徐彥楠，趙俊霞，周娜靜，高 品，周晨明

(1.河北醫(yī)科大學(xué)教學(xué)實驗中心，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物教研室，河北 石家莊 050017;3.河北醫(yī)科大學(xué)大型科研儀器設(shè)備共享服務(wù)平臺，河北 石家莊 050017)

胃癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的消化道惡性腫瘤之一，5年相對生存率僅約為20%，早期胃癌臨床無明顯癥狀，隨著疾病進(jìn)展逐漸出現(xiàn)消化不良、胃脘疼痛、嘔血等癥，晚期患者常伴腹部腫塊、遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等體征，放、化療等方式雖可有效治療胃癌，但易產(chǎn)生脫發(fā)、骨髓抑制等嚴(yán)重不良反應(yīng)，尋求安全、有效的抗腫瘤藥物迫在眉睫[1-2]。腫瘤細(xì)胞凋亡減少是惡性腫瘤的病理學(xué)基礎(chǔ)之一，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是抗腫瘤治療最有效的途徑，本課題組前期研究結(jié)果顯示，從褐環(huán)黏蓋牛肝菌子實體中分離純化的異牛肝菌素(iso-suillin)可有效抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞及人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞凋亡，且與人胃癌BGC-823細(xì)胞增殖、凋亡密切相關(guān)[3-4]。當(dāng)細(xì)胞代謝異常產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)超過抗氧化系統(tǒng)的還原能力時，細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，易引起凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，繼而激活細(xì)胞凋亡程序[5]。有研究證實，ROS的生成在多種抗腫瘤藥物的促凋亡活性中有重要作用，而PI3K/Akt信號通路參與機(jī)體細(xì)胞存活、周期、凋亡、物質(zhì)代謝等生物學(xué)過程，與多種腫瘤細(xì)胞的凋亡息息相關(guān)[6-7]。本課題擬通過觀察iso-suillin對人胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白、ROS/PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控作用，進(jìn)一步闡明iso-suillin對人胃癌BGC-823細(xì)胞促凋亡的作用及分子機(jī)制，為iso-suillin成為一種潛在的抗腫瘤藥物提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)和參考，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1材料 人胃癌細(xì)胞系BGC-823細(xì)胞保存于河北醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物教研室。

1.2主要藥物與試劑 異牛肝菌素(河北師范大學(xué)生命科學(xué)院)，胎牛血清(美國Gibco公司)，青霉素(上海江萊生物科技有限公司)，鏈霉素(深圳華藥南方制藥有限公司)，Roswell Park Memorial Institute(RPMI)培養(yǎng)基(美國Invitrogen Life Technologies公司)，乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)消化液(天津科密歐化化學(xué)試劑公司)，多聚甲醛、磷酸緩沖液(天津永大化學(xué)試劑開發(fā)中心)，Hoechst染色液(美國Amresco公司)，苯甲基磺酰氟(phenyl methyl sulfonyl fluoride，PMSE)細(xì)胞裂解液(美國Cell Signaling Technology公司)，兔抗Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、PI3K、Akt、mTOR(美國Bioworld Technology公司)，山羊抗兔二抗(康為世紀(jì)生物試劑公司)，聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(美國Amresco公司)。

1.3主要儀器設(shè)備 普通顯微鏡(日本Olympus公司)，QP-80S二氧化碳培養(yǎng)箱(山東博科醫(yī)療器械有限公司)，醫(yī)用冰箱(青島海爾醫(yī)用低溫有限公司)，EV261電泳儀(比利時Consort公司)，熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，微量移液器(上海賽默飛世爾儀器有限公司)。

1.4細(xì)胞培養(yǎng) 配制內(nèi)含10%胎牛血清、10 g/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI培養(yǎng)基，將人胃癌BGC-823細(xì)胞置于RPMI培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每隔24 h換液一次。待細(xì)胞形成致密單層后分瓶培養(yǎng)：棄去培養(yǎng)基，用磷酸緩沖液清洗1次后加入5 mL 0.04%的EDTA消化液，沿同一方向輕輕搖動培養(yǎng)瓶，待消化液充分浸潤后于顯微鏡下觀察。若多數(shù)細(xì)胞形態(tài)變圓，棄去EDTA消化液后加入10 mL新鮮RPMI培養(yǎng)基終止消化，而后反復(fù)吹打使細(xì)胞形成細(xì)胞懸液，以1∶2傳代培養(yǎng)，3 d傳代1次。

1.5方法

1.5.1Hoechst 33342熒光染色觀察人胃癌BGC-823細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的人胃癌BGC-823細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中調(diào)整胞懸液使?jié)舛葹?×105個/mL，于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種，每組均設(shè)置3個復(fù)孔，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。分別加入7 μmol/L、14 μmol/L、28 μmol/L濃度的異牛肝菌素處理，依次記為低劑量組、中劑量組、高劑量組；另取一組記為對照組，給予等量生理鹽水處理，處理完畢后均在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h，終止培養(yǎng)。棄去上清液后采用磷酸緩沖液洗滌1次，并用4%多聚甲醛固定，30 min后再使用磷酸緩沖液洗滌3次，使用微量移液器吸凈液體后加入Hoechst染色液，于室溫下染色15 min后去除染液，再使用磷酸緩沖液洗滌3次后使用吸凈微量移液器液體，每孔加入適量熒光淬滅劑，于熒光顯微鏡下觀察。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)量×100%。

1.5.2蛋白免疫印跡法檢測異牛肝菌素處理后人胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 分組及細(xì)胞處理同1.5.1，將不同濃度異牛肝菌素作用于人胃癌BGC-823細(xì)胞48 h后棄去培養(yǎng)液，磷酸緩沖液洗滌2次，并用微量移液器吸凈多余液體；加入80～120 μL細(xì)胞裂解液(PMSE與細(xì)胞裂解液按1∶100混合)，于4 ℃條件下裂解30 min，分別提取各組細(xì)胞總蛋白。將樣本與2倍濃度上樣緩沖液以體積1∶1混合，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)(分離膠為12%)后轉(zhuǎn)至PVDF膜，采用含0.1% Tween的5%脫脂奶粉于室溫下封閉2 h后進(jìn)行洗膜，洗膜后加入1∶500稀釋的兔抗人Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8、Caspase -9孵育，于4 ℃條件下過夜，TBST緩沖液洗滌3次后，采用山羊抗兔IgG抗體(1∶1 000，二抗)標(biāo)記，將漂洗過的PVDF膜置于孵育盒中，37 ℃溫箱中孵育1 h，將PVDF膜置于凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行發(fā)光等操作，采用凝膠圖像分析軟件測定各蛋白條帶的積分光密度值(integrated optical density，IOD)，Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase -8、Caspase -9蛋白條帶的IOD與對應(yīng)的β-actin條帶光密度比值為Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase -8、Caspase -9的表達(dá)的相對水平，重復(fù)3次，取平均值。

1.5.3活性氧熒光探針染色法(Dichlorfoluorescein diacetate，DCFH-DA)檢測異牛肝菌素處理后人胃癌BGC-823細(xì)胞ROS水平 取處于對數(shù)生長期的人胃癌BGC-823細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后制成5×107的單細(xì)胞懸液，于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種，每組均設(shè)置3個復(fù)孔，細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，加不同濃度異牛肝菌素干預(yù)48 h，采用磷酸緩沖液洗滌2次，加入DCFH-DA染色液，于37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，用預(yù)冷的磷酸緩沖液洗滌3次，于倒置熒光顯微鏡下(發(fā)射波長為530 nm)觀察。

1.5.4蛋白免疫印跡法檢測PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平 檢測方法同1.5.2，其中一抗為兔抗人PI3K、Akt、mTOR，二抗選用山羊抗兔IgG抗體標(biāo)記。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用t檢驗、單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1干預(yù)后各組人胃癌BGC-823細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 Hoechst 33342熒光染色顯示隨著異牛肝菌素濃度增加，呈亮藍(lán)色的細(xì)胞越來越多，染色質(zhì)凝聚，出現(xiàn)凋亡小體，即細(xì)胞凋亡。與對照組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組凋亡率均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 不同濃度iso-suillin干預(yù)后各組凋亡率比較Table 1 Comparison of apoptosis rate in each group after intervention with iso-sullin at different concentrations

圖1 各組人胃癌BGC-823細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化(Hoechst33342熒光染色 ×200)

2.2干預(yù)后各組人胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平 干預(yù)后，蛋白免疫印跡法檢測異牛肝菌素對人胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白結(jié)果顯示，與對照組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9相對表達(dá)量均增加，抗凋亡蛋白Bcl-2相對表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 不同濃度iso-suillin干預(yù)后人胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較Table 2 Comparison of expression levels of apoptosis-related proteins in human gastric cancer BGC-823 cells after intervention with iso-sullin at different concentrations

圖2 各組人胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

2.3干預(yù)后各組人胃癌BGC-823細(xì)胞ROS水平 干預(yù)后，DCFH-DA檢測異牛肝菌素處理后人胃癌BGC-823細(xì)胞ROS水平結(jié)果顯示，隨著異牛肝菌素濃度的增加，人胃癌BGC-823細(xì)胞ROS細(xì)胞漿著色密度增加，提示ROS水平增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組人胃癌BGC-823細(xì)胞ROS水平均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3、圖3。

表3 不同濃度iso-suillin干預(yù)后各組人胃癌BGC-823細(xì)胞ROS水平比較Table 3 Comparison of ROS level of human gastric cancer BGC-823 cells in each group after the intervention with iso-sullin at different concentrations

圖3 各組人胃癌BGC-823細(xì)胞ROS水平(活性氧熒光探針染色法 ×200)

2.4PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平 干預(yù)后，蛋白免疫印跡法檢測異牛肝菌素處理后人胃癌BGC-823的PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，與對照組比較，隨著異牛肝菌素濃度的增加， 低劑量組、中劑量組、高劑量組PI3K、Akt、mTOR蛋白相對表達(dá)量均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4、圖4。

表4 不同濃度iso-suillin干預(yù)后各組PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較Table 4 Comparison of PI3K/Akt signal pathway-related protein expression levels in each group after the intervention with iso-sullin at different concentrations

圖4 PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平

3 討 論

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，我國胃癌發(fā)病率、病死率接近全球范圍內(nèi)胃癌發(fā)病及病死總數(shù)的50%，嚴(yán)重威脅居民生命健康[8]。既往研究表明，胃癌惡性程度較高，確診時多數(shù)處于中晚期，手術(shù)、放療、生物治療等雖可緩解胃癌患者臨床癥狀，但伴隨著嚴(yán)重的不良反應(yīng)、腫瘤耐藥等問題，患者臨床預(yù)后欠佳，已成為制約胃癌治療的瓶頸[9]。因此，尋找高效、毒性低的抗腫瘤藥物尤為關(guān)鍵。基因突變引起細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)紊亂導(dǎo)致的細(xì)胞增殖失控、細(xì)胞凋亡受阻是致使胃癌發(fā)生的主要因素，細(xì)胞凋亡可通過處理衰老、受損的細(xì)胞維持組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)環(huán)境，但在退行性條件下，凋亡系統(tǒng)被破壞易致癌癥、自身免疫性疾病等癥，目前臨床多數(shù)抗腫瘤藥物通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡達(dá)到治療目的[10]。iso-suillin是從褐環(huán)黏蓋牛肝菌子實體中分離純化得到的異戊二烯基酚類化合物，具有抗氧化、提高機(jī)體耐受力等多種藥用價值，同時可誘導(dǎo)部分腫瘤細(xì)胞凋亡，毒不良反應(yīng)低于順鉑等傳統(tǒng)抗腫瘤藥物。Zhao等[11]研究顯示，異牛肝菌素可通過線粒體介導(dǎo)的內(nèi)在途徑及死亡受體介導(dǎo)的外在途徑調(diào)節(jié)Caspases家族相關(guān)蛋白的表達(dá)，繼而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，可作為胃癌、心腦血管腫瘤等疾病的潛在治療方法。

為明確iso-suillin對胃癌細(xì)胞凋亡的影響，本研究將異牛肝菌素作用于人胃癌BGC-823細(xì)胞，通過Hoechst 33342熒光染色實驗顯示，隨著異牛肝菌素濃度增加，呈亮藍(lán)色的細(xì)胞越來越多，染色質(zhì)凝聚，出現(xiàn)凋亡小體，且呈現(xiàn)劑量依賴性，證實異牛肝菌素可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。通過蛋白免疫印跡法進(jìn)一步對人胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白檢測顯示，與對照組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組促凋亡蛋白Bax相對表達(dá)量增加，抗凋亡蛋白Bcl-2相對表達(dá)量降低，此外，Caspase-3、Caspase -8、Caspase -9相對表達(dá)量均增加，證實腫瘤細(xì)胞發(fā)生了線粒體凋亡。Bax是Bcl-2家族經(jīng)典的促凋亡因子，可在線粒體外膜成孔，破壞線粒體后增加細(xì)胞色素C的釋放，最終激活Caspase -9，致使腫瘤細(xì)胞凋亡。此外，細(xì)胞內(nèi)源性凋亡起始于DNA破壞或細(xì)胞受損，外源性凋亡起始于細(xì)胞外配體或死亡受體間相互作用，二者均依賴于Caspase家族成員的激活，其中Caspase-3可通過自我催化引起蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，特異性裂解底物而致細(xì)胞凋亡；Caspase-8可誘導(dǎo)死亡配體與其特異性受體結(jié)合，形成誘導(dǎo)死亡信號復(fù)合體而促使腫瘤細(xì)胞凋亡[12-13]。最新研究表明，引起腫瘤細(xì)胞代謝異常產(chǎn)生的大量ROS可使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而激活細(xì)胞凋亡程序，在多種抗腫瘤藥物的促凋亡活性中有關(guān)鍵作用[14]。Fasoulakis等[15]學(xué)者研究顯示，細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加可將腫瘤細(xì)胞周期阻滯在G1期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，ROS介導(dǎo)的死亡受體上調(diào)而增加腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡受體發(fā)揮作用，在胃癌、膀胱癌、肝癌等惡性腫瘤中均有顯著作用。本研究通過DCFH-DA檢測異牛肝菌素處理后人胃癌BGC-823細(xì)胞ROS水平亦顯示，iso-suillin可通過增加細(xì)胞ROS水平誘使腫瘤細(xì)胞代謝異常，繼而促使細(xì)胞凋亡。PI3K作為細(xì)胞內(nèi)的磷脂酰肌醇激酶，本身具有絲氨酸的活性，在接受酪氨酸激酶、G蛋白偶聯(lián)受體信號后，自身發(fā)生磷酸化，使Akt從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜上，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)[16-17]。本研究通過蛋白免疫印跡法檢測PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平顯示，PI3K、Akt、mTOR蛋白活性是被抑制的，進(jìn)一步顯示Akt下游相關(guān)蛋白活性也被抑制，且促使腫瘤細(xì)胞凋亡，推測可能與PI3K、Akt迅速失活有關(guān)，哺乳動物細(xì)胞凋亡多為級聯(lián)反應(yīng)，異牛肝菌素可能通過抑制PI3K/Akt信號通路，誘導(dǎo)人胃癌BGC-823細(xì)胞發(fā)生凋亡，但其是否還通過其他機(jī)制致使胃癌細(xì)胞死亡還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，iso-suillin可誘導(dǎo)人胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡，發(fā)生機(jī)制可能與活化了Caspase家族蛋白、上調(diào)了ROS表達(dá)、下調(diào)PI3K、Akt、mTOR相關(guān)。但其是否同時通過其他機(jī)制誘導(dǎo)人胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡還需深入研究。