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        鴨胚胎發(fā)育過程中腸道菌群的演替規(guī)律研究

        2022-12-13 06:14:04孫玲利劉一思浦發(fā)軍郝振芳寧俊平楊小杰
        中國(guó)飼料 2022年20期
        關(guān)鍵詞:禽類宿主胚胎

        孫玲利,劉一思,浦發(fā)軍,郝振芳,寧俊平,楊小杰

        (1.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院,河南鄭州 451450;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,四川雅安 625014;3.汝州市畜牧局,河南汝州 467599)

        腸道微生物在機(jī)體中的數(shù)量是體細(xì)胞數(shù)量的數(shù)倍,其在維持穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)、影響宿主生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮了積極作用(Wen 等,2019)。同時(shí),腸道微生物群也是重要的內(nèi)分泌器官,可通過多種途徑參與調(diào)控宿主能量、血糖和炎癥,且部分腸道核心菌群能夠參與宿主必需氨基酸、能量、輔因子和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝(Rastelli 等,2019)。由此可見,腸道微生物與畜禽生長(zhǎng)發(fā)育和生產(chǎn)性能密切相關(guān)。

        胚胎期早期定植的最初微生物菌群會(huì)影響新陳代謝、胃腸道發(fā)育與成熟、免疫系統(tǒng)功能等,對(duì)畜禽腸道發(fā)育及相關(guān)器官的發(fā)育和健康具有重要意義。作為水禽,鴨具有在胚胎發(fā)育中期開始由小腸吸收卵黃的特點(diǎn),卵黃是鴨胚胎發(fā)育的重要營(yíng)養(yǎng)來源,因此,胚胎時(shí)期的腸道發(fā)育及腸道功能對(duì)禽類具有重要意義。本研究通過對(duì)不同胚齡鴨盲腸進(jìn)行組織學(xué)觀察,并對(duì)胚胎發(fā)育不同時(shí)期的鴨胚胎的整個(gè)腸道進(jìn)行16s rRNA 測(cè)序,探究隨著鴨胚胎發(fā)育,腸道菌群結(jié)構(gòu)組成及演替規(guī)律,旨在為禽類胚胎期的腸道微生物定植研究提供參考,也為微生態(tài)制劑在畜牧業(yè)生產(chǎn)上的合理開發(fā)與應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

        1 材料和方法

        1.1 樣品采集 試驗(yàn)選用來自于20月齡農(nóng)華麻鴨的種蛋,置于孵化機(jī)(倍立孵全自動(dòng)孵化機(jī)440型)中孵化,孵化溫度為37.2~37.8℃,濕度為55%~65%。種蛋在孵化器中的位置隨機(jī)分布,且種蛋重量平均為78.3 g,無顯著差異。在無菌條件下收集18 份樣品,包括孵化至第16(E16)、22 天(E22)的胚胎和出殼第一天(D1)的雛鴨的整個(gè)腸道,每個(gè)階段6 個(gè)樣品,用于腸道微生物的測(cè)定。將采集的樣品裝入EP 管中,立即在-80℃保存。采集孵化至E16、E22 的胚胎和出殼第一天的雛鴨的盲腸樣品保存在2%多聚甲醛溶液中,用于制作組織學(xué)切片觀察。剛孵出的雛鴨被養(yǎng)在無菌室里。胚胎標(biāo)本采集、微生物基因組DNA 提取、PCR 擴(kuò)增均采用無菌操作。

        1.2 盲腸切片制作及組織學(xué)觀察 對(duì)盲腸進(jìn)行切片,以觀察隨卵黃吸收腸道絨毛變化情況。樣品用2% 多聚甲醛溶液固定后,用全自動(dòng)密閉式組織脫水機(jī)(Leica TP1020)進(jìn)行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟。脫水后的組織用石蠟包埋,切片厚度4μm,經(jīng)脫蠟后用HE 染色試劑盒(Solarbio)進(jìn)行HE 染色,經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明后,用中性樹脂封片。用OLYMPUS BX53電子顯微鏡在低倍鏡下觀測(cè)切片,選擇典型視野,在高倍鏡下觀測(cè)視野中所有的完整絨毛,拍照。

        1.3 DNA 提取及16S rRNA 測(cè)序 通過將16、22 胚齡和出殼第一天鴨胚胎的整個(gè)腸道勻漿后,采用常用的SDS 方法提取樣本基因組,并采用瓊脂糖凝膠電泳的方式檢測(cè)提取基因組的純度和濃度。同時(shí),將提取樣本基因組使用無菌水進(jìn)行稀釋,使樣品DNA 的濃度稀釋至1 ng/μL。以稀釋濃度為1 ng/μL 樣品基因組DNA 為模板,擴(kuò)增所有微生物16Sr RNA 序列,進(jìn)行PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆與篩選,構(gòu)建16Sr RNA 基因文庫(kù),對(duì)16Sr RNA 的V3~V4 高變區(qū)進(jìn)行測(cè)序和數(shù)據(jù)分析。樣本基因組的建庫(kù)、測(cè)序工作交由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

        1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 利用Uparse 軟件(Uparse v7.0.1001)對(duì)所有樣品的全部待分析數(shù)據(jù)(Clean Reads)進(jìn)行聚類,默認(rèn)以97% 的一致性將序列聚類成為操作分類單位(OTUs),使用R 軟件(Version 2.15.3)繪制稀釋曲線,并使用R 軟件的vegan 包進(jìn)行MRPP 分析檢驗(yàn)?zāi)c道菌群結(jié)構(gòu)差異。LEfSe 分析使用LEfSe 軟件,設(shè)置LDA Score 的篩選值為2。

        2 結(jié)果

        2.1 鴨胚胎發(fā)育過程中腸道形態(tài)觀察 由圖1可知,隨著胚胎的發(fā)育,腸腔體積不斷增加,腸絨毛數(shù)量增加,腸絨毛高度和肌層厚度變化不大。

        2.2 鴨胚胎發(fā)育過程中腸道微生物群落結(jié)構(gòu)分析 根據(jù)測(cè)序繪制OTUs 數(shù)量的稀疏曲線,評(píng)價(jià)測(cè)序量是否足以覆蓋所有物種,由表1可知,隨著樣本數(shù)量的增加,曲線趨于平緩,表明測(cè)序已達(dá)到飽和,測(cè)序數(shù)量足以反映腸道菌群的物種多樣性。MRPP 結(jié)果顯示,E16 組與D1 組間微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著(P<0.05),E16 組與E22 組、E22組與D1 組間微生物群落結(jié)構(gòu)差異不顯著(P>0.05)。

        表1 MRPP 組間差異分析

        2.3 鴨胚胎發(fā)育過程中腸道微生物的差異比較 韋恩圖顯示胚胎期與出殼后有45 個(gè)共有的微生物屬(圖2A),在胚胎期有沙雷氏菌(Serratia)、霍爾德曼氏菌、另枝菌、小桿菌、毛螺菌等62 個(gè)特有的微生物屬,出殼后有21 個(gè)特有的微生物屬,但含量均較少。由Lefse 分析可知(圖2B.C),擬桿菌門是胚胎期的標(biāo)志門,包括科水平上的Muribaculaceae、鞘脂桿菌科以及屬水平上的日大生科菌屬。厚壁菌門是出殼后的標(biāo)志門,包括屬水平上的羅姆布茨菌。在胚胎期,腸道微生物主要富集了乳酸桿菌、布勞特氏菌、糞桿菌、擬桿菌、無色桿菌5 種菌屬;在出殼后,腸道微生物主要富集了羅姆布茨菌、中慢生根瘤菌、藤黃色單胞菌3 種菌屬。

        3 討論

        近年來,關(guān)于哺乳動(dòng)物與禽類腸道微生物的功能和多樣性研究取得了很大進(jìn)展(Wang 等,2020;Zhu 等,2002)。大多數(shù)禽類腸道組織結(jié)構(gòu)發(fā)育程度與養(yǎng)分吸收密切相關(guān),在雞胚發(fā)育到18~19 d 時(shí)開始由小腸吸收卵黃,卵黃吸收與胚胎發(fā)育密切相關(guān)(Nangsuay 等,2011)。胚胎期的腸道發(fā)育有可能成為禽類終身健康的決定因素,而胚胎期腸道發(fā)育與微生物定植之間存在相互作用,腸道菌群可改善腸道發(fā)育(Dai 等,2020)。研究表明,在屬水平上,布勞特氏菌屬、羅氏菌屬的豐度與絨毛表面積呈顯著正相關(guān)(Dai 等,2021)。本研究發(fā)現(xiàn),隨著鴨胚胎的發(fā)育,腸絨毛數(shù)量和腸腔容積逐漸增加,其有可能與胚胎腸道高豐度毛螺菌科及富集布勞特氏菌屬相關(guān),進(jìn)而促進(jìn)胚胎腸道發(fā)育。

        為了適應(yīng)快速變化的發(fā)育環(huán)境,宿主不同發(fā)育階段的腸道微生物多樣性和豐度模式不同(Ding 等,2017)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在鴨胚胎期富集乳桿菌屬,其可促進(jìn)胃腸道組織發(fā)育,并與飼料轉(zhuǎn)換率和增重密切相關(guān)(Beck 等,2019)。在鴨胚胎期富集毛螺菌科,其與飼料轉(zhuǎn)換率和增重密切相關(guān)(Gong 等,2007)。在雛鴨腸道中,羅姆布茨菌屬的豐度較高,可參與維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài),促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收(Million 等,2017;Zhu 等,2002)。以上研究結(jié)果表明,胚胎不同發(fā)育階段腸道微生物的組成和豐度存在差異,說明胚胎中早期定植的微生物菌群在后期發(fā)育中受環(huán)境及宿主自身遺傳的影響,并對(duì)腸道發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)吸收及宿主生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。

        4 結(jié)論

        綜上所述,在鴨胚不同發(fā)育階段,鴨腸道已開始有微生物定植。在胚胎期,腸道微生物主要富集乳酸桿菌、布勞特氏菌、糞桿菌、擬桿菌、無色桿菌5 種菌屬,而出殼后,腸道微生物主要富集羅姆布茨菌、中慢生根瘤菌、藤黃色單胞菌3 種菌屬。說明隨著鴨胚胎發(fā)育及腸道發(fā)育,腸道微生物結(jié)構(gòu)及豐度存在差異,本研究為禽類胚胎期的腸道微生物定植研究提供參考,也為微生態(tài)制劑在畜牧業(yè)生產(chǎn)上的合理開發(fā)與應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

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