趙詩睿，奚志嬡，孟德梅，2*，生吉萍

（1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.天津捷盛東輝保鮮科技有限公司，天津 300300；3.中國人民大學(xué)農(nóng)業(yè)與農(nóng)村發(fā)展學(xué)院，北京 100872）

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）是目前世界上人工栽培種植范圍廣、產(chǎn)量高的食用菌之一，不僅富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等高營養(yǎng)物質(zhì)，而且具有低熱量、低脂肪、味道鮮美等優(yōu)點[1]，深受消費者的青睞。雙孢蘑菇主要以市場鮮銷為主，但其水分含量高、呼吸強(qiáng)度大、組織脆嫩，導(dǎo)致采后貯藏期僅有1 d～3 d，嚴(yán)重降低了產(chǎn)品的營養(yǎng)價值和商業(yè)價值[2-3]。采后持續(xù)發(fā)育是導(dǎo)致雙孢蘑菇采后品質(zhì)損失的一個重要原因，在此過程中不僅出現(xiàn)菌膜破裂，成熟菌褶暴露，菌蓋開傘等變化，同時菌體釋放孢子不斷消耗子實體中的養(yǎng)分，造成營養(yǎng)物質(zhì)在一定程度上出現(xiàn)遷移或缺乏，從而導(dǎo)致雙孢蘑菇的感官品質(zhì)與營養(yǎng)價值大大降低[4-5]。因此，闡明雙孢蘑菇采后持續(xù)發(fā)育的機(jī)制，特別是對其分子調(diào)控機(jī)制的研究，對于開發(fā)更為有效的雙孢蘑菇保鮮方法具有重要的作用。

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors，TF）是一類可以通過與目標(biāo)基因上游特定DNA序列中的順式反應(yīng)元件相互作用而激活或抑制其下游基因表達(dá)的一種蛋白質(zhì)分子，在調(diào)節(jié)植物次生代謝途徑中多種基因協(xié)同表達(dá)發(fā)揮著重要作用[6]。bHLH型轉(zhuǎn)錄因子在真核生物中存在十分廣泛，在轉(zhuǎn)錄因子家族中占有重要的地位，是植物體內(nèi)第二大類轉(zhuǎn)錄因子家族。目前，已從各種光合真核生物中鑒定出2 400多個bHLH基因[7]。研究表明，bHLH轉(zhuǎn)錄因子在植物的許多重要生理過程，如生長發(fā)育、次生途徑代謝產(chǎn)物的合成與調(diào)控、抗逆反應(yīng)等過程中發(fā)揮了越來越多的作用，成為近年來研究的熱點，其作用機(jī)理主要在于通過與靶基因啟動子上的特定基因位點發(fā)生特異性結(jié)合，來轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的表達(dá)[8-9]。例如，Zhu等[10]研究發(fā)現(xiàn)典型bHLH轉(zhuǎn)錄因子SlPRE2的過表達(dá)不僅促進(jìn)了番茄幼苗的形態(tài)發(fā)育，而且減少了果實中色素的積累。與此類似，擬南芥中bHLH轉(zhuǎn)錄因子LoUDT1的過表達(dá)會導(dǎo)致花藥發(fā)育異常和花粉缺陷[11]。此外，Lu等[12]研究GhbHLH/HLH基因通過油菜素類固醇信號通路在棉花纖維發(fā)育中的特定作用。然而，bHLH轉(zhuǎn)錄因子在食用菌的采后繼續(xù)發(fā)育和衰老及脅迫反應(yīng)中是否發(fā)揮著同樣重要的作用，其調(diào)控機(jī)制如何等均不清晰。

目前，關(guān)于bHLH轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控動植物生長發(fā)育和對抗各種脅迫過程中的功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理已經(jīng)得到了大量研究，但是bHLH轉(zhuǎn)錄因子在食用菌領(lǐng)域的研究卻鮮有報道。因此，本文首次克隆鑒定雙孢蘑菇中的AbbHLH基因，并制備AbbHLH轉(zhuǎn)錄因子的多克隆抗體，為進(jìn)一步探究其在雙孢蘑菇采后繼續(xù)發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

大腸桿菌 E.coli XL1-blue、E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞、pET-28a（+）空載質(zhì)粒：天津科技大學(xué)食品營養(yǎng)與安全重點實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

LBK培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉10 g/L、卡那霉素100 mg/L、pH7.0；LBK固體培養(yǎng)基另添加15 g/L瓊脂粉。

oligod（T）18引物：日本 Takara 公司；尿素、三羥甲基氨基甲烷[Tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸[4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonic acid，Hepes]、二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）、苯甲磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluo ride，PMSF）、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）：北京索萊寶科技有限公司；pfu高保真聚合酶和限制性內(nèi)切酶及相關(guān)緩沖液：北京全式金生物技術(shù)有限公司；T4DNA連接酶及相關(guān)緩沖液：美國Thermo Fisher Scientific公司；弗式不完全佐劑、弗式完全佐劑：美國Sigma公司；Protein A SepHaroseTMCL-4B填料、CNBr-activated SepHaroseTM4 Fast Flow抗體純化介質(zhì)、Ni SepHaroseTM6 Fast Flow親和純化介質(zhì)：美國GE Healthcare公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔抗體：美國Jackson Immune Research公司；化學(xué)發(fā)光法EMSA試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要溶液配制

磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）：0.016 2 mol/L Na2HPO4、0.003 8 mol/L NaH2PO4、0.5 mol/L NaCl，pH7.4；漂洗液：1 mol/L 尿素、0.02 mol/L 咪唑，PBS定容；結(jié)合液：8 mol/L尿素、0.02 mol/L咪唑，PBS定容；洗脫液：8 mol/L尿素、0.5 mol/L咪唑，PBS定容；透析液母液：0.06 moL/L KCl、0.05 moL/L Tris、0.001 moL/L EDTA、0.012 moL/L Hepes、0.001 moL/L DTT、0.001 moL/L PMSF，pH7.4；包被液：0.01 mol/L Na2CO3、0.03 mol/L Na2CO3、pH9.6；Protein A 結(jié) 合 液 ：0.05 mol/L Tris、0.075 mol/L NaCl，pH7.0；Protein A 洗脫液：0.1 mol/L 甘氨酸、0.15 mol/L NaCl，pH2.5；CNBr結(jié)合液：0.1 mol/L NaHCO3、0.5 mol/L NaCl，pH8.3。

1.2 儀器與設(shè)備

9902 PCR儀：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)有限公司；Syner－gyH1/H1MF多功能酶標(biāo)儀：美國伯騰儀器生產(chǎn)有限公司；BG-verMINI蛋白電泳儀：北京百晶生物技術(shù)有限公司；ZXDP-B2120電熱恒溫箱：上海智誠分析儀器制造公司；906超低溫冰箱：美國Thermo公司；ChampGel 50000凝膠成像儀、ChampGeI 5000 WB掃膜儀：北京賽智科技有限公司；5424R冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；HYC-940 4℃醫(yī)用冷藏柜：青島海爾特種電器有限公司；JY92-IIDN超聲波細(xì)胞破碎儀：天津億灣生物技術(shù)科技商貿(mào)公司。

1.3 實驗動物

新西蘭大白兔[生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2015-0015]：北京斯貝福生物技術(shù)有限公司。

1.4 AbbHLH編碼區(qū)全長基因的克隆

根據(jù)雙孢蘑菇全基因組的測序結(jié)果及原核表達(dá)載體pET-28a（+）圖譜，使用Premier5.0軟件對AbbHLH基因（Genebank號：XP_007326351.1）進(jìn)行引物設(shè)計，并分別加入酶切位點EcoR I和Hind III，如表1所示。

表1 擴(kuò)增AbbHLH所用引物序列Table 1 Primer sequences used for PCR amplification of AbbHLH gene

以反轉(zhuǎn)錄后的雙孢蘑菇互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA）為模板，利用表1中設(shè)計的特異性引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增AbbHLH基因，再用限制酶EcoR I和Hind III進(jìn)行雙酶切，將目的基因回收。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為95℃ 2 min、95℃ 30 s、58℃ 1 min、72℃ 1 min，35個循環(huán)；終延伸在72℃10 min為宜。反應(yīng)結(jié)束后，取2 μL所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.1%瓊脂糖凝膠電泳分析，用DNA純化回收試劑盒將結(jié)果中條帶大小正確的PCR產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步純化。

1.5 pET-28a（+）-AbbHLH原核表達(dá)載體構(gòu)建

將pET-28a（+）空載質(zhì)粒和經(jīng)PCR回收的目的片段分別用限制性酶EcoR I和Hind III在37℃恒溫條件下雙酶切3 h，再將分別獲得了黏性末端的載體和目的片段按照物質(zhì)的量1∶3的配比混合，在T4DNA連接酶的作用下保持4℃連接8 h～12 h。然后通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法，把重組質(zhì)?；D(zhuǎn)入E.coli XL1-blue感受態(tài)細(xì)胞中，再從中挑取單克隆分別接種到LBK固體培養(yǎng)基中，保持37℃恒溫培養(yǎng)8 h～12 h[13]。提取質(zhì)粒，用限制性酶EcoR I和Hind III做雙酶切驗證，其中驗證正確的部分質(zhì)粒由金唯智生物科技有限公司進(jìn)行質(zhì)粒測序，將驗證測序正確的質(zhì)粒命名為pET-28a（+）-AbbHLH。

1.6 重組蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法，將pET-28a（+）-AbbHLH導(dǎo)入大腸桿菌E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，于37℃在LBK平板上培養(yǎng)12 h。挑取單克隆，并于LBK液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h～12 h，然后將其按1∶20（體積比）轉(zhuǎn)到新鮮LBK液體培養(yǎng)基中繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，直至培養(yǎng)液OD600為0.6～0.8內(nèi)。之后加入IPTG誘導(dǎo)劑（終濃度0.4 mmol/L），于25℃、220 r/min條件下誘導(dǎo)20 h使蛋白得到大量表達(dá)，同時設(shè)置無IPTG誘導(dǎo)劑的對照組。誘導(dǎo)結(jié)束后用PBS緩沖溶液重懸菌體沉淀，再離心（8 000 r/min，15 min）收集菌體，反復(fù)3次以充分清洗菌體。最后用PBS緩沖溶液將菌體溶解，超聲破碎獲得全蛋白，經(jīng)離心（8 000 r/min，15 min）后分別收集沉淀和上清液，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析[14-15]。

1.7 重組蛋白純化

收集超聲裂解后的包涵體蛋白，用漂洗液重懸后，進(jìn)行8 000 r/min、15 min離心處理，棄掉上清液，重復(fù)3次以去掉部分雜蛋白。然后將蛋白沉淀溶解在結(jié)合液中，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后將濾液結(jié)合到預(yù)先處理好的Ni SepHaroseTM6 Fast Flow純化柱中，置于搖床上于4℃下結(jié)合2 h。待流穿液排干后，用結(jié)合液反復(fù)洗滌柱子，直到無蛋白從洗滌液中流出。最后用洗脫液重復(fù)洗脫目的蛋白，取樣后用SDS-PAGE電泳分析蛋白純度，將洗脫液置于-80℃下保存?zhèn)溆肹16-18]。

1.8 重組蛋白復(fù)性

將純化后的重組蛋白用洗脫液稀釋后，放入預(yù)先處理好的透析袋中，并用夾子夾緊。將樣品置于4℃磁力攪拌器上分別于透析液I（含6 mol/L尿素）、II（含4 mol/L尿素）、III（含2 mol/L尿素）、IV（含1.5 mol/L尿素）、V（含1 mol/L尿素）、VI（含0.5 mol/L尿素）和透析液母液中各透析1次，每次12 h，且每次換液前取樣用于SDS-PAGE電泳分析。將復(fù)性后的蛋白溶液加入到過膜水沖洗過的超濾管中，離心濃縮（3 500 r/min，4℃）后用Bradford法測定濃縮后蛋白的濃度，直至濃度達(dá)到0.5 μg/mL后停止?jié)饪s，蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，再用ImageJ 1.51軟件進(jìn)行灰度分析，蛋白純度大于80%的樣品置于-80℃下保存?zhèn)溆肹19]。

1.9 多克隆抗體制備

首次免疫取400 μg純化后的重組蛋白樣品稀釋后，加入等體積的弗氏完全佐劑并混勻，充分乳化后多點背部皮下注射免疫實驗動物新西蘭大白兔，設(shè)置免疫前兔子耳靜脈血作為陰性對照。加強(qiáng)免疫時，向200 μg蛋白樣品中加入等體積的弗氏不完全佐劑混勻，每間隔10 d加強(qiáng)1次免疫，共進(jìn)行3次加強(qiáng)免疫。最末次免疫1周后，取兔子耳靜脈血用來檢測抗體的效價，當(dāng)效價達(dá)到20 000以上后，用麻醉劑麻醉兔子，取頸動脈血，于5 000 r/min離心20 min，收集30 mL血清，于-80 ℃下凍存[20]。

1.10 抗體效價的檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附測定法測定抗血清效價[21-22]。一抗為免疫后兔血清，將純化后的抗原用包被液稀釋至濃度為 2 μg/mL，加至 96孔板（100 μL/孔），4 ℃包被8 h～12 h；用 PBST（含 0.05%（體積分?jǐn)?shù)）Tween-20的PBS，pH7.4）洗滌2次，10%脫脂乳37℃恒溫孵育2 h；將多抗血清用PBS溶液進(jìn)行梯度稀釋，設(shè)置空白對照為只加PBS，設(shè)置陰性對照為1∶200稀釋的陰性血清，各組均加入酶標(biāo)板中于37℃恒溫孵育1 h，后用PBST溶液洗滌3次。二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶20 000稀釋），先在37℃恒溫孵育1 h，取出后用 PBST 溶液洗滌 3 次。經(jīng)過 3，3′，5，5′，-四甲基聯(lián)苯胺顯色后用酶標(biāo)儀測定OD450時的吸光值，當(dāng)試驗組與陰性對照組血清的OD450比值＞2.0時為陽性，最大OD值的1/2對應(yīng)稀釋倍數(shù)即為抗血清效價。

1.11 多克隆抗體的純化及特異性分析

1.11.1 Protein A純化

用Protein A結(jié)合液稀釋血清樣品，過0.22 μm的水系濾膜除去血清中的細(xì)胞殘渣和小顆粒雜質(zhì)后，將濾液樣品注入以Protein A SepharoseTMCL-4B為填料的結(jié)合柱中，充分混勻后于25℃結(jié)合2 h。結(jié)合完成后用Protein A結(jié)合液沖洗柱子，直至流出的溶液中無蛋白為止。再用Protein A洗脫液重復(fù)洗脫以獲得較高純度抗體，用Western Blotting檢測純化后抗體特異性。

1.11.2 CNBr純化

將CNBr-activated SepHaroseTM4 Fast Flow填料加入結(jié)合柱預(yù)處理，用CNBr結(jié)合液平衡至pH8.3后，將純化后的抗原蛋白加入柱中混勻，置于搖床上4℃結(jié)合8 h～12 h。結(jié)合后用CNBr結(jié)合液反復(fù)沖洗柱子，直至流出液中無蛋白測出，然后加入Tris-HCl（0.1 mol/L，pH8.0）25℃封閉4 h。之后依次用溶液1（0.1 mol/L Tris、0.5 mol/L NaCl，pH3.5）及溶液 2（0.2 mol/L Gly、1 mol/L NaCl，pH3.5）交替沖洗，將柱中填料調(diào)至中性，最后用Protein A結(jié)合液平衡柱子。將Protein A純化后的血清抗體加入柱子中，與抗原蛋白25℃室溫下結(jié)合2 h，結(jié)合完成后收集洗脫液，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析抗體純度。每毫升純化完的抗體中加入300 μL 30%的甘油和10 μL 1%的NaN3，分裝后貯存于-80℃冰箱中，用Western Blotting檢測抗體特異性。

1.11.3 Western Blotting檢測抗體特異性

取20 μg經(jīng)Bradford[23]法定量的雙孢蘑菇全蛋白，待SDS-PAGE電泳結(jié)束后，于40 V電壓下轉(zhuǎn)膜1 h，洗膜后加入10 mL 10%脫脂乳粉，置于4℃的水平搖床上密封12 h～18 h。加入一抗（Anti-AbbHLH多克隆抗體，1∶10 000稀釋），放入水平搖床中室溫25℃孵育1 h。取出后用TBST緩沖液（含體積分?jǐn)?shù)0.05%Tween-20的 TBS，pH7.5）洗膜 3次，再加入 1 μL 二抗（HRP 標(biāo)記的羊抗兔抗體，1∶10 000稀釋），放于搖床上室溫25℃孵育1 h，用TBST緩沖液沖洗膜3次，最后用ECL顯色試劑盒進(jìn)行顯色[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 AbbHLH目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

基因AbbHLH的擴(kuò)增見圖1。

圖1 基因AbbHLH的擴(kuò)增Fig.1 Full length amplification of AbbHLH gene

由圖1可知，得到了片段大小為1 600 bp左右的PCR產(chǎn)物，與預(yù)期基本一致。

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

重組表達(dá)載體的雙酶切驗證見圖2。

圖2瓊脂糖凝膠電泳表明獲得大小分別為1600bp和7 000 bp左右的基因片段，且大小和預(yù)期相符。經(jīng)質(zhì)粒測序后結(jié)果表明：成功克隆得到一條大小為1 599 bp的基因片段，該片段與雙孢蘑菇AbbHLH基因cDNA片段一致性達(dá)到99.37%，且未發(fā)現(xiàn)任何氨基酸突變，說明重組質(zhì)粒pET-28a（+）-AbbHLH構(gòu)建成功。

圖2 重組表達(dá)載體的雙酶切驗證Fig.2 Double digestion verification of recombinant plasmid pET-28a（+）-AbbHLH

2.3 重組質(zhì)粒的原核表達(dá)

重組蛋白6×His-AbbHLH的誘導(dǎo)表達(dá)見圖3。

圖3 重組蛋白6×His-AbbHLH的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.3 SDS-PAGE analysis of the expression of the recombinant protein 6×His-AbbHLH

由圖3可知，將IPTG誘導(dǎo)前后的全細(xì)胞表達(dá)結(jié)果進(jìn)行對比后可以看出，含有6×His的AbbHLH蛋白在誘導(dǎo)后的表達(dá)量約為70 kDa。對誘導(dǎo)后的菌體進(jìn)行超聲破碎后，收集上清液和破碎沉淀分別經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示出6×His-AbbHLH融合蛋白主要以包涵體的形式存在。

2.4 融合蛋白的純化及復(fù)性

SDS-PAGE檢測親和純化后的融合蛋白見圖4。

由圖4可知，純化后的融合蛋白純度達(dá)80%，較純化前有了明顯提高。

圖4 SDS-PAGE檢測親和純化后的融合蛋白Fig.4 SDS-PAGE analysis of the affinity purification of recombinant protein

融合蛋白之所以表達(dá)在包涵體中可能是由于菌體產(chǎn)生蛋白的速度過快而無足夠的時間形成正確空間結(jié)構(gòu)，二硫鍵沒有正確配對[25]，從而導(dǎo)致蛋白之間發(fā)生了非特異性結(jié)合，使其溶解度和活性降低，因此需要將純化后的蛋白進(jìn)行梯度透析以恢復(fù)其活性狀態(tài)。純化后蛋白的復(fù)性及濃縮見圖5。

圖5 純化后蛋白的復(fù)性Fig.5 Renaturation of purified protein

由圖5可知，重組蛋白在透析過程中較穩(wěn)定，基本無降解。將復(fù)性后的蛋白用超濾管于4℃下濃縮以提高蛋白濃度，再用SDS-PAGE檢測，經(jīng)Image J灰度軟件分析，其結(jié)果見圖6。

圖6 純化后蛋白的濃縮Fig.6 Concentration of purified protein

由圖6可知，融合蛋白純度達(dá)到了80%，經(jīng)Bradford法測定濃縮后的蛋白濃度可達(dá)0.5 mg/mL，能夠用于后續(xù)免疫動物實驗的抗原。

2.5 多克隆抗體制備

間接酶聯(lián)免疫吸附測定法測定抗血清的效價見圖7。

圖7 間接ELISA法測定抗血清的效價Fig.7 Determination of the antiserum titer with ELISA method

由圖7可知，Anti-AbbHLH多克隆抗體的效價為102 400。

2.6 多克隆抗體純化與特異性分析

Western Blotting檢測Anti-AbbHLH的特異性見圖8。

圖8 Western Blotting檢測Anti-AbbHLH的特異性Fig.8 The specificity of anti-AbbHLH was detected by Western Blotting

由圖8可知，相對分子質(zhì)量為70kDa左右出現(xiàn)了明顯的條帶，分子量大小與預(yù)期一致，說明Anti-AbbHLH多克隆抗體制備成功。通過Western Blotting實驗對Protein A純化后的抗體進(jìn)行特異性檢測，發(fā)現(xiàn)抗體中大部分的雜帶已被去除，但仍含有部分非特異性結(jié)合的抗體。將CNBr純化后的抗體進(jìn)行Western Blotting檢測，結(jié)果顯示純化后的抗體可與貯藏后0 h與2 h的雙孢蘑菇AbbHLH蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，在約70 kDa處出現(xiàn)明顯的條帶，且基本無其它雜帶，表明得到了高純度、特異性強(qiáng)的多克隆抗體。

3 結(jié)論

本文成功獲得了以包涵體形式存在的6×His-AbbHLH融合蛋白，經(jīng)純化復(fù)性后得到純度大于80%的水溶性抗原蛋白，用此抗原蛋白免疫新西蘭大白兔得到了效價為102 400的AbbHLH轉(zhuǎn)錄因子的多克隆抗體，用Protein A及CNBr對抗體進(jìn)行親和純化后，用Western Blotting檢測該抗體能夠特異性識別采后不同貯藏時期雙孢蘑菇中的AbbHLH蛋白，表明所制備的多克隆抗體可用于雙孢蘑菇體內(nèi)的AbbHLH蛋白檢測，為bHLH轉(zhuǎn)錄因子在雙孢蘑菇采后繼續(xù)發(fā)育中的作用機(jī)制的闡明提供了重要方法支持。