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        奶渣酪蛋白特性及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值分析

        2022-12-13 03:55:52許涌捷王冠華伍昌軍劉衛(wèi)震隋文杰
        食品研究與開(kāi)發(fā) 2022年23期
        關(guān)鍵詞:酪蛋白多肽氨基酸

        許涌捷,王冠華,伍昌軍,劉衛(wèi)震,隋文杰*

        (1.天津科技大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,食品科學(xué)與工程學(xué)院,天津 300457;2.天津科技大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院,天津 300457;3.湖北百特威生物科技有限公司,湖北 仙桃 433099)

        牦牛乳又被稱(chēng)為“天然濃縮乳”,含有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),如蛋白質(zhì)、維生素、鈣以及乳糖等,是高原地區(qū)各族人民重要的食品和乳品加工原料[1-2]。奶渣是牦牛乳提取酥油后留下的一種副產(chǎn)物,由提制酥油后的脫脂乳經(jīng)加熱后凝固沉淀、過(guò)濾、曬干制得,呈淡黃色塊狀[3-4]。奶渣作為一種副產(chǎn)品,產(chǎn)量高并且價(jià)格低,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富,富含蛋白質(zhì)、乳糖、礦物質(zhì)及多種維生素[5-6]。林亞秋等[7]測(cè)得牦牛奶渣的脂肪含量和蛋白質(zhì)含量分別為1.69%與63.92%,并且含有16種水解氨基酸,必需氨基酸含量豐富,具有高蛋白、低脂肪的特點(diǎn),可作為優(yōu)質(zhì)蛋白來(lái)源。鄭旭華等[8]利用堿溶酸沉的方法從奶渣中提取干酪素,并通過(guò)調(diào)節(jié)顆粒度、含脂率、水分含量等獲得高品質(zhì)干酪素。李玉萍等[9]探究九龍牦牛奶渣的氨基酸含量和蛋白組成分析,測(cè)得九龍牦牛奶渣中總氨基酸含量約為36.5%,蛋白組分以酪蛋白為主,比例約為82%。李進(jìn)波等[5]對(duì)牦牛奶渣理化成分及干酪素生產(chǎn)工藝進(jìn)行研究,確定奶渣生產(chǎn)干酪素的最佳工藝參數(shù)。目前對(duì)奶渣的研究局限于奶渣基本組分的測(cè)定和生產(chǎn)干酪素的工藝研究,并沒(méi)有對(duì)奶渣酪蛋白的理化性質(zhì)和功能特性進(jìn)行系統(tǒng)分析評(píng)價(jià),并且奶渣相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)也有限,大多為奶渣制備干酪素和蛋白肽,利用價(jià)值較低,本研究對(duì)奶渣中酪蛋白的理化特性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行了系統(tǒng)分析,深入研究了奶渣酪蛋白的各項(xiàng)理化性質(zhì),對(duì)于提高奶渣的附加值和經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。

        本文以牦牛奶渣為原料,通過(guò)堿溶酸沉的方法分離奶渣酪蛋白,采用多種分析表征手段,對(duì)所提取酪蛋白純度、溶解度、乳化性、表面疏水性、交聯(lián)度、熱穩(wěn)定性、分子量以及氨基酸含量和潛在活性多肽片段進(jìn)行分析,并與市售酪蛋白進(jìn)行對(duì)比,為實(shí)現(xiàn)奶渣的高值化利用及相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論支持。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        奶渣:四川甘孜藏族自治州理塘縣;市購(gòu)酪蛋白1:新西蘭恒天然公司;市購(gòu)酪蛋白2:湖北百特威生物科技有限公司;谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(30 000 U/g):山東元泰生物工程有限公司;十二烷基硫酸鈉(sodium lauryl sulfate,SDS)、8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS)、鄰苯二甲醛、Tris-甘氨酸、電泳制膠液、蛋白Marker:北京索萊寶科技有限公司;氫氧化鈉(分析純)、鹽酸(分析純)、石油醚(分析純)、Tris-鹽酸緩沖溶液(分析純)、甲酸(色譜純)、乙腈(色譜純):國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        高速離心機(jī)(H1850):湖南湘儀有限公司;冷凍干燥機(jī)(Scientz-10N/A):寧波新芝生物科技股份有限公司;凱氏定氮儀(Kjeltec):福特(中國(guó))有限公司;傅里葉紅外光譜儀(IS50):美國(guó)尼高利儀器公司;熱重分析儀(TGAQ50):美國(guó) TA 儀器公司;電泳儀(DYY-8C):北京市六一儀器廠(chǎng);熒光分光光度計(jì)(F-7000):日本日立公司。

        1.3 奶渣酪蛋白提取及其理化性質(zhì)測(cè)定

        1.3.1 奶渣酪蛋白的提取

        取1 g奶渣,加入100 mL蒸餾水,用1%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為7.5,待完全溶解后,放入高速離心機(jī)10 000 r/min離心5 min,除去不溶性雜質(zhì)和脂肪,取上清液置于燒杯中,然后用1%鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值為 4.6,離心(10 000 r/min、5 min、25 ℃),取沉淀,多次水洗后去除乳糖,于105℃干燥4 h,得到奶渣酪蛋白,經(jīng)過(guò)一次脫脂、堿溶酸沉得到奶渣酪蛋白1,經(jīng)過(guò)兩次脫脂、堿溶酸沉得到奶渣酪蛋白2。

        1.3.2 基本組分的測(cè)定

        蛋白質(zhì)含量的測(cè)定參照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》;脂肪含量的測(cè)定方法參照GB 5009.6—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測(cè)定》;水分含量的測(cè)定參照GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》;灰分含量的測(cè)定參照GB 5009.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測(cè)定》;乳糖含量的測(cè)定參照GB 5413.5—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中乳糖、蔗糖的測(cè)定》。

        1.3.3 溶解度測(cè)定

        參考Chattaraj等[10]的方法測(cè)定蛋白質(zhì)的溶解度。分別配制不同pH值的Tris-鹽酸緩沖溶液(0.1 mol/L,pH2.0~11.0),取 0.2g酪蛋白樣品溶于100 mL Tris-鹽緩沖溶液中,8000r/min離心15min,取上清液,參照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的方法測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)含量,計(jì)算不同pH值下酪蛋白的溶解度,其計(jì)算公式如下。

        1.3.4 乳化性的測(cè)定

        參考趙城彬等[11]的方法測(cè)定蛋白乳化性。取5 mL菜籽油與15 mL待測(cè)樣品溶液,均質(zhì)1 min,取100 μL混合液,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%SDS溶液稀釋至10 mL,在500 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。將乳狀液靜置10 min后再以同樣的方法稀釋并測(cè)定,得到的吸光度A1與初始吸光度A0用來(lái)衡量乳化活力指數(shù)(emulsification activity index,EAI)與乳狀液穩(wěn)定性(end system identifier,ESI)。EAI與ESI計(jì)算公式如下。

        式中:EAI為每克蛋白質(zhì)的乳化面積,m2/g;C為溶液中樣品蛋白的濃度,1 g/mL;L為比色杯直徑1 cm;A為500 nm處的吸光度;N為稀釋倍數(shù);Φ為油相所占的分?jǐn)?shù);ESI為乳狀液穩(wěn)定性,%;A0為初始吸光度;A1為10 min后的吸光度。

        1.3.5 表面疏水性的測(cè)定

        參考Zhang等[12]的方法測(cè)定表面疏水性。將待測(cè)樣品溶液溶解于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液中,8 000 r/min離心15 min,收集上清液并使得蛋白質(zhì)濃度在0.02 mg/mL~0.14 mg/mL。取30 μL濃度為2.3 mg/mL的8-苯胺-1-萘磺酸溶液(采用0.01 mol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液配制)與3 mL待測(cè)蛋白質(zhì)樣品溶液混勻,2 min后測(cè)定熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長(zhǎng)390 nm、發(fā)散波長(zhǎng)470 nm、縫隙波長(zhǎng)5 nm,并以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo),蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)作圖,曲線(xiàn)初始階段的斜率即為蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)。

        1.3.6 交聯(lián)度的測(cè)定

        參考閆爽等[13]的方法并稍作修改。稱(chēng)取2 g谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶,溶于水中,定容至50 mL容量瓶中,在37℃下保溫30 min。取20 mL濃度為5 mg/mL的樣品溶液,添加3 mL谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶溶液,在47℃的恒溫水浴中反應(yīng)120 min。反應(yīng)結(jié)束后,在85℃水浴鍋中滅活5 min,取出冷卻后,稀釋至0.5 mg/mL。吸取稀釋后濃度為0.5 mg/mL改性前后的樣品溶液2 mL分別和2 mL鄰苯二甲醛試劑振蕩混合后,精確靜止反應(yīng)2 min后,在336 nm下測(cè)定吸光度,依據(jù)公式計(jì)算樣品中游離氨基的含量,鄰苯二甲醛試劑的配制參考閆爽等[13]的方法。游離氨基含量和交聯(lián)度的計(jì)算公式如下。

        式中:Ai為樣品的吸光度;C為樣品的濃度,mg/mL;M1為樣品交聯(lián)前游離氨基含量,μg/mg;M2為樣品交聯(lián)后游離氨基含量,μg/mg。

        1.3.7 熱穩(wěn)定性測(cè)定

        通過(guò)熱重分析測(cè)定奶渣酪蛋白的熱穩(wěn)定性。稱(chēng)取5 mg酪蛋白樣品置于坩堝中,設(shè)置溫度量程為20℃~600℃,升溫速率為10℃/min,以溫度(℃)為橫坐標(biāo),樣品的失重率(%)為縱坐標(biāo),記錄樣品在加熱過(guò)程中質(zhì)量隨溫度的變化,從而得到熱重曲線(xiàn),即TG曲線(xiàn),并對(duì)失重率求一階導(dǎo)得到失重率的變化曲線(xiàn),即微商熱重曲線(xiàn)。

        1.3.8 蛋白凝膠電泳分析

        采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析奶渣酪蛋白的分子量。分離膠為12%、濃縮膠為4%,取50 μL蛋白分散液(10 mg/mL)加入50μL SDS-PAGE蛋白緩沖液,混合均勻,沸水浴5min,之后取15 μL處理后的樣品上樣后進(jìn)行電泳。

        1.3.9 傅里葉紅外光譜分析

        參考薛海燕等[14]的方法稍作修改后測(cè)定蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。將干燥后的2 mg樣品與200 mg溴化鉀混合于瑪瑙研缽中,研磨均勻后壓成半透明薄片,用傅里葉變換紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectrometer,F(xiàn)TIR)對(duì)樣品掃描,掃描范圍在 4 000 cm-1~400 cm-1,分辨率為4 cm-1,得到不同蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)光譜圖,使用Omnic軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

        1.4 奶渣酪蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值分析

        1.4.1 氨基酸組成分析

        氨基酸組成的測(cè)定參考GB 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》。

        1.4.2 一級(jí)序列分析

        酪蛋白樣品經(jīng)過(guò)酶解后,酶解產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離,液相所用A液為0.1%甲酸水溶液,B液為0.1%甲酸乙腈水溶液。分離后用Q Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析,分析時(shí)長(zhǎng)為60 min,檢測(cè)方式為正離子,質(zhì)譜測(cè)試原始文件用軟件MaxQuant 1.5.5.1檢索相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù),分析蛋白的一級(jí)序列片段。

        1.4.3 活性多肽片段預(yù)測(cè)

        借助 Biopep數(shù)據(jù)庫(kù)(https://biochemia.uwm.edu.pl/biopep-uwm/)提供的在線(xiàn)酶解功能與活性多肽數(shù)據(jù)庫(kù),將質(zhì)譜鑒定到的蛋白多肽片段進(jìn)行在線(xiàn)模擬酶解,設(shè)置為胃蛋白酶和木瓜蛋白酶復(fù)合酶解的方式,最終得到蛋白的潛在活性多肽片段。

        1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

        試驗(yàn)均重復(fù)3次,試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件的ANOVA(變異系數(shù)分析)和Tukey法進(jìn)行方差分析和多重比較。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 奶渣酪蛋白的理化性質(zhì)與二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

        2.1.1 基本組分分析

        不同酪蛋白基本組分含量見(jiàn)表1。

        由表1可知,奶渣中含量最高的為蛋白質(zhì),含量為64.09%,其次為脂肪,含量為9.36%,水分含量和乳糖含量分別為8.54%和6.30%。李進(jìn)波等[5]研究香格里拉干奶渣濕基蛋白質(zhì)和脂肪含量分別為59.35%與8.31%。奶渣酪蛋白1的蛋白質(zhì)含量為91.41%,奶渣酪蛋白2的蛋白質(zhì)含量為92.26%,奶渣酪蛋白1與奶渣酪蛋白2的蛋白質(zhì)含量差異不顯著(P>0.05),與兩種市購(gòu)酪蛋白的蛋白質(zhì)含量差異不顯著(P>0.05)。奶渣酪蛋白中的脂肪、乳糖含量相較于奶渣明顯降低,且酪蛋白含量符合GB 31638—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白》中的酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)。

        表1 不同酪蛋白基本組分含量Table 1 Basic component content of different casein

        2.1.2 溶解度分析

        蛋白質(zhì)溶解度的大小與pH值有關(guān),通常在等電點(diǎn)時(shí)溶解度是最低的[15]。不同pH值下奶渣酪蛋白的溶解度見(jiàn)圖1。

        圖1 不同pH值下奶渣酪蛋白的溶解度Fig.1 The solubility of milk residue protein at different pH values

        由圖1可知,在pH4時(shí),4種酪蛋白的溶解度均最低,奶渣酪蛋白1溶解度為1.51%,奶渣酪蛋白2溶解度為3.16%,市購(gòu)酪蛋白1溶解度為3.41%,市購(gòu)酪蛋白2溶解度為1.82%,說(shuō)明幾種酪蛋白的等電點(diǎn)在pH4附近,這與朱玉英等[16]對(duì)羊乳酪蛋白等電點(diǎn)的研究結(jié)果一致。隨著pH值的升高,4種酪蛋白的溶解度逐漸增大,并且在pH11時(shí)均達(dá)到最大,奶渣酪蛋白1溶解度為80.33%,奶渣酪蛋白2溶解度為82.44%,市購(gòu)酪蛋白1溶解度為79.92%,市購(gòu)酪蛋白2溶解度為75.44%,奶渣酪蛋白與市購(gòu)酪蛋白表現(xiàn)出了同樣優(yōu)異的溶解性能,在堿性條件下有很好的溶解性,良好的溶解性有利于發(fā)揮其功能特性,如形成凝膠和泡沫的能力[17]。

        2.1.3 乳化性分析

        蛋白質(zhì)的乳化性質(zhì)是蛋白質(zhì)的一項(xiàng)重要的功能性質(zhì),是指能使油和水形成穩(wěn)定乳化液的性質(zhì)[18]。蛋白質(zhì)的乳化性與其溶解性、表面疏水性等多種因素相關(guān),不同加工方式的蛋白質(zhì)的乳化能力可能因?yàn)榈鞍追肿恿俊⒈砻婊鶊F(tuán)分布、變性程度等的變化而變化[19-21]。不同種類(lèi)酪蛋白的乳化性見(jiàn)圖2。

        由圖2可知,兩種奶渣酪蛋白的乳化活力指數(shù)與市購(gòu)酪蛋白1差異不顯著(P>0.05),并且奶渣酪蛋白1的乳化液穩(wěn)定性較高(>70%),與市面上的兩種酪蛋白的乳化液穩(wěn)定性差異不顯著(P>0.05),這說(shuō)明奶渣經(jīng)過(guò)堿溶酸沉等分離純化的處理后,制備的酪蛋白性能較好,具有優(yōu)異的乳化能力,可作為成本較低的乳化劑應(yīng)用于食品領(lǐng)域。

        圖2 不同種類(lèi)酪蛋白的乳化性Fig.2 Emulsification of different kinds of casein

        2.1.4 表面疏水性

        蛋白質(zhì)在天然狀態(tài)下,其中的疏水氨基酸殘基大多數(shù)是處在分子內(nèi)部,形成疏水內(nèi)核,從而維持緊密的結(jié)構(gòu),當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)受到某些外力作用時(shí),包埋在分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)會(huì)暴露在蛋白分子表面,因此蛋白質(zhì)的疏水性會(huì)發(fā)生改變[22]。研究蛋白質(zhì)的疏水性可應(yīng)用熒光探針?lè)?,在一定范圍?nèi),最大熒光強(qiáng)度與蛋白質(zhì)的表面疏水性呈線(xiàn)性關(guān)系[23]。不同種類(lèi)酪蛋白的表面疏水性見(jiàn)圖3。

        圖3 不同種類(lèi)酪蛋白的表面疏水性Fig.3 Surface hydrophobicity of different kinds of casein

        由圖3可知,兩種奶渣酪蛋白的表面疏水性要高于市購(gòu)的兩種酪蛋白,可能是由于奶渣在制備過(guò)程中,由于經(jīng)過(guò)加熱等工藝,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi),包埋于酪蛋白膠束內(nèi)部的疏水基部分轉(zhuǎn)移至表面,疏水性能增強(qiáng)[12]。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,一些聚集在α-螺旋、β-折疊處的親水區(qū)域因結(jié)構(gòu)的變化而減少,使蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露,導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增強(qiáng)[14]。

        2.1.5 交聯(lián)度的測(cè)定

        蛋白質(zhì)交聯(lián)是常見(jiàn)蛋白改性技術(shù)之一,可改善其功能性質(zhì),從而發(fā)揮更廣泛的作用。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(transglutaminase,TGase)可使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián),引起蛋白質(zhì)分子聚集,形成更加致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),對(duì)外界有更強(qiáng)的抵抗能力,顯著改善蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[24]。不同酪蛋白的交聯(lián)度見(jiàn)圖4。

        圖4 不同種類(lèi)酪蛋白的交聯(lián)度Fig.4 The cross-linking degree of different kinds of casein

        由圖4可知,市購(gòu)的兩種酪蛋白交聯(lián)度較高,這是由于幾種蛋白結(jié)構(gòu)不同,通過(guò)TGase催化交聯(lián)反應(yīng)得到的修飾產(chǎn)物游離氨基也存在明顯差異,因此交聯(lián)度會(huì)有差異[13]。在交聯(lián)過(guò)程中,TGase催化的蛋白質(zhì)側(cè)鏈的賴(lài)氨酸及谷氨酰胺殘基發(fā)生分子內(nèi)及分子間交聯(lián),引起酪蛋白結(jié)構(gòu)改變,從而影響酪蛋白的凝膠性、乳化性、起泡性、黏度和持水能力等[25]。

        2.1.6 熱穩(wěn)定性的測(cè)定

        酪蛋白的熱降解特征可通過(guò)熱重曲線(xiàn)進(jìn)行測(cè)定,4種酪蛋白的熱重分析圖見(jiàn)圖5。

        圖5 不同種類(lèi)酪蛋白的熱重分析Fig.5 Thermogram of different kinds of casein

        由圖5可知,4種酪蛋白的第一個(gè)失重峰位于50℃左右,在20℃~150℃出現(xiàn)一定程度的質(zhì)量損失,這主要是樣品失水造成的,第二個(gè)熱降解階段位于200℃~500℃,質(zhì)量損失在50%~70%,失重峰出現(xiàn)于310℃左右,此溫度區(qū)間的失重加快,說(shuō)明在此過(guò)程中樣品含有的主要成分即蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)結(jié)構(gòu)降解。兩種奶渣酪蛋白和兩種市購(gòu)酪蛋白都具有較好的熱穩(wěn)定性,在300℃下不易分解,在食品的加工過(guò)程中,對(duì)食品進(jìn)行熱處理是非常重要的一步,因此溫度的控制十分必要。對(duì)奶渣酪蛋白和市購(gòu)酪蛋白進(jìn)行熱重分析,可以了解其熱穩(wěn)定性,結(jié)果表明奶渣酪蛋白具有良好的熱穩(wěn)定性,在300℃下不易分解,適合于工業(yè)熱加工處理。

        2.1.7 亞基組成分析

        根據(jù)其主要結(jié)構(gòu)的不同,酪蛋白可以被分為3種不同的類(lèi)型,即 α-酪蛋白(α-CN)、β-酪蛋白(β-CN)和k-酪蛋白(k-CN)[26-27]。不同種類(lèi)酪蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜見(jiàn)圖6。

        由圖6可知,奶渣酪蛋白1、2與兩種市購(gòu)酪蛋白分子量分布大致相同,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker,α-CN和β-CN的分子量分別約為30、26 kDa,還有少量k-CN,分子量約為24 kDa,與朱玉英等[16]對(duì)羊乳酪蛋白分子量的研究保持一致。在63 kDa和180 kDa左右有不清晰條帶,這可能是由于蛋白不純或者測(cè)定過(guò)程中電壓不穩(wěn)造成。

        圖6 不同種類(lèi)酪蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.6 SDS-PAGE electrophoresis analysis of different kinds of casein

        2.1.8 傅里葉紅外光譜分析

        蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)是指由于主鏈原子間相互作用而在多肽內(nèi)部形成的局部折疊結(jié)構(gòu),其與蛋白質(zhì)功能特性密切相關(guān)[28]。幾種酪蛋白樣品的紅外光譜圖見(jiàn)圖7。

        圖7 不同種類(lèi)酪蛋白的紅外光譜Fig.7 Fourier transformation infrared spectroscopy spectra of different kinds of casein

        酰胺Ⅰ帶的振動(dòng)頻率取決于C=O和N-H之間的氫鍵性質(zhì),此波段的吸收峰主要表示蛋白質(zhì)分子之間及分子內(nèi)部形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)[29]。酰胺Ⅰ帶的波長(zhǎng)范圍為1 700 cm-1~1 600 cm-1。由圖7可知,幾種蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶的特征吸收峰分別在 1661、1654、1647、1654 cm-1。

        不同種類(lèi)酪蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量見(jiàn)表2。

        由表2可知,奶渣酪蛋白的α-螺旋和β-折疊含量較高,無(wú)規(guī)則卷曲含量相對(duì)較低,表明奶渣酪蛋白分子能夠形成緊密的無(wú)空腔結(jié)構(gòu),二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較好,而與α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)相比,無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的構(gòu)象穩(wěn)定性和緊密程度則相對(duì)較差[30]。

        表2 不同種類(lèi)酪蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 2 Secondary structure content of differrent kinds of casein

        2.2 奶渣酪蛋白與市購(gòu)酪蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值分析

        由兩種奶渣酪蛋白和市購(gòu)酪蛋白理化性質(zhì)的測(cè)定可知,經(jīng)過(guò)兩次堿溶酸沉得到的奶渣酪蛋白2相較于奶渣酪蛋白1純度提升不明顯,且得率降低,乳化性和交聯(lián)度等理化性能差異不明顯,基于成本的考慮,在工業(yè)生產(chǎn)中,宜選用經(jīng)過(guò)1次堿溶酸沉的奶渣酪蛋白,因此營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的分析對(duì)象不再包括奶渣酪蛋白2,選取經(jīng)過(guò)一次堿溶酸沉的奶渣酪蛋白1與市購(gòu)酪蛋白1進(jìn)行深入研究,包括氨基酸組成分析與潛在活性多肽片段分析。

        2.2.1 氨基酸組成分析

        奶渣酪蛋白1與市購(gòu)酪蛋白1的氨基酸組成和含量見(jiàn)表3。

        表3 氨基酸組成與含量Table 3 Amino acid composition and content

        由表3可知,經(jīng)過(guò)酸解處理后,奶渣酪蛋白1與市購(gòu)酪蛋白1分別檢測(cè)出17種氨基酸,與乳蛋白質(zhì)類(lèi)似[31],奶渣酪蛋白1富含谷氨酸(13.45%)、脯氨酸(7.49%)、亮氨酸(6.38%)和賴(lài)氨酸(5.39%),半胱氨酸(0.10%)和甲硫氨酸(1.82%)含量較少,市購(gòu)酪蛋白1富含天門(mén)冬氨酸(18.56%)、谷氨酸(11.68%)和賴(lài)氨酸(8.96%)。奶渣酪蛋白1含有必需氨基酸7種,包括亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸和賴(lài)氨酸,除賴(lài)氨酸外的其余6種必需氨基酸含量均高于市購(gòu)酪蛋白1,其中異亮氨酸(3.75%)和纈氨酸(5.01%)均高于聯(lián)合國(guó)糧食組織和世界衛(wèi)生組織提出的相對(duì)氨基酸評(píng)分模式下的兒童推薦值(分別為2.8%、3.5%),亮氨酸(6.38%)、賴(lài)氨酸(5.39%)、苯丙氨酸(3.8%)、蘇氨酸(2.89%)和甲硫氨酸(1.82%)含量稍低于相對(duì)氨基酸評(píng)分模式下的兒童推薦值(分別為6.6%、5.8%、6.3%、3.4%、2.8%)。奶渣酪蛋白中氨基酸種類(lèi)豐富,含有多種必需氨基酸,并且有6種必需氨基酸含量高于市購(gòu)酪蛋白,表明奶渣營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高,可作為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的來(lái)源。

        2.2.2 蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)及在線(xiàn)酶解分析

        本研究中將奶渣酪蛋白1和市購(gòu)酪蛋白1用胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解,酶解產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜分離后用質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析,并與活性多肽數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比,對(duì)潛在活性多肽片段進(jìn)行初步預(yù)測(cè),為評(píng)估奶渣酪蛋白生理功效提供數(shù)據(jù)依據(jù)[32]。

        2.2.2.1 覆蓋序列分析

        通過(guò)MaxQuant可視化分析,得到奶渣酪蛋白1和市購(gòu)酪蛋白1的一級(jí)序列部分片段見(jiàn)表4。樣品用胰蛋白酶酶解,作用位點(diǎn)為賴(lài)氨酸和精氨酸,因此對(duì)應(yīng)片段末端氨基酸為R或K[32]。

        表4 奶渣酪蛋白1和市購(gòu)酪蛋白1一級(jí)序列部分片段Table 4 Partial fragments of primary sequence of milk residue casein 1 and commercially available casein 1

        續(xù)表4 奶渣酪蛋白1和市購(gòu)酪蛋白1一級(jí)序列部分片段Continue table 4 Partial fragments of primary sequence of milk residue casein 1 and commercially available casein 1

        2.2.2.2 活性多肽片段分析

        將表4中的片段進(jìn)行在線(xiàn)模擬酶解,所用酶為胃蛋白酶和木瓜蛋白酶,酶解后與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),得到奶渣酪蛋白1與市購(gòu)酪蛋白1的潛在活性多肽片段。奶渣酪蛋白1酶解后潛在活性多肽片段見(jiàn)表5。

        表5 奶渣酪蛋白1酶解后潛在活性多肽片段Table 5 Potential active polypeptide fragments of milk residue casein 1 after enzymatic hydrolysis

        由表5可知,奶渣酪蛋白1共有129條潛在活性肽段,均為二肽或三肽,說(shuō)明奶渣酪蛋白1酶解較徹底,產(chǎn)生的二肽和三肽更有利于吸收[32]。其中有48條多肽具有降壓功能,71條多肽具有降糖功能,部分多肽還具有抗血栓、促進(jìn)代謝等功效。

        市購(gòu)酪蛋白1酶解后潛在活性多肽片段見(jiàn)表6。

        表6 市購(gòu)酪蛋白1酶解后潛在活性多肽片段Table 6 Potential active polypeptide fragments of commercially available casein 1 after enzymatic hydrolysis

        由表6可知,市購(gòu)酪蛋白1的潛在活性多肽片段,其中27條多肽具有降壓功能,37條多肽具有降糖功能,相較于市購(gòu)酪蛋白,奶渣酪蛋白酶解后的潛在活性多肽片段還具有修護(hù)胃黏膜、抗血栓、安神和抗炎等多種生理功效,生理活性更廣泛,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高。

        3 結(jié)論

        為實(shí)現(xiàn)奶渣的高值化利用,本文使用牦牛奶渣為原料,通過(guò)堿溶酸沉法獲得了高純度的奶渣酪蛋白。研究表明,奶渣酪蛋白在堿性條件下具有較好的溶解性,并且具有良好的乳化性和熱穩(wěn)定性,較高的表面疏水性和堿溶性等理化特性。奶渣酪蛋白含有7種必需氨基酸且其中6種必需氨基酸含量高于市購(gòu)酪蛋白,酶解后具有多種生理活性的潛在活性片段,可能在降壓、降糖等功能上具有一定生理活性,表明奶渣酪蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富。研究表明由成本較低的副產(chǎn)物奶渣提取的酪蛋白的各項(xiàng)理化性質(zhì)與較昂貴的市購(gòu)酪蛋白沒(méi)有明顯差異且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高,為實(shí)現(xiàn)其高值化利用以及開(kāi)發(fā)相關(guān)產(chǎn)品提供了有力的理論支撐。

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