朱映黎 劉 磊 張建軍 呂美豫 張文雅 侯新娟 王衛(wèi)茜 王金鳳 谷洪順 王林元

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029； 2 神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，石家莊，051430； 3 北京采瑞醫(yī)藥科技研究院，北京，100094)

鹿胎丹參白芍顆粒由馬鹿胎凍干粉、丹參、白芍、葛根、大豆異黃酮5種成分組成，具有滋補(bǔ)腎精、活血化瘀、祛黃褐斑的功效。方中馬鹿胎補(bǔ)益精血，溫助陽(yáng)[1]；白芍補(bǔ)益營(yíng)血，二者同用能夠增強(qiáng)補(bǔ)益精血，潤(rùn)膚養(yǎng)顏之功；丹參既能活血調(diào)經(jīng)，又能化瘀消斑；葛根升發(fā)清陽(yáng)，輸布精血，又能通經(jīng)活絡(luò)祛瘀[2]；大豆異黃酮調(diào)節(jié)內(nèi)分泌，抗氧化，消斑養(yǎng)顏[3]。諸品合用，可達(dá)補(bǔ)腎益精，活血通經(jīng)，化瘀消斑，養(yǎng)顏美容之效。動(dòng)物及人體研究表明祛黃褐斑作用明確，已上市應(yīng)用10余年(國(guó)食健注G20100485)。但目前對(duì)于鹿胎丹參白芍顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅停留在大豆異黃酮含量和馬鹿胎凍干粉的氮含量的控制上，不能全面反映其發(fā)揮全部功效的內(nèi)在物質(zhì)質(zhì)量。因此，非常有必要進(jìn)一步提高和完善已上市產(chǎn)品鹿胎丹參白芍顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為更好地控制鹿胎丹參白芍顆粒質(zhì)量、深入研究其祛黃褐斑功能機(jī)制內(nèi)涵提供物質(zhì)依據(jù)。

本研究擬在現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，增加葛根素、芍藥苷及丹酚酸B作為質(zhì)量控制成分，運(yùn)用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定其含量并進(jìn)行方法學(xué)考察，以提高該產(chǎn)品的可控性，完善其檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，為鹿胎丹參白芍顆粒的綜合評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(沃特世，美國(guó)，型號(hào)：Waterse2695)；超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司，型號(hào)：KQ5200E)；電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司，型號(hào)：SQP]。

1.2 試劑 乙腈(上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?，批?hào)：0114220309)；甲醇(上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?，批?hào)：0212220401)；磷酸(上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆?hào)：RH297703)。

1.3 分析樣品 葛根素對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：S02M9B54875，純度≥98%)，芍藥苷對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：M28GB143089，純度≥98%)，丹酚酸B對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：P20J10F93457，純度≥98%)；鹿胎丹參白芍顆粒(批號(hào)：20211201，20211202，20201203)；陰性樣品(不含葛根、白芍和丹參，實(shí)驗(yàn)室按處方自制)；中藥材(亳州市京皖中藥飲片廠)，本實(shí)驗(yàn)所用葛根、白芍、丹參均來(lái)源于實(shí)驗(yàn)3批中試產(chǎn)品的生產(chǎn)原料，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院李偉高級(jí)實(shí)驗(yàn)師確定3種藥材分別來(lái)源于豆科植物野葛[Puerarialobata(Willd.)Ohwi]的干燥根，毛茛科植物芍藥(PaeonialactifloraPall.)的干燥根，唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根和根莖[2-4]；馬鹿胎凍干粉(長(zhǎng)春市慧源鹿業(yè)有限公司，批號(hào)：20210910T06)；大豆異黃酮(西安天一生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：210802)；糊精(嘉康源有限公司，批號(hào)：211010)；羧甲基纖維素鈉(嘉康源有限公司，批號(hào)：21040659)；D-甘露糖醇(嘉康源有限公司，批號(hào)：112104015)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Waters XBridge C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相A：乙腈(CH3CN)；流動(dòng)相B：甲醇(CH3OH)；流動(dòng)相C：0.05%磷酸(H3PO4)水溶液；采用梯度洗脫；流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。三元梯度洗脫程序：A相：0～18 min，1%～8%；18～30 min，8%～23%；30～45 min，23%；B相：0～45 min，15%；C相：0～18 min，84%～77%；18～30 min，77%～62%；30～45 min，62%。見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序(%)

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取葛根素、丹酚酸B、芍藥苷對(duì)照品適量，加50%甲醇制成每1 mL含葛根素0.250 mg、芍藥苷0.130 mg、丹酚酸B 0.200 mg的混合對(duì)照品溶液，搖勻，得混合對(duì)照品母液。精密量取10 mL，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取約1.000 g產(chǎn)品，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入50%甲醇適量，超聲處理30 min，放冷，加50%甲醇定容，精密量取上清液3 mL置10 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，即得。按照原樣品配方比例及工藝，分別不含丹參、白芍、葛根制備3種陰性對(duì)照品。按照2.2.2項(xiàng)下的方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.4 專屬性實(shí)驗(yàn) 取混合對(duì)照品、供試品及陰性樣品溶液各10 μL，按“2.1”設(shè)定色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。供試品中葛根素出峰時(shí)間為20.909 min，芍藥苷出峰時(shí)間為25.224 min，丹酚酸B的出峰時(shí)間為37.616 min，結(jié)果陰性樣品在與供試品中葛根素、芍藥苷和丹酚酸B相同的保留時(shí)間處無(wú)干擾峰。見(jiàn)圖1。

圖1 專屬性高效液相色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液0.5、2、4、8、16、30 μL分別注入高效液相色譜儀中，按照上述“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積。結(jié)果以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程和線性范圍。見(jiàn)表2。

表2 直線回歸方程結(jié)果

2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，在上述“2.1”項(xiàng)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算丹酚酸B、葛根素和芍藥苷的峰面積，RSD值分別為：0.12%、0.53%和0.56%。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一鹿胎丹參白芍顆粒供試品溶液，分別于0、2、6、12、18、24 h進(jìn)樣，計(jì)算丹酚酸B、葛根素和芍藥苷的峰面積RSD值分別為：2.34%，0.57%和0.96%。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批鹿胎丹參白芍顆粒約1.000 g，平行6份，精密稱定，按上述“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative Standard Deviation，RSD)值。見(jiàn)表3。

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.9 回收率實(shí)驗(yàn) 取同一批鹿胎丹參白芍顆粒約0.600 g，精密稱定，分別按照0.8∶1、1∶1和1∶1.2的比例加入對(duì)照品適量，每個(gè)比例平行3份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算葛根素、芍藥苷、丹酚酸B的平均加樣回收率。見(jiàn)表4～6。

表4 葛根素加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.10 樣品測(cè)定結(jié)果 按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備鹿胎丹參白芍顆粒溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定3批樣品中丹酚酸B、葛根素、芍藥苷的含量，每批樣品平行測(cè)定3次，并計(jì)算RSD值。見(jiàn)表7。

表5 芍藥苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 丹酚酸B加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表7 鹿胎丹參白芍顆粒中丹酚酸B、葛根素、芍藥苷含量測(cè)定結(jié)果(mg/g)

3 討論

鹿胎丹參白芍顆粒方中各類成分相互協(xié)調(diào)、相互促進(jìn)從而達(dá)到祛黃褐斑的效果。結(jié)合中藥有效性-物質(zhì)基礎(chǔ)-質(zhì)量控制標(biāo)志性成分評(píng)價(jià)體系，采用多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式，完善鹿胎丹參白芍顆粒的質(zhì)量控制，既有助于生產(chǎn)企業(yè)和食品藥品監(jiān)管部門不斷提高該產(chǎn)品的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，也可逐步完善鹿胎丹參白芍顆粒原藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，從源頭上確保鹿胎丹參白芍顆粒產(chǎn)品質(zhì)量和臨床療效的穩(wěn)定性。但目前對(duì)于鹿胎丹參白芍顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅停留在大豆異黃酮中各成分的含量測(cè)定以及馬鹿胎凍干粉中氮含量的測(cè)定，不能全面反映其發(fā)揮全部功效的內(nèi)在物質(zhì)質(zhì)量。

丹酚酸B、芍藥苷和葛根素分別作為丹參、白芍和葛根中的標(biāo)志性成分。其中丹酚酸B具有很強(qiáng)的抗氧化性，它既可通過(guò)抗氧化機(jī)制抑制黑色素的生成，也可通過(guò)改善微循環(huán)加快黑色素的清除[4-5]。芍藥苷可以通過(guò)抑制氧化亢進(jìn)、改善線粒體功能障礙、抑制或活化抗氧化酶相關(guān)通路、增強(qiáng)抗氧化能力、調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2信號(hào)通路等多通路多靶點(diǎn)的方式改善氧化應(yīng)激以及緩解黑色素形成[6-8]。葛根素是葛根異黃酮中的一種，能夠清除氧自由基及抗脂質(zhì)過(guò)氧化，通過(guò)降低酪氨酸酶的活性抑制黑色素的形成[9-10]。因此，本研究擬在現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，增加葛根素、芍藥苷及丹酚酸B作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)成分，運(yùn)用HPLC法測(cè)定其含量并進(jìn)行方法學(xué)考察。

在2020版《中華人民共和國(guó)藥典》中，葛根素的測(cè)定流動(dòng)相為甲醇：水，芍藥苷的測(cè)定流動(dòng)相為乙腈：0.1%磷酸溶液，丹酚酸B的測(cè)定流動(dòng)相為乙腈：0.1%磷酸溶液。陳麗艷[11]采用HPLC同時(shí)測(cè)定葛根素、芍藥苷和丹酚酸B 3種成分選用流動(dòng)相為乙腈、甲醇和0.05%磷酸溶液。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合鹿胎丹參白芍顆粒的配方特點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上，參照色譜峰性能、分離效果、保留時(shí)間等指標(biāo)，重新調(diào)整甲醇比例為15%，使色譜分離達(dá)到最佳效果。在制備供試品溶液時(shí)，由于丹酚酸B具有熱不穩(wěn)定性，因此采用50%甲醇溶液超聲提取進(jìn)行制備，提取效果最佳[12]。并且，通過(guò)對(duì)這3種成分分別進(jìn)行檢測(cè)，最終確定測(cè)定波長(zhǎng)為230 nm處各成分有較大吸收，且最晚出峰時(shí)間為35 min，因此設(shè)定檢測(cè)時(shí)間為45 min。鹿胎丹參白芍顆粒中葛根素、芍藥苷及丹酚酸B的相對(duì)含量為18.94、10.15、9.25 mg/g；加樣回收率的RSD值分別為1.63、1.01、1.38%(RSD%<2)。表明本研究所建立的同時(shí)測(cè)定鹿胎丹參白芍顆粒中葛根素、芍藥苷及丹酚酸B含量的新方法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性優(yōu)，線性結(jié)果符合要求，能有效地控制鹿胎丹參白芍顆粒的質(zhì)量。

目前鹿胎丹參白芍顆粒的產(chǎn)品規(guī)格為5 g/袋，服用方法為1袋/次，2次/d，沖飲。根據(jù)本研究建立的方法測(cè)定含量，每10 g鹿胎丹參白芍顆含有葛根素189.4 mg、芍藥苷101.5 mg、丹酚酸B92.5 mg，提示其活性成分含量高，為后續(xù)探討有效成分作用靶點(diǎn)，深入闡釋產(chǎn)品作用機(jī)制，進(jìn)一步開(kāi)展人體小樣本、大樣本實(shí)驗(yàn)奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究在鹿胎丹參白芍顆粒現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，增加了葛根素、芍藥苷及丹酚酸B作為含量測(cè)定項(xiàng)的指標(biāo)性成分，建立了可同時(shí)測(cè)定鹿胎丹參白芍顆粒中葛根素、芍藥苷及丹酚酸B含量的新方法，可為鹿胎丹參白芍顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。