何瓔 ，凌勇根 ，趙洪慶 ，吳夢瑤 ，白璐 ，陳倩 ，周昊涵 ，王宇紅 （.湖南中醫(yī)藥大學科技創(chuàng)新中心，長沙 4008；.株洲千金藥業(yè)股份有限公司，湖南 株洲 4000）

功能失調性子宮出血（dysfunctional uterine bleeding，DUB）是一種常見的婦科疾病，癥狀表現(xiàn)為周期不規(guī)律的月經(jīng)出血[1]，患者身心健康和生活質量受到嚴重影響[2]。臨床上，DUB患者的主要治療手段為手術治療和藥物治療，但手術治療會對患者的生殖能力造成一定影響[3―4]，化學藥治療也有可能會出現(xiàn)頭痛、貧血和嘔吐等不良反應[5]。目前，使用中藥和傳統(tǒng)藥物也是治療DUB的方法之一，這些藥物毒副作用小，安全性普遍高于化學藥[1]。

婦科斷紅飲膠囊由赤芍、益母草、三七、仙鶴草、地榆炭、蒲黃炭6味中藥材組成，該方在涼血止血、化瘀調經(jīng)方面均有較好作用。方中赤芍清熱涼血，活血祛瘀；益母草“行血養(yǎng)血，行血而不傷新血，養(yǎng)血而不滯瘋血，誠為血家之圣藥也”，其功在活血調經(jīng)；三七為“止血之神藥”；仙鶴草能收斂止血；地榆炭、蒲黃炭涼血止血[6]。該產(chǎn)品在臨床上用于治療血熱內擾證DUB安全有效[6]，但關于其作用機制的科學研究報道仍較為匱乏。表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）在子宮內膜修復、誘導血管生成和止血中發(fā)揮著重要作用，其通過與細胞膜上的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）結合而發(fā)揮作用[7]。本研究擬通過建立大鼠DUB模型，探討婦科斷紅飲膠囊通過EGF-EGFR信號通路治療DUB的作用機制，為進一步明確其作用機制、推廣其臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：K960型梯度PCR儀（杭州晶格科學儀器有限公司），BioDrop μlite+/BioDrop DUO+型超微量核酸蛋白濃度檢測儀（英國BioDrop公司），T10BS25型全自動勻漿儀（德國IKA公司），ECO型PCR擴增儀（美國Illumina公司），Universal Hood 11型Chemi Doc XRS+Imager化學發(fā)光系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），Axioimage A2型正置顯微鏡（德國Zeiss公司），TGL-16G型普通臺式離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司），ZL9100C型全自動凝血分析儀（北京眾馳偉業(yè)科技有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

婦科斷紅飲膠囊（批號20200401，規(guī)格0.4 g）由株洲千金藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)；醋酸氫化可的松片（批號019200302，規(guī)格200 mg）購自上海上藥信誼藥廠有限公司；羥基脲片（批號112038LC，規(guī)格0.5 g）購自齊魯制藥有限公司；米非司酮片（批號140801，規(guī)格25 mg）、米索前列醇片（批號142816，規(guī)格50 mg）均購自浙江仙琚制藥股份有限公司；超純總RNA提取試劑盒（批號20211153）購自杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司；反轉錄試劑盒（批號05250410）、RT-qPCR試劑盒（批號05238502）、鼠源 β-肌動蛋白（β-actin）一抗（批號YM3028）購自安諾倫（北京）生物科技有限公司；兔源EGF一抗（批號PAB31668）、兔源EGFR一抗（批號PAB30732）均購自武漢華聯(lián)科生物技術有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗鼠IgG二抗（批號S00020）購自美國Affinity公司；HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（批號BS13278）購自南京巴傲得生物科技有限公司；PCR實驗中EGF、EGFR、低氧誘導因子1（hypoxiainducible factor 1α，HIF-1α）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（serine/threonine-protein kinase，AKT1）、甘油醛-3磷酸脫氫酶（GAPDH）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級SD大鼠，雌性30只（體質量250～300 g），雄性15只（體質量350～400 g），均購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（湘）2019-0004，質量合格證號為430727211100716136。購入后，將大鼠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心，使用許可證號為SYXK（湘）2019-0009。本實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查通過，倫理審查號為LLBH-202104080001。

2 方法

2.1 動物分組、造模與給藥

將SD大鼠按照雄雌數(shù)量1∶2的比例合籠4 d，檢查雌性大鼠陰栓與陰道涂片，有精子時記為大鼠妊娠第1天[8]。選取妊娠大鼠18只，采用隨機數(shù)字表法將其分為空白對照組、模型對照組和婦科斷紅飲膠囊組，每組6只。除空白對照組外，其余各組大鼠從妊娠第1天起，每天8：00灌胃羥基脲片（450 mg/kg），并皮下注射氫化可的松（3.7 mg/kg），持續(xù)7 d；妊娠第8天，每天8：00和18：00分別灌胃米非司酮片（8.5 mg/kg）和米索前列醇片（0.1 mg/kg），次日用棉簽檢測陰道出血情況，棉簽上有血跡說明DUB造模成功[9]。造模成功后第1天，婦科斷紅飲膠囊組大鼠灌胃婦科斷紅飲膠囊1.296 g/kg（臨床等效劑量的4倍劑量），空白對照組和模型對照組大鼠灌胃蒸餾水，灌胃體積均為10 mL/kg，每天1次，連續(xù)14 d。

2.2 一般狀態(tài)和臟器指數(shù)檢測

造模及給藥期間觀察各組大鼠行為狀態(tài)、毛發(fā)、二便、飲水飲食、出血等情況，稱定大鼠體質量。末次灌胃1 h后，麻醉大鼠，腹主動脈采血，置于含肝素鈉的血液采集管中，然后分離子宮和卵巢組織，稱質量。將部分組織置于多聚甲醛中保存用于病理分析，另一部分組織置于液氮中保存?zhèn)溆?。計算大鼠卵巢指?shù)和子宮指數(shù)：卵巢指數(shù)（mg/g）＝卵巢質量（mg）/體質量（g），子宮指數(shù)（mg/g）＝子宮質量（mg）/體質量（g）。

2.3 血液流變學指標檢測

取“2.2”項下血液，使用全自動凝血分析儀檢測全血高切相對指數(shù)、全血低切相對指數(shù)、紅細胞聚集指數(shù)、卡松黏度等血液流變學指標。

2.4 大鼠子宮和卵巢組織病理檢測

取充分固定的大鼠子宮和卵巢組織，石蠟包埋，以5 μm厚度連續(xù)切片，梯度乙醇脫水、浸蠟、水化、沖洗，采用蘇木精-伊紅（HE）進行染色，完成后將切片固定于載玻片上，中性樹脂封片，采用顯微鏡進行圖像采集，觀察各組大鼠子宮內膜及卵巢組織病理形態(tài)并拍照分析。

2.5 大鼠子宮組織中EGF-EGFR信號通路相關基因mRNA表達檢測

采用RT-qPCR法進行檢測。稱取1 g凍存的子宮組織，加入RNA提取液，冰上勻漿，提取組織中總RNA，檢測其純度。根據(jù)反轉錄試劑盒說明書步驟將RNA反轉錄成cDNA，然后以cDNA為模板進行PCR擴增。具體擴增條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內參，采用2－ΔΔCt法分析EGF、HIF-1α、EGFR、AKT1 mRNA的相對表達水平。引物序列及擴增產(chǎn)物大小見表1。

表1 引物序列及擴增產(chǎn)物大小

2.6 大鼠子宮組織中EGF、EGFR蛋白表達檢測

采用Western blot法進行檢測。取凍存的子宮組織適量，提取組織中總蛋白，采用BCA試劑盒檢測總蛋白含量。將蛋白高溫變性后上樣12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（電壓75 V，時間130 min），然后將蛋白轉移（恒流300 mA）至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉在室溫下封閉2 h，加入相應一抗[β-actin（稀釋度為1∶5 000）、EGF（稀釋度為1∶1 000）、EGFR（稀釋度為1∶2 000）]，4 ℃孵育過夜。次日用TBST液洗滌條帶4次，每次10 min，加入二抗（稀釋度為1∶5 000），室溫孵育4 h；TBST液洗4次，每次10 min，化學發(fā)光法顯影。應用Image J 1.51軟件分析條帶灰度值，根據(jù)目標蛋白和內參蛋白條帶灰度值的比值計算目標蛋白的相對表達水平。

2.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0和Graphpad Prism 8軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時使用LSD-t法進行組間兩兩比較，方差不齊時使用Tamhane’s T2法進行組間兩兩比較。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 婦科斷紅飲膠囊對模型大鼠一般狀態(tài)和臟器指數(shù)的影響

實驗過程中各組大鼠的飲食情況均較好?？瞻讓φ战M大鼠行為活動正常，墊料較干凈，陰道口無血跡；模型對照組大鼠狀態(tài)萎靡，陰道口有血跡，部分大鼠墊料上也有明顯血跡；婦科斷紅飲膠囊組大鼠行為活動較正常，出血量少，墊料上血跡少。與空白對照組比較，模型對照組大鼠子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)均顯著升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，婦科斷紅飲膠囊組大鼠子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表2。

表2 各組大鼠子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)測定結果（±s，n＝6，mg/g）

表2 各組大鼠子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)測定結果（±s，n＝6，mg/g）

a：與空白對照組比較，P＜0.01；b：與模型對照組比較，P＜0.05；c：與模型對照組比較，P＜0.01

卵巢指數(shù)0.63±0.04 0.91±0.20a 0.70±0.07b組別空白對照組模型對照組婦科斷紅飲膠囊組子宮指數(shù)1.78±0.24 2.24±0.15a 1.57±0.20c

3.2 婦科斷紅飲膠囊對模型大鼠血液流變學指標的影響

與空白對照組比較，模型對照組大鼠全血高切相對指數(shù)、全血低切相對指數(shù)均顯著降低（P＜0.05），紅細胞聚集指數(shù)顯著升高（P＜0.01）。與模型對照組比較，婦科斷紅飲膠囊組大鼠全血高切相對指數(shù)顯著升高（P＜0.05），紅細胞聚集指數(shù)顯著降低（P＜0.05）。結果見表3。

表3 各組大鼠血液流變學指標檢測結果（±s，n＝6）

表3 各組大鼠血液流變學指標檢測結果（±s，n＝6）

a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與空白對照組比較，P＜0.01；c：與模型對照組比較，P＜0.05

卡松黏度4.59±0.65 4.76±0.34 3.96±0.88組別空白對照組模型對照組婦科斷紅飲膠囊組全血高切相對指數(shù)6.94±1.39 5.42±0.61a 6.64±1.01c全血低切相對指數(shù)88.77±32.41 66.91±3.93a 80.80±5.97紅細胞聚集指數(shù)9.42±2.02 13.90±0.89b 11.50±1.32c

3.3 婦科斷紅飲膠囊對模型大鼠子宮和卵巢組織病理形態(tài)的影響

3.3.1 子宮HE染色結果 空白對照組大鼠子宮內膜上皮完整，間質內各結構清楚、形態(tài)正常；模型對照組大鼠子宮內膜上皮完整，間質內有大量淋巴細胞及嗜酸性粒細胞浸潤；婦科斷紅飲膠囊組大鼠子宮內膜上皮完整，間質內有少量嗜酸性粒細胞浸潤。結果見圖1。

圖1 各組大鼠子宮組織形態(tài)觀察結果（HE染色，×100）

3.3.2 卵巢HE染色結果 空白對照組大鼠卵巢組織結構清楚、形態(tài)正常，實質內可見各卵泡及黃體發(fā)育正常；模型對照組大鼠卵巢組織實質內可見各卵泡及黃體發(fā)育正常，靜脈增多并大量淤血，卵巢門部可見炎癥細胞浸潤；婦科斷紅飲膠囊組大鼠卵巢組織結構清楚、形態(tài)正常，實質內可見各卵泡及黃體發(fā)育正常，僅有少量靜脈擴張及淤血。結果見圖2。

圖2 各組大鼠卵巢組織形態(tài)觀察結果（HE染色，×100）

3.4 婦科斷紅飲膠囊對模型大鼠EGF-EGFR信號通路相關基因mRNA表達的影響

與空白對照組比較，模型對照組大鼠子宮組織中EGF、HIF-1α、AKT1、EGFR mRNA相對表達水平均顯著降低（P＜0.05）。與模型對照組比較，婦科斷紅飲膠囊組大鼠子宮組織中EGF、HIF-1α、EGFR mRNA相對表達水平均顯著升高（P＜0.05或 P＜0.01）；AKT1 mRNA相對表達水平有所上升，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結果見表4。

表4 各組大鼠子宮組織EGF-EGFR通路相關基因mRNA相對表達水平檢測結果（±s，n＝6）

表4 各組大鼠子宮組織EGF-EGFR通路相關基因mRNA相對表達水平檢測結果（±s，n＝6）

a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與模型對照組比較，P＜0.05；c：與模型對照組比較，P＜0.01

EGFR mRNA 1.14±0.54 0.70±0.15a 1.20±0.08c組別空白對照組模型對照組婦科斷紅飲膠囊組EGF mRNA 1.01±0.71 0.71±0.06a 1.08±0.31b HIF-1α mRNA 1.30±0.46 0.49±0.25a 4.24±0.87c AKT1 mRNA 1.03±0.29 0.74±0.08a 0.83±0.11

3.5 婦科斷紅飲膠囊對模型大鼠EGF、EGFR蛋白表達的影響

與空白對照組比較，模型對照組大鼠子宮組織中EGF、EGFR蛋白相對表達水平均顯著降低（P＜0.01）。與模型對照組比較，婦科斷紅飲膠囊組大鼠子宮組織中EGF、EGFR蛋白相對表達水平均顯著升高（P＜0.01）。結果見圖3、表5。

圖3 各組大鼠子宮組織中 EGF、EGFR蛋白相對表達檢測的電泳圖

表5 各組大鼠子宮組織中EGF、EGFR蛋白相對表達水平檢測結果（±s，n＝6）

表5 各組大鼠子宮組織中EGF、EGFR蛋白相對表達水平檢測結果（±s，n＝6）

a：與空白對照組比較，P＜0.01；b：與模型對照組比較，P＜0.01

組別空白對照組模型對照組婦科斷紅飲膠囊組EGF/β-actin 0.45±0.01 0.30±0.08a 0.63±0.11b EGFR/β-actin 0.66±0.19 0.23±0.14a 0.53±0.03b

4 討論

大量研究表明，子宮和卵巢功能紊亂與DUB密切相關[10]。有研究證明，更年期女性卵巢功能不穩(wěn)定，因此在更年期DUB的發(fā)病率更高，而通過促進子宮內膜萎縮變薄，可減少子宮出血，改善更年期女性的DUB[11]。有研究指出，EGF-EGFR信號通路及其相關靶點磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）、AKT、HIF-1α與DUB的發(fā)病機制密切相關[12]。EGF與子宮內膜的微環(huán)境之間有著密切聯(lián)系，對子宮內膜血管的再生有促進作用，同時其可促進子宮創(chuàng)面修復，起到止血的作用[13]。HIF-1α是EGF的上游靶點，HIF-1α和EGF的表達水平呈正相關[14]。EGF對EGFR的表達具有一定的調節(jié)作用，EGF與EGFR結合后，可以有效地抑制卵巢組織中卵泡細胞凋亡，促進顆粒細胞增殖[15]。EGFR可激活PI3K，進一步促進AKT磷酸化，從而促進子宮內膜細胞增殖及抑制子宮出血[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，婦科斷紅飲膠囊可以調控DUB模型大鼠異常的血液流變學指標，改善其子宮和卵巢腫大，降低其子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)，減輕其子宮中大量淋巴細胞、嗜酸性粒細胞浸潤及卵巢靜脈增多等病理變化。RT-qPCR檢測結果顯示，模型對照組大鼠子宮組織中EGF、EGFR、HIF-1α、AKT1 mRNA的表達較空白對照組顯著下調，婦科斷紅飲膠囊組大鼠EGF、EGFR、HIF-1α、AKT1 mRNA的表達較模型對照組均不同程度上調。根據(jù)Western blot檢測結果可知，模型對照組大鼠子宮組織中EGF、EGFR蛋白表達較空白對照組顯著下調，婦科斷紅飲膠囊組大鼠子宮組織中EGF、EGFR蛋白表達較模型對照組顯著上調。研究結果提示，婦科斷紅飲膠囊給藥后激活了EGF-EGFR信號通路。

綜上所述，婦科斷紅飲膠囊對DUB模型大鼠具有一定的改善作用，其機制可能與激活EGF-EGFR信號通路有關，但其更多的作用機制還需進一步研究。