

2.6 各組滑膜細(xì)胞SPHK1、S1PR1及ERK1/2蛋白水平比較

與正常組比較，RA組SPHK1、S1PR1及ERK1/2蛋白升高(P<0.05);與RA組比較，溫針組SPHK1、S1PR1及ERK1/2蛋白均降低(P<0.05);與溫針組、藥物組比較，聯(lián)合組SPHK1、S1PR1及ERK1/2蛋白更低(P<0.05);其余組別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3、圖4。

圖3 各組大鼠滑膜細(xì)胞凋亡比較(200×)

圖4 各組滑膜細(xì)胞SPHK1、S1PR1及ERK1/2蛋白比較

表3 各組滑膜細(xì)胞SPHK1、S1PR1及ERK1/2蛋白水平比較

3 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種類屬于骨科和風(fēng)濕免疫科的關(guān)節(jié)疾病。研究顯示，患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病程較久的患者會出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)或內(nèi)臟損傷等問題[8]。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎在臨床上普遍具有病程較長、遷延不愈的特點(diǎn)，且目前并未實(shí)現(xiàn)對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎徹底攻克，患者致殘率極高，對患者自身、家庭帶來了沉重的心理負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。對RA的治療臨床以藥物為主，且溫針是我國傳統(tǒng)治療方式之一，經(jīng)絡(luò)與五臟六腑之間關(guān)聯(lián)密切，經(jīng)大量學(xué)者證實(shí)溫針能夠發(fā)揮改善RA疾病[9]。本研究通過將溫針聯(lián)合豨薟草證實(shí)能夠抑制滑膜細(xì)胞活性而發(fā)揮改善作用,主要與抑制SPHK1、S1PR1及ERK1/2活性相關(guān)。

本研究證實(shí)，聯(lián)合組大鼠干預(yù)14 d、18 d及21 d時(shí)的足部體積均降低，HE染色結(jié)果證實(shí)，能夠抑制滑膜組織增厚改善關(guān)節(jié)組織紊亂，說明溫針聯(lián)合豨薟草對RA發(fā)揮抗炎修復(fù)作用。大鼠建立RA模型后經(jīng)過Ⅱ型膠原誘導(dǎo)以及寒冷刺激后，大鼠的踝關(guān)節(jié)組織細(xì)胞層變厚，白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等大量充斥于視野，維持細(xì)胞間的絨毛減少，細(xì)胞間的連續(xù)性減弱，提示細(xì)胞炎性狀態(tài)明顯增加而導(dǎo)致足部體積增加[10]。目前RA的治療西藥有甲氨蝶呤、萘普生等能夠抑制關(guān)節(jié)癥狀，但是西藥毒性作用較大,因而采用中醫(yī)治療成為研究熱點(diǎn)。RA在中國屬于“尪痹”“痹證”等范疇，病因與脾胃虛弱、陽氣不足、衛(wèi)外無力和風(fēng)寒濕火等因素相關(guān)[11]。豨薟草作為我國的傳統(tǒng)中藥，按照現(xiàn)代藥理學(xué)研究具有抗炎鎮(zhèn)痛、改善心腦血管損傷及心血管保護(hù)作用。已經(jīng)被證實(shí)能夠發(fā)揮抗風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰間盤突出等疾病作用。豨薟草能夠降低RA大鼠足部體積，通過作用抑制炎性因子表達(dá)而改善骨關(guān)節(jié)破壞，從而降低大鼠足部體積[12]。RA的產(chǎn)生與邪氣內(nèi)存、脾胃虛弱及氣血不足等相關(guān)，可采用溫針治療，達(dá)到補(bǔ)腎益氣、溫經(jīng)通絡(luò)除濕和標(biāo)本兼治等作用[13]。溫針療法作為我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的經(jīng)典外治法之一，集針刺穴位、溫?zé)岷退幬锎碳さ扔谝惑w，與單純電針療法不同，除具備行氣、疏經(jīng)通絡(luò)作用外，還有溫通經(jīng)脈、祛濕溫寒和去結(jié)鎮(zhèn)痛之功。溫針療法刺激穴位使得經(jīng)氣運(yùn)行、經(jīng)絡(luò)疏通，再借助艾灸的熱力給予溫?zé)嵝源碳?，?jīng)絡(luò)腧穴及溫?zé)嵝?yīng)相結(jié)合，更好達(dá)到溫通血脈、行氣活血止痛的功效，例如《靈樞·刺節(jié)真邪》曰：“脈中之血，凝而留之，弗之火調(diào)，弗能取之。”是指脈中血?dú)饽郎?，無法運(yùn)行周身，只能用火法驅(qū)寒，調(diào)順血脈。溫針針刺能夠發(fā)揮調(diào)節(jié)脾胃、通暢氣機(jī)和通經(jīng)活絡(luò)等作用,溫針針刺腎俞能夠發(fā)揮強(qiáng)腰健骨作用，溫針針刺懸鐘仍是膽經(jīng)之穴,主骨所生病。穴位配合共奏補(bǔ)益功效達(dá)到正勝邪退之目的，改善癥狀[14-15]。

滑膜細(xì)胞增殖在RA發(fā)生發(fā)展中具有關(guān)鍵作用，本研究表明聯(lián)合組大鼠滑膜細(xì)胞增殖降低，說明溫針及豨薟草具有抑制滑膜細(xì)胞活性作用,可能機(jī)制與抑制SPHK1、S1PR1及ERK1/2活性相關(guān)。在RA關(guān)節(jié)損傷后滑膜細(xì)胞可參與多種信號通路及對關(guān)節(jié)軟骨和周圍骨組織的損害，還可分泌多種細(xì)胞炎性因子而形成錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，參與了RA病理生理過程[16]。S1P屬于細(xì)胞內(nèi)部第二信使，能夠發(fā)揮細(xì)胞活性調(diào)節(jié)作用。S1P的主要合成酶類為SphKs，包含SphK1和SphK2，SphK1具有抑制細(xì)胞凋亡及加快其存在作用[17]。在自身病理狀態(tài)下，SphK1可產(chǎn)生大量炎性因子，并可激活ERK1/2作用同時(shí)提高SphK14倍活性而增加滑膜細(xì)胞活性。S1PR1可隨著滑膜細(xì)胞增殖而表達(dá)升高，當(dāng)減少S1PR1表達(dá)可進(jìn)一步抑制S1P下游通路ERK1/2表達(dá)發(fā)揮抑制炎癥作用[18]。通過體外大鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)，RA大鼠中炎癥因子可促進(jìn)ERK1/2表達(dá)進(jìn)一步激活SphK1表達(dá)而增加S1P生成，并當(dāng)采用Erkl/2抑制劑SCH772984后SPHK1、S1PR1及ERK1/2活性均降低，說明調(diào)節(jié)上述信號通路可抑制炎癥表達(dá)同時(shí)可減少滑膜細(xì)胞增殖。豨薟草提取物可通過抑制炎性細(xì)胞浸潤而減少滑膜細(xì)胞增生，表示改善炎癥細(xì)胞因子方式與抑制TRL4激活相關(guān)[19]。本研究結(jié)果證實(shí)，豨薟草可發(fā)揮抗炎作用,能夠恢復(fù)抗炎信號通路活性而顯著抑制SPHK1、S1PR1及ERK1/2表達(dá)，提示其與抑制滑膜細(xì)胞活性相關(guān)。艾葉氣味芳香易燃，發(fā)揮溫經(jīng)通路、行氣活血及驅(qū)寒除濕作用，通過熱感滲透到皮肉筋骨之中，配合針刺療法而增加血流流速及血管擴(kuò)張等作用，能夠加快關(guān)節(jié)新陳代謝。李琳琳[20]研究表示，消痹湯聯(lián)合溫針灸可以提高類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者免疫功能,減輕其疼痛癥狀。本研究證實(shí)溫針能夠抑制SPHK1、S1PR1及ERK1/2表達(dá)而發(fā)揮抗滑膜細(xì)胞活性作用，研究機(jī)制可能在于溫針能夠散寒理氣、通經(jīng)活絡(luò)而發(fā)揮抗炎作用,與抑制ERK1/2激活和抑制SPHK1、S1PR1活性相關(guān)。

本研究受成本限制，未添加更多組別，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能存在不足，后期本課題組會加強(qiáng)和其他相關(guān)研究單位合作，增加樣本量，細(xì)化實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，為RA的臨床治療提供參考依據(jù)。綜上所述,風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠采用溫針療法聯(lián)合豨薟草干預(yù)可抑制滑膜細(xì)胞活性，改善大鼠足部體積，這可能與抑制SphK1/S1P/S1PR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。