溫舫，趙智宏，鐘志梅,2,3*

(1.內蒙古農業(yè)大學理學院，內蒙古 呼和浩特 010018； 2.內蒙古自治區(qū)土壤質量與養(yǎng)分資源重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010018； 3.農業(yè)生態(tài)安全與綠色發(fā)展自治區(qū)高等學校重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010018)

0 引言

生物機體功能隨著年齡的增長而退化，衰老是各種組織和器官的正常過程，衰老的影響體現(xiàn)在各種行為上，如：壽命、運動活力和生殖能力[1]，也與氧化產物自由基有關。一般情況下，體內的氧化和抗氧化活性保持在穩(wěn)定狀態(tài)，但隨著年齡增長，大量活性氧(ROS)代謝為自由基，導致細胞氧化損傷和衰老[2]。Li等[3]的研究表明，人體可以通過一系列酶系統(tǒng)抵抗衰老的影響，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)，這些酶可以提高抗氧化活性。果蠅作為良好的模式生物，具有繁殖速度快、生長周期短、易于維護和操作、防御系統(tǒng)和衰老基因與人類相似等優(yōu)點[4]。在過去的幾十年里，果蠅已經成為研究人類相關疾病和衰老機制的新興和有價值的模型。通過對果蠅生存時間等測定，研究了果蠅衰老，基于雌性和雄性果蠅之間的差異，雌性果蠅構成了更適合抗衰老研究的生物模型。

甲殼素是一種豐富的自然資源，其在自然界中儲量僅次于纖維素[5]。殼聚糖是甲殼素的脫乙?；a物，是一種可再生的天然堿性多糖，無毒、無副作用，具有良好的生物相容性、抗菌性、抗氧化性、可降解性等優(yōu)異性能，應用前景廣泛[6-8]?；前奉愃幬锞哂锌咕V較廣、性質穩(wěn)定、使用簡便等優(yōu)點[9]。將磺胺類有效基團與殼聚糖反應得到的殼聚糖磺胺類衍生物具有較好的體外抗菌、抗氧化性能[10]，為研究該類殼聚糖衍生物的體內抗氧化活性情況，文章以果蠅為研究對象進行系統(tǒng)研究。

1 實驗內容

1.1 實驗儀器與試劑

1.1.1 實驗儀器

BCD-301WECK 冰箱，合肥美菱股份有限公司；G90F25CN3L-C2(G1) 微波爐，廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司；Mettler-Toledo XP6 微量天平，瑞士梅特勒托利多公司；HC-3018R 高速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；UV-1600 紫外分光光度計，北京瑞利分析儀器公司；YXQM 行星研磨機，長沙米淇儀器設備有限公司。

1.1.2 實驗試劑

殼聚糖(分子量分別為200 kDa、3 kDa；脫乙酰度＞90%；青島云宙生物科技有限公司)；對甲基苯磺酰胺殼聚糖(內蒙古農業(yè)大學理學院提供)；黑腹果蠅；瓊脂；酵母粉；紅糖、玉米粉(市售)；正丙酸(A.R)；無水乙醚(A.R)；無水乙醇(A.R)；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 實驗方法

1.2.1 殼聚糖及其對甲基苯磺酰胺衍生物對果蠅壽命的影響

(1)培養(yǎng)基的配制

稱取細玉米粉12.6 g、粗玉米粒4.2 g、紅糖6.2 g、瓊脂1.24 g置于燒杯中，加入200 mL蒸餾水，攪勻，微波爐加熱煮沸至糊狀，冷卻至室溫，加入1.4 g酵母粉和1.0 mL丙酸充分混合，分裝在培養(yǎng)管中，每管厚度約為2 cm，用無菌棉球封口，由此制得基礎培養(yǎng)基。

稱取細玉米粉6.3 g、粗玉米粒2.1 g、紅糖3.1 g、瓊脂0.62 g置于燒杯中，加入100 mL蒸餾水，攪勻，微波爐加熱煮沸至糊狀，冷卻至室溫，加入0.7 g酵母粉和0.5 mL丙酸充分攪拌，加入0.005 g、0.015 g、0.025 g、0.035 g、0.045 g的高低分子殼聚糖原料及高低分子對甲基苯磺酰胺殼聚糖，制得濃度為0.005%、0.015%、0.025%、0.035%、0.045%的藥物培養(yǎng)基，攪拌均勻，倒入培養(yǎng)管中，每管厚度約為1 cm，用無菌棉球封口，由此得到對照組和實驗組培養(yǎng)基。

(2)果蠅壽命實驗

將果蠅置于相對濕度為60%，溫度為25 ℃的培養(yǎng)箱中，在基礎培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，產卵后倒出母本果蠅，隨后每隔8 h分一次雌雄果蠅，在基礎培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)15天。隨機將雌雄果蠅裝在對照組和實驗組培養(yǎng)基中，每管放30只，每個濃度5個重復，每天一次計算每個試管中果蠅的死亡和存活情況，直到它們全部死亡。在此過程中，培養(yǎng)基每3～4天更換一次。最后計算出半數(shù)果蠅死亡時的存活天數(shù)為果蠅的半數(shù)壽命，全部果蠅的平均存活天數(shù)為果蠅的平均壽命，最后10只果蠅死亡時的存活天數(shù)平均值為果蠅的最長壽命。

1.2.2 殼聚糖及其對甲基苯磺酰胺衍生物對果蠅抗氧化能力的影響

(1)果蠅的培養(yǎng)和組織勻漿制備

取上述基礎培養(yǎng)基中已飼養(yǎng)15天的雌雄果蠅，隨機放入對照組和實驗組培養(yǎng)基中，每管30只，每個濃度5組平行，在濕度60%、溫度25 ℃條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15天，乙醚麻醉，置于-80 ℃的超低溫保存箱中，以便測定抗氧化能力。

取已冷凍的果蠅放入離心管中，加入研磨珠和一定量的生理鹽水，使用研磨機研磨10 min后得到組織勻漿渾濁液，離心10 min，所得上清液倒入無菌離心管中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)果蠅體內蛋白質含量測定

稱取0.056 3 g牛血清蛋白用生理鹽水定容至100 mL，向空白管、標準管和測定管中依次加入0.1 mL蒸餾水、標準液和果蠅組織勻漿，以及2 mL考馬斯亮藍顯色劑，混勻，靜置2 min，測定上清液在595 nm處的吸光度值分別記為A0、Ai、Aj，按式(1)計算蛋白質的含量，單位為g/L。

(4)果蠅勻漿液SOD活力測定

測定管中加入試劑1應用液、果蠅組織勻漿、試劑2、試劑3和試劑4應用液，混勻，37 ℃水浴40 min；對照管加入試劑1應用液、蒸餾水、試劑2、試劑3和試劑4應用液，混勻，37 ℃水浴40 min；加入顯色劑，混勻，靜置10 min，測定在550 nm處吸光度值分別記為Aj、Ac，按式(2)計算SOD活力，單位為U/mgprot。

(5)果蠅勻漿液MDA含量測定

測定管中加入試劑1、果蠅勻漿液、試劑2和試劑3；對照管中加入果蠅勻漿液、試劑1、試劑2應用液和50%冰醋酸；空白管中加入試劑1、無水乙醇、試劑2和試劑3；標準管加入標準品、試劑1、試劑2和試劑3?；靹?，95 ℃水浴40 min，離心10 min，取上清液532 nm處測得吸光度值，按式(3)計算MDA含量，單位為nmol/mgprot。

1.2.3 殼聚糖及其對甲基苯磺酰胺衍生物對果蠅繁殖力的影響

用已分開培養(yǎng)好的雌雄果蠅，設置對照組和實驗組各5管平行，每管5只，濕度60%、溫度25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，除去親本，以第一只果蠅成蟲孵化出為第一天，統(tǒng)計出10天內孵化成蟲的總數(shù)為F1代數(shù)量。與此同時，將F1代果蠅收集并將雌雄分別培養(yǎng)，7天后去除親本，從第一只果蠅成蟲孵化出為第一天，統(tǒng)計10天內孵化成蟲總數(shù)為F2代數(shù)量。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0和GraphPad Prism 5.01軟件進行統(tǒng)計分析和作圖，結果均采用的方式表示。

1.3 結果與討論

1.3.1 殼聚糖及其對甲基苯磺酰胺衍生物對果蠅壽命的影響

每組果蠅的半數(shù)壽命、平均壽命和最長壽命如表1所示。分析實驗結果表明，相比空白對照組，對于雄性果蠅來說，在飼養(yǎng)對甲基苯磺酰胺高低分子殼聚糖過程中，半數(shù)壽命呈現(xiàn)隨濃度增大而減少的趨勢；在0.005 g/mL濃度下，果蠅最長壽命達到峰值，分別是60.3±0.89天和61.28±0.87天，對比殼聚糖原料的最長壽命(51.44±1.14天和54.16±4.1天)顯著延長，差異具有統(tǒng)計學意義。對于雌性果蠅而言，實驗濃度范圍內，在飼養(yǎng)對甲基苯磺酰胺高低分子殼聚糖記錄的半數(shù)壽命、平均壽命和最長壽命，與在飼養(yǎng)殼聚糖原料相比較未觀察到顯著變化，在0.045 g/mL濃度下，喂養(yǎng)MBSAHCS的果蠅最長壽命更優(yōu)于HCS。以上結果說明衍生物能在一定濃度下通過誘導果蠅的氧化應激適應性能，提高體內抗氧化活性，從而延長果蠅壽命。通過對比雌、雄性果蠅，發(fā)現(xiàn)雌性果蠅壽命比雄性果蠅壽命更長，這可能由于雌、性果蠅對于衍生物的耐受程度不同，這與秦永燕等[11]研究的黃芪多糖對雌雄果蠅壽命的影響結果一致，與王娟等[12]關于香椿子對果蠅壽命研究結果相一致，而與蔣炎炎等[13]關于啤酒對果蠅壽命的影響的研究相反，這可能與雌雄果蠅在體質和生理代謝方面的差異有關。

表1 不同濃度殼聚糖及其衍生物對果蠅壽命的影響

1.3.2 殼聚糖及其對甲基苯磺酰胺衍生物對果蠅抗氧化能力的影響

(1)殼聚糖及其對甲基苯磺酰胺衍生物對果蠅體內MDA含量的影響。

氧自由基在人體新陳代謝過程中產生的生物膜可以攻擊多不飽和脂肪酸，引起脂質過氧化，并形成脂質過氧化物醛基(丙二醛)等。MDA的含量通常用于顯示脂質過氧化在體內的程度，并間接體現(xiàn)細胞損傷的程度[14]圖2、圖3分別是殼聚糖及其對甲基苯磺酰胺衍生物對雄性、雌性果蠅體內MDA含量的測定結果。對于高分子量濃度來說，在濃度為0.015 g/mL時，飼養(yǎng)MBSAHCS的果蠅MDA含量較HCS顯著降低且抗氧化活性較強；對于低分子量濃度為0.005 g/mL時，飼養(yǎng)MBSALCS的果蠅抗氧化能力稍優(yōu)于LCS。對于雌性果蠅而言，在飼養(yǎng)濃度為0.005 g/mL的MBSALCS時，果蠅體內的MDA含量到達峰值且抗氧化能力較弱。另外，雄性果蠅體內MDA含量顯著高于雌性果蠅，同時這也與雌性果蠅壽命比雌性果蠅長的結果相呼應。

圖2 殼聚糖及其對甲基苯磺酰胺衍生物對雄性果蠅體內MDA含量的影響

圖3 殼聚糖及其對甲基苯磺酰胺衍生物對雌性果蠅體內MDA含量的影響

(2)殼聚糖及其對甲基苯磺酰胺衍生物對果蠅體內SOD活力的影響。

生物體內的各種生物過程會產生活性氧(ROS)，從而導致氧化應激，為了應對這種氧化應激，生物體可以利用超氧化物歧化酶(SOD)來清除活性氧，從而保護細胞內環(huán)境的穩(wěn)定性[15]。超氧化物歧化酶(SOD)是直接清除自由基的酶，具體來說，SOD以高特異性和高效率將超氧化物分解成氧氣和過氧化氫[16]。圖4、圖5分別是殼聚糖及其對甲基苯磺酰胺衍生物對雄性、雌性果蠅SOD活力的測定結果，對于雄性果蠅來說，飼養(yǎng)濃度為0.005 g/mL的MBSALCS的果蠅，SOD活力顯著提升并達到峰值且抗氧化活性強，這與果蠅壽命實驗結果相對應。MBSAHCS和HCS的結果相差不大。對雌性果蠅，在濃度為0.035、0.045 g/mL時，MBSAHCS更優(yōu)于相同濃度下HCS的SOD值，抗氧化活性更優(yōu)?？傮w上雌性果蠅的SOD值明顯優(yōu)于雄性果蠅，印證了果蠅壽命實驗的結果。飼養(yǎng)對甲基苯磺酰胺殼聚糖在一定濃度能增加果蠅的SOD活力，可能是因為有大量的羥基取代基在藥物中存在，有一定的還原能力，使果蠅抗氧化活性增強。

圖4 殼聚糖及其對甲基苯磺酰胺衍生物對雄性果蠅SOD活力的影響

圖5 殼聚糖及其對甲基苯磺酰胺衍生物對雌性果蠅SOD活力的影響

1.3.3 殼聚糖及其對甲基苯磺酰胺衍生物對果蠅繁殖力的影響

圖6、圖7分別是殼聚糖及其對甲基苯磺酰胺衍生物對果蠅繁殖力影響的測定結果。對F1代，MBSAHCS在0.015 g/mL和0.035 g/mL濃度下對果蠅繁殖力的抑制率較高；在0.015 g/mL濃度時，MBSALCS對果蠅的抑制率最高值為49.07±2.68%，在0.005 g/mL濃度時，對果蠅繁殖力抑制率為18.06±1.05%，與殼聚糖原料基本相同。對F2代，衍生物對果蠅繁殖力的抑制率都隨藥物濃度的增加而升高，MBSALCS在0.045 g/mL濃度時抑制率達到100%，可能是由于F2代藥物毒性的累積，產生了抗藥性。果蠅一系列的生物活動都是由保幼激素和蛻皮激素協(xié)調的，它們控制著胚胎發(fā)育、蛻皮、變形和繁殖[17]。實驗表明，衍生物或多或少都會對果蠅的繁殖力造成有害影響，這可能由于磺胺類衍生物長期的飼養(yǎng)，抑制了蛻皮激素的釋放致使果蠅生長發(fā)育緩慢，也可能由于衍生物導致激素分泌異常。

圖6 殼聚糖及其對甲基苯磺酰胺衍生物對果蠅繁殖力影響(F1)

圖7 殼聚糖及其對甲基苯磺酰胺衍生物對果蠅繁殖力影響(F2)

2 結語

生物體的衰老是一個多因素作用的復雜過程，多種抗氧化酶是機體防御系統(tǒng)中極其重要的部分，可以維持活性氧的動態(tài)平衡，防止過量的活性氧對機體造成氧化損傷。SOD能清除有害的自由基，防止對機體的損傷，MDA能體現(xiàn)細胞損害程度。果蠅是一種廣泛應用的模式有機體，在衰老研究中具有明顯的優(yōu)勢，包括壽命短、維護要求低、遺傳資源豐富和易于進行遺傳操作。在研究中，選擇果蠅模型來研究不同濃度下的殼聚糖及其對甲基苯磺酰胺衍生物對果蠅的壽命及繁殖能力的影響，并測得果蠅體內MDA含量和SOD活力作為檢測抗氧化能力的指標。研究結果表明，雌性果蠅對比雄性果蠅壽命更長，衍生物對雌性果蠅的存活時間影響不大，證明衍生物在一定濃度使用下有較好的抗氧化能力。衍生物在0.005 g/mL濃度下，果蠅最長壽命達到峰值且果蠅體內MDA含量低，SOD活力最高，并且都高于雄性果蠅，說明存在性別差異。對甲基苯磺酰胺衍生物在一定濃度下能減弱果蠅衰老，從而延長果蠅壽命，提高體內抗氧化活性。由此看來，果蠅的存活時間和繁殖能力與生物體的氧化損傷有著直接關系，藥物可能利用降低體內抗氧化能力從而降低果蠅存活時間和繁殖能力。對甲基苯磺酰胺衍生物影響果蠅生長發(fā)育的因素是多方面的，還需要進一步研究探索。