司徒瑩 ，程婉秋 ，沈志濱 ，陳艷芬 ，唐春萍 ，陳聰 ，江濤 （.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 50006；2.廣東藥科大學(xué)實驗動物中心，廣州 50006；.廣東省局部精準(zhǔn)藥物遞藥制劑工程技術(shù)研究中心，廣州50006）

黃草烏為毛茛科植物黃烏頭Aconitum vilmorini‐anum Kom.的干燥塊根[1]，有劇毒，收載于2005年版《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》中。黃草烏具有祛風(fēng)散寒、除濕止痛的功效，臨床用于治療跌打損傷、風(fēng)濕痛、手足厥冷等[2]。烏頭屬植物對心臟有明顯毒性，能誘發(fā)不同類型的心律失常。其含有的烏頭屬類生物堿是主要的毒性成分，其中以烏頭堿最具代表性[3]。黃草烏同屬烏頭屬植物，其生品中所含的雙酯型二萜生物堿（如滇烏堿）與烏頭堿的結(jié)構(gòu)相似[4]。滇烏堿是黃草烏的主要活性成分之一，但同時也是其主要毒性成分之一[5]。本課題組前期研究結(jié)果顯示，黃草烏經(jīng)炮制后對心臟的毒性明顯降低，這與黃草烏炮制后滇烏堿含量顯著降低有關(guān)[5―6]。相關(guān)研究表明，滇烏堿引起大鼠心律失常的毒性作用可能與其降低了心肌細(xì)胞線粒體能量代謝和引起了鈣超載有關(guān)[7]；并且，滇烏堿還可抑制H9c2心肌細(xì)胞活性，破壞心肌細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[8]。但關(guān)于滇烏堿致大鼠心肌損傷與線粒體凋亡途徑的相關(guān)性尚未明確。

細(xì)胞凋亡又名細(xì)胞程序性死亡，是維持機(jī)體正常新陳代謝的一種正常的生理過程。心肌細(xì)胞為高度分化的終末細(xì)胞，不具有再生能力，而過度凋亡可造成心肌細(xì)胞持續(xù)喪失，使心肌發(fā)生結(jié)構(gòu)性病變[9]。現(xiàn)有研究表明，細(xì)胞凋亡的線粒體途徑是指由于線粒體受到氧化應(yīng)激、鈣超載、DNA損傷等多種刺激啟動凋亡程序，激活多種轉(zhuǎn)錄因子而引起的細(xì)胞凋亡[10]。本文基于現(xiàn)有研究，通過線粒體途徑探究滇烏堿導(dǎo)致大鼠心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，從而揭示滇烏堿引起大鼠心肌損傷的可能毒性機(jī)制，以期為黃草烏及其活性成分的臨床安全使用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有：VARIOSKAN型多功能微孔板讀數(shù)儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]，Bio-Rad型電泳儀、電轉(zhuǎn)系統(tǒng)（Mini型蛋白電泳系統(tǒng)）、UV1300/1500型紫外-可見分光光度計[美析（中國）儀器有限公司]，URIT-8021A型全自動生化分析儀（桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司），LG2000型數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司），Infinite 200 PRO型多功能熒光酶標(biāo)儀（奧地利Tecan Austria GmbH公司），BX51型熒光顯微鏡（日本Olympus公司），JEM400 PLUS型電子透射顯微鏡（日本電子株式會社）。

1.2 主要藥品與試劑

滇烏堿對照品（批號MUST1910，純度≥98%）、烏頭堿對照品（批號MUST1911，純度≥98%）均購自成都曼斯特生物科技有限公司；肌酸激酶（creatine kinase，CK）檢測試劑盒（批號25192028）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）檢測試劑盒（批號25192124）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒（批號25191925）均購自桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（批號A003）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（批號A001-3-2）、BCA蛋白濃度檢測試劑盒（批號A045-4-2）均購自南京建成生物工程研究所；一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（批號C1086）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒（批號C1051902）購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；兔源胱天蛋白酶3（caspase-3）多克隆抗體、兔源caspase-9多克隆抗體、兔源B淋巴細(xì)胞瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）單克隆抗體、兔源3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體均購自英國Abcam公司；兔源Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 as‐sociated X protein，Bax）單克隆抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司；山羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗購自美國Bioworld公司；其他試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格。

1.3 動物

本研究所用的動物為SPF級SD大鼠，共40只，雌雄各半，體質(zhì)量200～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)合格證號為SCXK（粵）2018-0002。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20～25 ℃，相對濕度為40%～70%。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后進(jìn)行實驗。該實驗方案經(jīng)廣東藥科大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為gdpulacspf-2017319。

2 方法

2.1 動物分組與給藥

將40只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常組、滇烏堿高劑量組（0.14 mg/kg）、滇烏堿低劑量組（0.09 mg/kg）和烏頭堿組（陽性對照，0.88 mg/kg），每組10只。正常組大鼠灌胃生理鹽水，各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥液，灌胃體積均為1 mL/100 g，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃7 d。給藥方案參照本課題組前期研究設(shè)置，滇烏堿高、低劑量分別為大鼠的1/4、1/6半數(shù)致死量（median lethal dose，LD50），烏頭堿劑量為大鼠的1/10 LD50[7]。

2.2 標(biāo)本采集與處理

末次灌胃1 h后，將大鼠麻醉，腹主動脈取血5 mL，將血液靜置一段時間后，以3 500 r/min離心10 min，分離血清。取血后，立即打開大鼠胸腔，用生理鹽水灌注心臟，取一部分左心耳心肌組織于4%多聚甲醛固定液中固定保存，另一部分左心耳心肌組織于2.5%戊二醛中固定保存；其余心肌組織于－80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 大鼠血清中LDH、CK、CK-MB水平檢測

取大鼠血清，分別按各試劑盒說明書步驟操作，使用全自動生化分析儀檢測大鼠血清中心肌酶學(xué)指標(biāo)LDH、CK、CK-MB的水平。

2.4 大鼠血清中MDA含量和SOD活性檢測

取大鼠血清，按相應(yīng)試劑盒說明書操作，使用紫外-可見分光光度法檢測大鼠血清中MAD含量和SOD活性。

2.5 大鼠心肌組織中ROS水平檢測

取凍存的大鼠心肌組織約50 mg，于300目尼龍網(wǎng)上研磨制成組織勻漿，以1 000 r/min離心5 min制備細(xì)胞懸液，加入2 mL DCFH-DA探針，在37 ℃孵育30 min，然后再以1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞沉淀物。使用多功能微孔板讀數(shù)儀在激發(fā)波長504 nm、發(fā)射波長529 nm處檢測ROS的熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度越高表示ROS水平越高。

2.6 大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)及線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察

取4%多聚甲醛固定的心肌組織（每組隨機(jī)選3只大鼠樣本），經(jīng)過脫水浸蠟、石蠟包埋、切片（厚度4 μm）、HE染色后，用中性樹脂封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理學(xué)變化。另取2.5%戊二醛固定的心肌組織（約1 mm3的小塊），經(jīng)過常規(guī)的脫水、樹脂滲透、烘烤、包埋、加熱聚合固化、切片（厚度1 μm）、鈾鉛雙染色、2%乙酸雙氧鈾染色、檬酸鉛染色后，于電子透射顯微鏡下觀察心肌組織線粒體變化。

2.7 大鼠心肌細(xì)胞凋亡檢測

取“2.6”項下的心肌組織石蠟切片（厚度4 μm），脫蠟水合后，使用磷酸鹽緩沖液（PBS）、蛋白酶K及封閉液預(yù)處理切片。用TdT酶反應(yīng)液覆蓋切片，在避光條件下以37 ℃培養(yǎng)60 min，再將熒光素抗體（稀釋比例1∶200）覆蓋切片，避光培養(yǎng)30 min；PBS沖洗切片后，在熒光顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞凋亡情況并拍照記錄，每個樣本選取3個視野，使用Image J V 1.8.0軟件對視野內(nèi)凋亡細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，取平均值。

2.8 大鼠心肌組織中線粒體途徑凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測

每組隨機(jī)選取3只大鼠的組織樣本進(jìn)行實驗。稱取凍存的大鼠心肌組織約1 000 mg，剪碎后加入適量裂解液提取總蛋白，并使用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定總蛋白濃度。將提取的總蛋白配制成上樣緩沖液后煮沸，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（濃縮膠電壓60～100 V，時間為30 min；分離膠電壓100～200 V，時間為60 min ）分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（Bax、Bcl-2的電轉(zhuǎn)條件為300 mA、30 min，caspase-3、caspase-9的電轉(zhuǎn)條件為300 mA、45 min）；用5%脫脂奶粉封閉過夜，次日加入Bax一抗（稀釋比例為1∶2 000）、Bcl-2一抗（稀釋比例為1∶500）、caspase-3一抗（稀釋比例為1∶500）、caspase-9一抗（稀釋比例為1∶1 000）、GAPDH一抗（稀釋比例為1∶10 000），4 ℃孵育過夜；洗膜后，加入相應(yīng)二抗（稀釋比例為1∶40 000），室溫孵育2 h；用ECL顯色試劑盒顯色，化學(xué)發(fā)光成像儀下顯影并拍照，使用Image JV 1.8.0軟件分析條帶灰度值。以目標(biāo)蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示各目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)水平。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 滇烏堿對大鼠血清中心肌酶學(xué)指標(biāo)的影響

與正常組比較，滇烏堿高、低劑量組和烏頭堿組大鼠血清中LDH、CK、CK-MB水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），詳見表1。

表1 各組大鼠血清中LDH、CK、CK-MB水平檢測結(jié)果（±s，n＝10，U/L）

表1 各組大鼠血清中LDH、CK、CK-MB水平檢測結(jié)果（±s，n＝10，U/L）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與正常組比較，P＜0.05

組別正常組滇烏堿高劑量組滇烏堿低劑量組烏頭堿組CK-MB 139.50±73.12 226.04±76.29a 212.50±64.67b 222.00±60.20b LDH 568.80±141.75 781.70±158.26a 739.80±182.25b 782.30±151.09a CK 636.30±135.30 1 149.00±228.51a 1 118.40±286.17a 1 063.40±173.07a

3.2 滇烏堿對大鼠血清中MDA含量和SOD活性的影響

與正常組比較，滇烏堿高、低劑量組和烏頭堿組大鼠血清中MDA含量均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），SOD活性均顯著降低（P＜0.01），詳見表2。

表2 各組大鼠血清中MDA含量和SOD活性檢測結(jié)果（±s，n＝10）

表2 各組大鼠血清中MDA含量和SOD活性檢測結(jié)果（±s，n＝10）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與正常組比較，P＜0.05

組別正常組滇烏堿高劑量組滇烏堿低劑量組烏頭堿組SOD活性/（U/mL）11.05±0.40 10.32±0.24a 10.43±0.31a 10.41±0.30a MDA含量/（nmol/mL）0.40±0.05 0.49±0.04a 0.46±0.04b 0.50±0.09a

3.3 滇烏堿對大鼠心肌組織中ROS水平的影響

與正常組[ROS熒光強(qiáng)度為5.61±0.34（n＝10）]比較，滇烏堿高、低劑量組和烏頭堿組大鼠心肌組織中ROS水平[ROS熒光強(qiáng)度依次為7.57±0.81、7.38±0.97、8.71±1.17（n＝10）]均顯著升高（P＜0.01）。

3.4 滇烏堿對大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)及線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響

3.4.1 心肌組織病理形態(tài)學(xué) 光鏡下，正常組大鼠心肌組織細(xì)胞排列緊湊、規(guī)整，心肌細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞核無異常變化。與正常組比較，各給藥組大鼠心肌細(xì)胞排列不緊湊，胞間空隙增大，心肌細(xì)胞的胞質(zhì)出現(xiàn)明顯空泡，部分細(xì)胞核固縮，少量心肌纖維出現(xiàn)斷裂，其中以滇烏堿高劑量組大鼠的病變程度最高。結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)顯微圖（HE染色，×400）

3.4.2 心肌組織線粒體超微結(jié)構(gòu) 電鏡下，正常組大鼠心肌組織線粒體超微結(jié)構(gòu)無明顯變化，線粒體嵴豐富，未見明顯腫脹。滇烏堿高、低劑量組大鼠心肌組織線粒體大小不等、分布紊亂，少數(shù)線粒體明顯腫脹、空泡化、嵴斷裂、嵴減少，可見圓盤狀嵴線粒體，少數(shù)線粒體體積縮小、內(nèi)嵴擴(kuò)張，偶見線粒體自噬。烏頭堿組大鼠心肌組織線粒體大小不等、分布明顯紊亂，少數(shù)線粒體明顯腫脹、空泡化、嵴斷裂、嵴減少，偶見線粒體自噬。結(jié)果見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織線粒體超微結(jié)構(gòu)顯微圖（×25 000）

3.5 滇烏堿對大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

與正常組[每個視野中凋亡細(xì)胞數(shù)為（10.00±7.90）個（n＝3）]比較，滇烏堿高、低劑量組和烏頭堿組大鼠心肌凋亡細(xì)胞數(shù)[每個視野中凋亡細(xì)胞數(shù)依次為（213.20±50.61）、（74.60±12.05）、（140.80±31.14）個（n＝3）]顯著增加（P＜0.01）。結(jié)果見圖3。

圖3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡熒光顯微圖（×200）

3.6 滇烏堿對大鼠心肌組織中線粒體途徑凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，滇烏堿高劑量組和烏頭堿組大鼠心肌組織中Bcl-2/Bax比值顯著降低（P＜0.01），caspase-9、cleaved-caspase-9、caspase-3、cleaved-caspase-3蛋白相對表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；滇烏堿低劑量組大鼠心肌組織中Bcl-2/Bax比值顯著降低（P＜0.01），caspase-3蛋白相對表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖4、表3。

圖4 各組大鼠心肌組織中線粒體途徑凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖

表3 各組大鼠心肌組織中線粒體途徑凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)水平檢測結(jié)果（±s，n＝3）

表3 各組大鼠心肌組織中線粒體途徑凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)水平檢測結(jié)果（±s，n＝3）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與正常組比較，P＜0.05

組別正常組滇烏堿高劑量組滇烏堿低劑量組烏頭堿組Bcl-2/Bax 0.74±0.10 0.32±0.04a 0.56±0.05a 0.46±0.03a caspase-9/GADPH 0.11±0.03 0.32±0.06b 0.21±0.04 0.30±0.14b cleaved-caspase-9/GADPH 0.06±0.01 0.21±0.12b 0.08±0.03 0.28±0.04b caspase-3/GADPH 0.13±0.03 0.26±0.05b 0.26±0.10b 0.35±0.05a cleaved-caspase-3/GADPH 0.40±0.06 0.57±0.09b 0.47±0.05 0.68±0.07a

4 討論

心肌酶譜包括LDH、CK、CK-MB，主要存在于心肌細(xì)胞中，是檢測心肌損傷的重要指標(biāo)[11―12]。當(dāng)心肌細(xì)胞受損時，細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化，LDH、CK、CK-MB在血清中的水平會明顯升高。本研究結(jié)果顯示，滇烏堿給藥后，大鼠心肌組織發(fā)生心肌纖維斷裂、空隙變大及細(xì)胞核固縮，心肌細(xì)胞膜的完整性遭到破壞，血清中LDH、CK、CK-MB水平顯著升高，這提示滇烏堿可致心肌細(xì)胞損傷。

氧化應(yīng)激是心肌損傷的主要病理因素，而ROS是引起細(xì)胞氧化應(yīng)激的主要因子，SOD活性及MDA含量能反映細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷程度[13―14]。線粒體是心肌細(xì)胞重要的細(xì)胞器，參與細(xì)胞能量代謝等活動。正常線粒體產(chǎn)生的ROS可被SOD等抗氧化酶清除，從而將ROS維持在較低水平[15]。當(dāng)細(xì)胞蓄積過量ROS時，會破壞線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)類物質(zhì)，導(dǎo)致其功能和細(xì)胞內(nèi)氧利用率下降，細(xì)胞進(jìn)行無氧呼吸產(chǎn)生乳酸，而乳酸堆積會促使心肌細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，出現(xiàn)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變和功能障礙，引起細(xì)胞膜的通透性增大，促使LDH、CK釋放量增加[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，滇烏堿能使大鼠心肌組織中ROS和MDA水平顯著升高、SOD活性顯著降低，并使心肌細(xì)胞線粒體出現(xiàn)大小不均、腫脹、空泡等改變，這提示滇烏堿可引起心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞線粒體損傷。

線粒體是心肌細(xì)胞內(nèi)源性凋亡的調(diào)控中心，其功能主要受Bcl-2蛋白家族的影響，并以Bax和Bcl-2為主要影響因子。細(xì)胞受到凋亡信號刺激時，Bcl-2/Bax比值的高低決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡程序（Bcl-2/Bax比值異常降低時細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序）[17]。caspase-9啟動的細(xì)胞凋亡途徑為內(nèi)源性途徑（又稱為線粒體途徑），與線粒體損傷有關(guān)；caspase-3是關(guān)鍵的凋亡程序執(zhí)行分子，一旦cas‐pase-3被激活，凋亡程序便無法終止[18]。氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡間存在緊密聯(lián)系，心肌細(xì)胞氧化損傷時產(chǎn)生的大量ROS與線粒體DNA直接接觸，使DNA損傷后激活Bcl-2家族促凋亡蛋白在線粒體膜上表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2水平降低或Bax水平升高時，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，線粒體的膜電位消失，線粒體膜上大量細(xì)胞色素C釋放至細(xì)胞漿中，并激活caspase-9 酶原成為cleaved-caspase-9，cleaved-caspase-9又可激活下游的caspase-3成為cleaved-caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[20]。本研究結(jié)果顯示，滇烏堿給藥后可導(dǎo)致大鼠心肌細(xì)胞凋亡，降低其心肌組織中Bcl-2/Bax比值，并升高其心 肌 組 織 中 caspase-9、cleaved-caspase-9、caspase-3、cleaved-caspase-3蛋白相對表達(dá)水平，這提示滇烏堿可通過線粒體途徑促進(jìn)大鼠心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，滇烏堿可引起大鼠心肌細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與破壞心肌細(xì)胞膜的完整性，使心肌細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞通過線粒體途徑發(fā)生凋亡有關(guān)。但其對心臟毒性的具體作用機(jī)制還有待深入研究。