韋 冰，陳艷熙，覃均生

（南寧學(xué)院，廣西南寧 541699）

嘔吐毒素是禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌等真菌的次生代謝物，過(guò)量攝入會(huì)激發(fā)嘔吐、腹瀉、腸胃不適、抑制免疫系統(tǒng)等毒性效應(yīng)。多個(gè)物種尤其豬對(duì)其毒性非常敏感。對(duì)生長(zhǎng)育肥豬而言，當(dāng)飼料中含有12～14 mg/kg 嘔吐毒素，進(jìn)食后10～20 min 即會(huì)使豬出現(xiàn)嘔吐、不正常的焦慮、磨牙現(xiàn)象，當(dāng)食物中嘔吐毒素含量超過(guò)19 mg/kg，豬拒絕采食（黃凱等，2013）。國(guó)標(biāo)GB 13078—2017《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，植物性飼料原料中嘔吐毒素限量≤5 mg/kg。近年來(lái)的研究表明，人類患IgA 腎病和嘔吐毒素?cái)z入有關(guān)（張海濤等，2021）。因此，不論是飼料原料還是飼料成品，嘔吐毒素含量都是養(yǎng)殖行業(yè)的必檢項(xiàng)目。

根據(jù)GB13078—2017，飼料原料、成品均應(yīng)按照GB/T 30956—2014《飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測(cè)定 免疫親和柱凈化—高效液相色譜法》中介紹的高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)。該檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和可靠性毋庸置疑，但該方法檢測(cè)成本高，檢測(cè)時(shí)間為2～4 h（時(shí)間過(guò)長(zhǎng)），試驗(yàn)操作對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的素質(zhì)要求高等缺點(diǎn)都不適宜在企業(yè)進(jìn)行頻繁、大批量的樣品檢測(cè)。

隨著研究的深入和科技的發(fā)展，嘔吐毒素檢測(cè)方法也在不斷更迭換代。羅俊聰和李浩坤（2014）將ELISA 試劑盒法與高效液相色譜法進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)兩者的回收率相差不大，且ELISA試劑盒法要比高效液相色譜法樣品前處理時(shí)間更短、檢測(cè)時(shí)間更短、試驗(yàn)成本更低等優(yōu)勢(shì)。李小明等（2017）將便攜式真菌毒素快速定量檢測(cè)儀和酶聯(lián)免疫法用于檢測(cè)玉米中的嘔吐毒素含量，以得到快速定量檢測(cè)儀的檢出限。何詠怡等（2021）為了解市售嘔吐毒素酶聯(lián)免疫吸附試劑盒質(zhì)量情況，選取了兩款市售嘔吐毒素酶聯(lián)免疫吸附試劑盒進(jìn)行性能研究，結(jié)果表明，兩款試劑盒的檢出限、量限、回收率、復(fù)性和一致性均能滿足國(guó)內(nèi)對(duì)玉米中嘔吐毒素的檢測(cè)要求。

以上現(xiàn)有研究均是對(duì)檢測(cè)嘔吐毒素測(cè)量方法的性能進(jìn)行對(duì)比分析，但對(duì)檢測(cè)嘔吐毒素測(cè)量系統(tǒng)分析的研究尚未有報(bào)道。測(cè)量系統(tǒng)是指得到測(cè)量結(jié)果過(guò)程中所有操作人員、測(cè)量?jī)x器、設(shè)備、環(huán)境、軟件等因素。而測(cè)量系統(tǒng)分析則是測(cè)量系統(tǒng)評(píng)估工具。測(cè)量系統(tǒng)分析被廣泛應(yīng)用于汽車制造等領(lǐng)域（孫國(guó)峰等，2022；鄭曉峰等，2022；張婭嵐等，2021；馬麗莎，2021；潘濤等，2021；韋永寅，2021；王海龍等，2020；陶明東和周夢(mèng)璐，2020；Muhammad 等，2020），用以確保測(cè)量數(shù)據(jù)的質(zhì)量。本研究對(duì)飼料企業(yè)常用的兩種檢測(cè)嘔吐毒素方法-ELISA 試劑盒法和上轉(zhuǎn)發(fā)光法的測(cè)量系統(tǒng)進(jìn)行分析（樣品前處理使用的電子分析天平、粉碎機(jī)、振蕩器、離心機(jī)均為相同儀器），一方面，為了檢測(cè)現(xiàn)階段測(cè)量數(shù)據(jù)的可靠性，另一方面，通過(guò)對(duì)比分析選擇其中更為合適的檢測(cè)方法，為相關(guān)企業(yè)選擇檢測(cè)嘔吐毒素方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 某飼料生產(chǎn)公司購(gòu)入的轉(zhuǎn)基因玉米[ 嘔吐毒素含量要求（0.22±0.03）mg/kg、高粱（0.46±0.03）mg/kg、進(jìn)口玉米（0.87±0.03）mg/kg、玉米蛋白粉（1.90±0.03）mg/kg、國(guó)產(chǎn)安徽玉米（2.20±0.03）mg/kg]等植物性飼料原料，經(jīng)過(guò)粉碎、振蕩及離心后的待測(cè)液。

水為GB/T 6682 規(guī)定的二級(jí)水。

1.2 儀器與設(shè)備 食品安全快速檢測(cè)儀：北京熱景生物技術(shù)股份有限公司制造，儀器型號(hào)為UPT-3A-1800-5，生產(chǎn)日期為2021年8月26日（儀器有效使用期限為5年），輸入電源條件為100—240VAC、50/60 Hz、1.0 A。

定量條：北京熱景生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為20211003，實(shí)驗(yàn)中使用的定量條均為同一生產(chǎn)廠家、同一生產(chǎn)批號(hào)，與食品安全快速檢測(cè)儀配套使用。

酶聯(lián)競(jìng)爭(zhēng)免疫分析儀：賽默飛世爾（上海）儀器公司的Multiskan FC 型酶標(biāo)儀，最大輸入功率為100 VA。

試劑盒：河北伊萊莎生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)為20018H-2，試驗(yàn)中使用的試劑盒均為同一生產(chǎn)廠家、同一生產(chǎn)批號(hào)。

數(shù)據(jù)分析軟件采用Minitab 18。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 上轉(zhuǎn)發(fā)光法 （1）對(duì)樣品進(jìn)行前處理。粉碎樣品（樣品粉碎程度達(dá)到90% 過(guò)30 目篩），稱量（2±0.2）g 粉碎后的樣品于50 mL 離心管中，加入20 mL 蒸餾水，放入振蕩器中振蕩15 min，取出離心管并轉(zhuǎn)移至離心機(jī)中離心5 min，小心取出，勿使溶液渾濁。

（2）確認(rèn)當(dāng)前檢測(cè)環(huán)境溫度為20～25℃，移取700μL 樣本稀釋液于2 mL 小離心管中。

（3）移取100μL 樣液于已有草本稀釋液的小離心管中，混勻，為待測(cè)液。

（4）使用移液槍吸取待測(cè)液100μL 于定量條的反應(yīng)孔中，等待反應(yīng)15 min。

（5）使用食品安全快速檢測(cè)儀讀取定量條中的一維碼后，將定量條插入食品安全快速檢測(cè)儀口中，食品安全快速檢測(cè)儀進(jìn)行讀數(shù)并輸出結(jié)果。

1.3.2 ELISA 試劑盒法 （1）對(duì)樣品進(jìn)行前處理。粉碎樣品（樣品粉碎程度達(dá)到90% 過(guò)30 目篩），稱量（2±0.2）g 粉碎后的樣品于50 mL 離心管中，加入20 mL 蒸餾水，放入振蕩器中振蕩15 min，取出離心管并轉(zhuǎn)移至離心機(jī)中，離心5 min，小心取出，勿使溶液渾濁。

（2）試劑盒回溫后將100μL 酶標(biāo)記物加入到混合孔中。

（3）將50μL 標(biāo)準(zhǔn)品或樣品分別加入每個(gè)混合孔中，混勻，用移液槍吸取100μL 混合孔中的液體轉(zhuǎn)移至對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)孔中（酶標(biāo)板），注意防止污染。

（4）20～25℃的溫度下反應(yīng)10 min。

（5）清洗液洗板。

（6）在每個(gè)試驗(yàn)孔中加入100μL 底物溶液，使其顯色后，在20～25℃的環(huán)境下再反應(yīng)5 min。

（7）在每個(gè)試驗(yàn)孔中加入100μL 終止液，延緩試驗(yàn)孔中溶液的反應(yīng)速度。

（8）使用450 nm 酶標(biāo)儀讀取吸光度值，在小蜜蜂軟件中輸入對(duì)應(yīng)吸光度值，輸出結(jié)果。

1.3.3 測(cè)量系統(tǒng)分析方法 上轉(zhuǎn)發(fā)光法和ELISA試劑盒法兩個(gè)測(cè)量系統(tǒng)的分辨力、穩(wěn)定性、偏倚、線性、重復(fù)性和再現(xiàn)性研究方案設(shè)計(jì)要點(diǎn)如表1所示。

表1 兩個(gè)測(cè)量系統(tǒng)分析方案設(shè)計(jì)要點(diǎn)

2 結(jié)果與分析

2.1 分辨力 可接受的分辨力應(yīng)小于制造過(guò)程變差或公差的十分之一（楊朝盛，2020；克萊斯勒集團(tuán)公司等，2010；呂瑩，2017）。

酶標(biāo)儀的測(cè)量分辨力為0.00001 mg/kg，食品安全快速檢測(cè)儀的測(cè)量分辨力為0.01 mg/kg。根據(jù)以往試驗(yàn)，飼料原料嘔吐毒素含量為0.2～2.5 mg/kg，表明這兩個(gè)測(cè)量系統(tǒng)的分辨力都滿足檢測(cè)要求。相比而言，ELISA 試劑盒法的分辨力更優(yōu)于上轉(zhuǎn)發(fā)光分析法。

2.2 穩(wěn)定性 穩(wěn)定性是測(cè)量系統(tǒng)分析的前提條件之一。本研究采用均值- 極差控制圖分別對(duì)ELISA 試劑盒法、上轉(zhuǎn)發(fā)光分析法測(cè)量系統(tǒng)進(jìn)行穩(wěn)定性分析，結(jié)果如圖1所示。

極差圖和均值圖均無(wú)異常點(diǎn)，處于統(tǒng)計(jì)受控狀態(tài)。因此，ELISA 試劑盒法、上轉(zhuǎn)發(fā)光分析法測(cè)量系統(tǒng)穩(wěn)定性可以接受。

2.3 偏倚和線性 為提高試驗(yàn)數(shù)據(jù)的使用率，降低試驗(yàn)成本，將偏倚和線性進(jìn)行聯(lián)合分析和討論。兩種方法的測(cè)量系統(tǒng)線性、偏倚分析結(jié)果如圖2、圖3所示。

由圖2可知，“偏倚=0”線被95% 的置信區(qū)間完全包含，P（斜率）=0.511＞0.05，P（常量）=0.7＞0.05，表明ELISA 試劑盒法測(cè)量系統(tǒng)不存在顯著線性差異。同時(shí)，P（平均偏倚）=0.115＞0.05，表明該測(cè)量系統(tǒng)不存在顯著偏倚誤差。同理，由圖3可知，上轉(zhuǎn)發(fā)光法測(cè)量系統(tǒng)線性和偏倚均在可接受范圍。

2.4 重復(fù)性和再現(xiàn)性 重復(fù)性和再現(xiàn)性實(shí)質(zhì)分別反映的是設(shè)備變差和人變差。重復(fù)性和再現(xiàn)性通常聯(lián)合分析也稱為測(cè)量系統(tǒng)R&R 分析。ELISA 試劑盒法測(cè)量系統(tǒng)分析Minitab 輸出結(jié)果如表2、表3所示。

表2 ELISA 試劑盒法雙因子方差分析表

表3 ELISA 試劑盒法研究變異分析表

由表2、表3可知，ELISA 試劑盒法方差分析表，部件P 值小于0.05，是唯一影響測(cè)量誤差的顯著因子。研究變異分析表中，合計(jì)量具R&R 的“%研究變異（%SV）”即R&R% 為6.56%，“% 公差”即P/T% 為5.48%，均小于10%，表明該測(cè)量系統(tǒng)測(cè)量誤差在可接受范圍內(nèi)。

由表4、圖4可知，上轉(zhuǎn)發(fā)光法合計(jì)量具R&R% 為37.12%，P/T% 為96.08%，均 大 于30%，同時(shí)可區(qū)分的類別數(shù)只有3，表明測(cè)量誤差過(guò)大，該測(cè)量系統(tǒng)不可接受。

表4 上轉(zhuǎn)發(fā)光法研究變異分析表

3 討論及結(jié)論

在ELISA 試劑盒法和上轉(zhuǎn)發(fā)光法測(cè)量系統(tǒng)分析中，分辨力、穩(wěn)定性、偏倚和線性均滿足要求。但后者重復(fù)性和再現(xiàn)性（R&R%和P/T%）不可接受。主要原因在于上轉(zhuǎn)發(fā)光法所使用的食品安全快速檢測(cè)儀可視分辨力僅為0.01 mg/kg。其滿足“十分之一”法則，是基于常見多種飼料原料嘔吐毒素含量范圍（0.2～2.5 mg/kg）之上。但對(duì)于某種常用飼料原料，如轉(zhuǎn)基因玉米（0.22±0.03 mg/kg）、高粱（0.46±0.03 mg/kg）、進(jìn)口玉米（0.87±0.03 mg/kg）、玉米蛋白粉（1.90±0.03 mg/kg）、國(guó)產(chǎn)安徽玉米（2.20±0.03 mg/kg）等，公差為0.06 mg/kg，食品安全快速檢測(cè)儀可視分辨力不符合十分之一法則要求。同時(shí)，在上轉(zhuǎn)發(fā)光法測(cè)量系統(tǒng)R&R 分析中，可區(qū)分的類別數(shù)NDC 不足5，即1.41σAct/σR&R＜5；均值控制圖未有50%以上的點(diǎn)超上下控制界限，R 圖極差個(gè)數(shù)僅有2 個(gè)，以上均表明了該方法的測(cè)量系統(tǒng)有效分辨力不足。

綜上研究，ELISA 試劑盒法測(cè)量系統(tǒng)誤差在可接受范圍內(nèi)，測(cè)量數(shù)據(jù)相對(duì)準(zhǔn)確、可靠。相比于上轉(zhuǎn)發(fā)光法，建議相關(guān)企業(yè)優(yōu)先選擇ELISA 試劑盒法。

測(cè)量系統(tǒng)分析不僅能降低因測(cè)量不可靠導(dǎo)致的品質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)，避免成本浪費(fèi)，還可提高顧客對(duì)組織的信任，提高客戶對(duì)品牌的信心。這也是測(cè)量系統(tǒng)分析目前能在越來(lái)越多領(lǐng)域得到深入推廣應(yīng)用的原因。本研究將測(cè)量系統(tǒng)分析應(yīng)用于飼料原料嘔吐毒素檢測(cè)中，豐富了測(cè)量系統(tǒng)分析的使用范圍，也為相關(guān)企業(yè)選擇嘔吐毒素檢測(cè)方法提供了參考。