方振華，沈振國(guó)，孫倩

（海南職業(yè)技術(shù)學(xué)院熱帶農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院 海口 570216）

豬細(xì)小病毒（porcine parvovirus，PPV）是導(dǎo)致豬繁殖障礙性傳染病豬細(xì)小病毒病的病原，該病以造成母豬流產(chǎn)，特別是初產(chǎn)母豬產(chǎn)木乃伊胎、畸形胎、死胎等為主要臨床癥狀[1-3]。PPV 可增殖于豬的多種傳代細(xì)胞，如豬睪丸（swine testicle，ST）細(xì)胞、豬腎（porcine kidney-15，PK-15）細(xì)胞，同時(shí)造成明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)[4,5]。該病常發(fā)生在種豬生產(chǎn)中，造成養(yǎng)豬業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失，給畜牧業(yè)的健康發(fā)展帶來(lái)嚴(yán)重不利影響。2021 年6 月，海南省某豬場(chǎng)初產(chǎn)母豬發(fā)生流產(chǎn)及死胎現(xiàn)象，豬細(xì)小病毒PCR 檢測(cè)為陽(yáng)性，經(jīng)臨床觀察，結(jié)合病理剖檢變化診斷為豬細(xì)小病毒感染。

1 發(fā)病情況及剖檢變化

2021 年6 月下旬，海南省某豬場(chǎng)初產(chǎn)母豬出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎，無(wú)其他明顯癥狀。經(jīng)產(chǎn)母豬也未出現(xiàn)癥狀。對(duì)死胎進(jìn)行剖檢，可見(jiàn)皮下水腫或充血、肝脾腫大等。根據(jù)臨床表現(xiàn)及剖檢變化，初步懷疑為豬細(xì)小病毒感染。

2 實(shí)驗(yàn)室診斷

2.1 病料處理

流產(chǎn)胎兒的脾臟、腎臟、腸系膜淋巴結(jié)等組織，剪碎后研磨，用生理鹽水進(jìn)行5 倍稀釋，3 次重復(fù)凍融，用5,000r/min 離心15min，再吸取上清液，然后加入雙抗凍存起來(lái)備用。

2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

所用試驗(yàn)引物位于豬細(xì)小病毒（PPV）VP2 基因內(nèi)，預(yù)期擴(kuò)增片段為415bp，上游引物：5'-AATACTTGGGGGAGGGCTTG-3'，下游引物：5'-CTAGGTGCTGCTGGTGTGTA-3'。引物序列送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2.3 所用試劑及儀器

病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒來(lái)自天根生化科技（北京）有限公司；DNA 純化回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖購(gòu)自為Sigma 公司；dNTP、DL2000 DNA Marker 等購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；ExTaq 酶購(gòu)自購(gòu)自北京全式金生物公司；6× DNA 上樣緩沖液（DNA loading buffer，6× ）購(gòu)自Solarbio life Sciences 公司；豬PK-15 細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；胎牛血清為四季青浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM 培養(yǎng)基為Gibco 產(chǎn)品；胰酶消化液購(gòu)自碧云天（Beyotime）生物試劑公司。主要儀器為超凈工作臺(tái)、生物安全柜、離心機(jī)（Thermo Fisher Scientific）、凝膠成像分析儀（Bio-Rad）、PCR 儀（Bio-Rad）、倒置顯微鏡（Olympus/ 奧林巴斯）等。

2.4 病毒DNA 提取

按照病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。在含有20μ L 蛋白酶K 的離心管中加入200μ L 病料上清液，再加入200μ L Carrier RNA 工作液，振蕩15s，56℃孵育15min；加入250μ L 無(wú)水乙醇，振蕩后室溫放置5min；將溶液轉(zhuǎn)移至RNase-Free 吸附柱CR2 后，8,000rpm 離心1min，加入500μ L 緩沖液GD，8,000rpm 離心1min，再加入600μ L 漂洗液PW，靜置2min后，8,000rpm 離心1min；隨后加入500μ L 無(wú)水乙醇，8,000rpm 離心1min；最后將吸附柱放入一個(gè)RNase-Free 離心管中，室溫放置3min，滴加50μ L RNase-Free ddH2O，室溫放置5min 后12,000rpm離心1min，收集DNA 樣品，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 豬細(xì)小病毒VP2 基因的PCR 擴(kuò)增

模板DNA 2μ L，Premix Taq 12.5μ L，上下游引物（20μ mol/L）各1μ L，用滅菌的ddH2O 補(bǔ)至25μ L。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min→94℃變性30s→57℃退火30s→72℃延伸30s，執(zhí)行34 個(gè)循環(huán)，結(jié)束后72℃延伸10min。反應(yīng)完畢，取PCR 產(chǎn)物6μ L，加入1μ L 6× DNA 上樣緩沖液（DNA loading buffer，6× ），經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，使用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照。發(fā)現(xiàn)PCR 擴(kuò)增后獲得1 條415bp 的特異性條帶（圖1）。將PCR 產(chǎn)物應(yīng)用DNA 純化回收試劑盒進(jìn)行回收和純化，純化后的DNA 送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)與豬細(xì)小病毒VP2 基因的同源性為99.5%。以上結(jié)果表明待測(cè)樣品呈現(xiàn)豬細(xì)小病毒陽(yáng)性，再同臨床癥狀和病理變化結(jié)合，診斷該豬場(chǎng)病豬為豬細(xì)小病毒感染。

2.6 病毒分離培養(yǎng)

將上述處理的病料上清液經(jīng)0.22μ m 濾膜過(guò)濾后接種于PK-15細(xì)胞，與此同時(shí)，使用正常細(xì)胞加以對(duì)照，在37℃下吸附1h，加入含2%胎牛血清DMEM 維持液，置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后觀察細(xì)胞病變，并用PCR 對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行豬細(xì)小病毒檢測(cè)。由結(jié)果可知，病料經(jīng)盲傳后，培養(yǎng)96h，PK-15 細(xì)胞出現(xiàn)了零星的細(xì)胞病變（圖2）。將細(xì)胞裂解后，收集培養(yǎng)液進(jìn)行豬細(xì)小病毒檢測(cè)，結(jié)果顯示，所分離病毒為豬細(xì)小病毒。

圖2 接種臨床樣本后，PK-15 細(xì)胞呈現(xiàn)的細(xì)胞病變

3 討論

豬細(xì)小病毒是單股線性DNA 病毒，無(wú)囊膜，基因組全長(zhǎng)為4～6.3kb[6]，引起母豬繁殖障礙，導(dǎo)致流產(chǎn)或死胎等，在全球范圍內(nèi)，豬細(xì)小病毒是造成豬繁殖障礙的主要致病原之一，對(duì)全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[7]。該病毒適應(yīng)力較強(qiáng)，耐熱，在56℃溫度下可存活48h，甚至在70℃下也可存活2h，但80℃經(jīng)過(guò)5min 后該病毒就失去了感染性。此外，該病毒耐受pH 范圍廣，一般在3.0～9.0 的pH 范圍內(nèi)都可保持較高的穩(wěn)定性[8]。當(dāng)健康豬感染豬細(xì)小病毒弱毒株后，機(jī)體自身可產(chǎn)生免疫反應(yīng)，往往不會(huì)使胎盤(pán)感染。但產(chǎn)前母豬具有較高的易感性，特別是初產(chǎn)母豬，其發(fā)病率高于經(jīng)產(chǎn)母豬[9]。

豬細(xì)小病毒與其它引起豬繁殖障礙的病原如豬乙腦病毒、豬瘟病毒、衣原體、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病毒等感染后引起的臨床表現(xiàn)相近[10]，因此，只根據(jù)臨床癥狀常無(wú)法診斷，所以需依靠實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)才能確診。臨床上對(duì)豬細(xì)小病毒常采用免疫學(xué)方法，如血凝抑制試驗(yàn)，在豬感染豬細(xì)小病毒后約1 周左右的時(shí)間里，抗體可維持相對(duì)較長(zhǎng)的時(shí)間，抗體檢查水平顯著提高。血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)，雖然不需要借助其他特殊設(shè)備，但靈敏性相對(duì)較差，操作較為復(fù)雜且繁瑣，結(jié)果判讀也可能受到人為因素影響[11]。乳膠凝集試驗(yàn)也是較為常用的檢測(cè)方法，其特異性較強(qiáng)，并具有敏感性，該法可直接用于抗體檢測(cè)以及豬細(xì)小病毒病的流行病學(xué)調(diào)查，但該法只能進(jìn)行定性診斷，卻不能有效監(jiān)測(cè)豬血清樣本中的抗體滴度。此外，血清中和試驗(yàn)是通過(guò)細(xì)小病毒與待檢血清中的抗體發(fā)生中和反應(yīng)，然后接種細(xì)胞，根據(jù)病變計(jì)算血清的抗體滴度，此法特異性雖較好，但操作過(guò)于繁雜[12]。PCR 反應(yīng)具有特異性強(qiáng)、省時(shí)、操作方便、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，成為豬細(xì)小病毒病診斷的主要方法[13]。豬細(xì)小病毒基因中的VP2 基因是一個(gè)較保守基因，對(duì)豬細(xì)小病毒的診斷有著非常重要的意義[14]。本次診斷以采集的流產(chǎn)和死胎胎兒臟器組織為病料，提取DNA 后，應(yīng)用豬細(xì)小病毒VP2 基因的特異性引物，經(jīng)擴(kuò)增后獲得和預(yù)期一致的目的片段，PCR 產(chǎn)物經(jīng)序列測(cè)定發(fā)現(xiàn)與豬細(xì)小病毒VP2 基因的同源在99.5%以上，由此，可確診為豬細(xì)小病毒感染。

對(duì)于豬細(xì)小病毒的分離培養(yǎng)，目前還是研究該病的主要基礎(chǔ)，接種其特異性的PK-15 細(xì)胞，可收獲滴度較高的病毒[15]。此次實(shí)驗(yàn)室診斷是用無(wú)菌操作采集的死胎和流產(chǎn)的器官組織為病料，無(wú)菌處理后接種于PK-15 細(xì)胞上，出現(xiàn)比較明顯的細(xì)胞病變是在感染96h 時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)PCR 擴(kuò)增，也同樣出現(xiàn)了豬細(xì)胞病毒VP2 基因片段，說(shuō)明成功分離了豬細(xì)小病毒。此診斷結(jié)果反饋給養(yǎng)殖場(chǎng)后，管理人員淘汰了陽(yáng)性經(jīng)產(chǎn)母豬，隔離陽(yáng)性初產(chǎn)母豬，并對(duì)豬場(chǎng)進(jìn)行了徹底消毒，加強(qiáng)了免疫接種等綜合防治措施，取得了較好的效果。