孫玲利，劉一思，浦發(fā)軍，郝振芳，寧俊平，楊小杰

（1.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南鄭州 451450；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，四川雅安 625014；3.汝州市畜牧局，河南汝州 467599）

腸道微生物在機(jī)體中的數(shù)量是體細(xì)胞數(shù)量的數(shù)倍，其在維持穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)、影響宿主生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了積極作用（Wen 等，2019）。同時(shí)，腸道微生物群也是重要的內(nèi)分泌器官，可通過(guò)多種途徑參與調(diào)控宿主能量、血糖和炎癥，且部分腸道核心菌群能夠參與宿主必需氨基酸、能量、輔因子和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝（Rastelli 等，2019）。由此可見，腸道微生物與畜禽生長(zhǎng)發(fā)育和生產(chǎn)性能密切相關(guān)。

胚胎期早期定植的最初微生物菌群會(huì)影響新陳代謝、胃腸道發(fā)育與成熟、免疫系統(tǒng)功能等，對(duì)畜禽腸道發(fā)育及相關(guān)器官的發(fā)育和健康具有重要意義。作為水禽，鴨具有在胚胎發(fā)育中期開始由小腸吸收卵黃的特點(diǎn)，卵黃是鴨胚胎發(fā)育的重要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，因此，胚胎時(shí)期的腸道發(fā)育及腸道功能對(duì)禽類具有重要意義。本研究通過(guò)對(duì)不同胚齡鴨盲腸進(jìn)行組織學(xué)觀察，并對(duì)胚胎發(fā)育不同時(shí)期的鴨胚胎的整個(gè)腸道進(jìn)行16s rRNA 測(cè)序，探究隨著鴨胚胎發(fā)育，腸道菌群結(jié)構(gòu)組成及演替規(guī)律，旨在為禽類胚胎期的腸道微生物定植研究提供參考，也為微生態(tài)制劑在畜牧業(yè)生產(chǎn)上的合理開發(fā)與應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集 試驗(yàn)選用來(lái)自于20月齡農(nóng)華麻鴨的種蛋，置于孵化機(jī)（倍立孵全自動(dòng)孵化機(jī)440型）中孵化，孵化溫度為37.2～37.8℃，濕度為55%～65%。種蛋在孵化器中的位置隨機(jī)分布，且種蛋重量平均為78.3 g，無(wú)顯著差異。在無(wú)菌條件下收集18 份樣品，包括孵化至第16（E16）、22 天（E22）的胚胎和出殼第一天（D1）的雛鴨的整個(gè)腸道，每個(gè)階段6 個(gè)樣品，用于腸道微生物的測(cè)定。將采集的樣品裝入EP 管中，立即在-80℃保存。采集孵化至E16、E22 的胚胎和出殼第一天的雛鴨的盲腸樣品保存在2%多聚甲醛溶液中，用于制作組織學(xué)切片觀察。剛孵出的雛鴨被養(yǎng)在無(wú)菌室里。胚胎標(biāo)本采集、微生物基因組DNA 提取、PCR 擴(kuò)增均采用無(wú)菌操作。

1.2 盲腸切片制作及組織學(xué)觀察 對(duì)盲腸進(jìn)行切片，以觀察隨卵黃吸收腸道絨毛變化情況。樣品用2% 多聚甲醛溶液固定后，用全自動(dòng)密閉式組織脫水機(jī)（Leica TP1020）進(jìn)行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟。脫水后的組織用石蠟包埋，切片厚度4μm，經(jīng)脫蠟后用HE 染色試劑盒（Solarbio）進(jìn)行HE 染色，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，用中性樹脂封片。用OLYMPUS BX53電子顯微鏡在低倍鏡下觀測(cè)切片，選擇典型視野，在高倍鏡下觀測(cè)視野中所有的完整絨毛，拍照。

1.3 DNA 提取及16S rRNA 測(cè)序 通過(guò)將16、22 胚齡和出殼第一天鴨胚胎的整個(gè)腸道勻漿后，采用常用的SDS 方法提取樣本基因組，并采用瓊脂糖凝膠電泳的方式檢測(cè)提取基因組的純度和濃度。同時(shí)，將提取樣本基因組使用無(wú)菌水進(jìn)行稀釋，使樣品DNA 的濃度稀釋至1 ng/μL。以稀釋濃度為1 ng/μL 樣品基因組DNA 為模板，擴(kuò)增所有微生物16Sr RNA 序列，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆與篩選，構(gòu)建16Sr RNA 基因文庫(kù)，對(duì)16Sr RNA 的V3～V4 高變區(qū)進(jìn)行測(cè)序和數(shù)據(jù)分析。樣本基因組的建庫(kù)、測(cè)序工作交由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 利用Uparse 軟件（Uparse v7.0.1001）對(duì)所有樣品的全部待分析數(shù)據(jù)（Clean Reads）進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97% 的一致性將序列聚類成為操作分類單位（OTUs），使用R 軟件（Version 2.15.3）繪制稀釋曲線，并使用R 軟件的vegan 包進(jìn)行MRPP 分析檢驗(yàn)?zāi)c道菌群結(jié)構(gòu)差異。LEfSe 分析使用LEfSe 軟件，設(shè)置LDA Score 的篩選值為2。

2 結(jié)果

2.1 鴨胚胎發(fā)育過(guò)程中腸道形態(tài)觀察 由圖1可知，隨著胚胎的發(fā)育，腸腔體積不斷增加，腸絨毛數(shù)量增加，腸絨毛高度和肌層厚度變化不大。

2.2 鴨胚胎發(fā)育過(guò)程中腸道微生物群落結(jié)構(gòu)分析 根據(jù)測(cè)序繪制OTUs 數(shù)量的稀疏曲線，評(píng)價(jià)測(cè)序量是否足以覆蓋所有物種，由表1可知，隨著樣本數(shù)量的增加，曲線趨于平緩，表明測(cè)序已達(dá)到飽和，測(cè)序數(shù)量足以反映腸道菌群的物種多樣性。MRPP 結(jié)果顯示，E16 組與D1 組間微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著（P＜0.05），E16 組與E22 組、E22組與D1 組間微生物群落結(jié)構(gòu)差異不顯著（P＞0.05）。

表1 MRPP 組間差異分析

2.3 鴨胚胎發(fā)育過(guò)程中腸道微生物的差異比較 韋恩圖顯示胚胎期與出殼后有45 個(gè)共有的微生物屬（圖2A），在胚胎期有沙雷氏菌（Serratia）、霍爾德曼氏菌、另枝菌、小桿菌、毛螺菌等62 個(gè)特有的微生物屬，出殼后有21 個(gè)特有的微生物屬，但含量均較少。由Lefse 分析可知（圖2B.C），擬桿菌門是胚胎期的標(biāo)志門，包括科水平上的Muribaculaceae、鞘脂桿菌科以及屬水平上的日大生科菌屬。厚壁菌門是出殼后的標(biāo)志門，包括屬水平上的羅姆布茨菌。在胚胎期，腸道微生物主要富集了乳酸桿菌、布勞特氏菌、糞桿菌、擬桿菌、無(wú)色桿菌5 種菌屬；在出殼后，腸道微生物主要富集了羅姆布茨菌、中慢生根瘤菌、藤黃色單胞菌3 種菌屬。

3 討論

近年來(lái)，關(guān)于哺乳動(dòng)物與禽類腸道微生物的功能和多樣性研究取得了很大進(jìn)展（Wang 等，2020；Zhu 等，2002）。大多數(shù)禽類腸道組織結(jié)構(gòu)發(fā)育程度與養(yǎng)分吸收密切相關(guān)，在雞胚發(fā)育到18～19 d 時(shí)開始由小腸吸收卵黃，卵黃吸收與胚胎發(fā)育密切相關(guān)（Nangsuay 等，2011）。胚胎期的腸道發(fā)育有可能成為禽類終身健康的決定因素，而胚胎期腸道發(fā)育與微生物定植之間存在相互作用，腸道菌群可改善腸道發(fā)育（Dai 等，2020）。研究表明，在屬水平上，布勞特氏菌屬、羅氏菌屬的豐度與絨毛表面積呈顯著正相關(guān)（Dai 等，2021）。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著鴨胚胎的發(fā)育，腸絨毛數(shù)量和腸腔容積逐漸增加，其有可能與胚胎腸道高豐度毛螺菌科及富集布勞特氏菌屬相關(guān)，進(jìn)而促進(jìn)胚胎腸道發(fā)育。

為了適應(yīng)快速變化的發(fā)育環(huán)境，宿主不同發(fā)育階段的腸道微生物多樣性和豐度模式不同（Ding 等，2017）。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在鴨胚胎期富集乳桿菌屬，其可促進(jìn)胃腸道組織發(fā)育，并與飼料轉(zhuǎn)換率和增重密切相關(guān)（Beck 等，2019）。在鴨胚胎期富集毛螺菌科，其與飼料轉(zhuǎn)換率和增重密切相關(guān)（Gong 等，2007）。在雛鴨腸道中，羅姆布茨菌屬的豐度較高，可參與維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收（Million 等，2017；Zhu 等，2002）。以上研究結(jié)果表明，胚胎不同發(fā)育階段腸道微生物的組成和豐度存在差異，說(shuō)明胚胎中早期定植的微生物菌群在后期發(fā)育中受環(huán)境及宿主自身遺傳的影響，并對(duì)腸道發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)吸收及宿主生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。

4 結(jié)論

綜上所述，在鴨胚不同發(fā)育階段，鴨腸道已開始有微生物定植。在胚胎期，腸道微生物主要富集乳酸桿菌、布勞特氏菌、糞桿菌、擬桿菌、無(wú)色桿菌5 種菌屬，而出殼后，腸道微生物主要富集羅姆布茨菌、中慢生根瘤菌、藤黃色單胞菌3 種菌屬。說(shuō)明隨著鴨胚胎發(fā)育及腸道發(fā)育，腸道微生物結(jié)構(gòu)及豐度存在差異，本研究為禽類胚胎期的腸道微生物定植研究提供參考，也為微生態(tài)制劑在畜牧業(yè)生產(chǎn)上的合理開發(fā)與應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。