張利衛(wèi),白欣潔,劉冠慧,張 曼,王 軍,彭永帥,李月勤,李 果,宋予震*
(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院,河南鄭州 450046;2.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系,北京 102442;3.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,河北邯鄲 056038)
在畜牧生產(chǎn)中,抗生素的使用受到了限制,為了提高畜禽生產(chǎn)性能和免疫功能,新型替抗產(chǎn)品得到了人們的廣泛關(guān)注。益生菌能產(chǎn)生活性物質(zhì)和抗菌物質(zhì),而這些產(chǎn)物在清除腸道致病菌,增強(qiáng)宿主腸道黏膜完整性等方面具有重要作用(Park等,2016;朱學(xué)泰,2007)。研究表明,復(fù)合益生菌制劑可以提高肉雞免疫功能,改善肉雞腸道菌群(謝文惠,2018;張曼等,2015)。付麗等(2015)研究表明,飼料中添加乳酸菌可以提高肉仔雞血清抗體水平。李可等(2015)研究發(fā)現(xiàn),飼糧添加丁酸梭菌、屎腸球菌等菌類可提高AA 肉仔雞的免疫器官指數(shù)。另外,Wu 等(2010)發(fā)現(xiàn),長雙歧桿菌有助于提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力。益生菌能對機(jī)體免疫器官的生長發(fā)育產(chǎn)生一定的刺激,從而提高機(jī)體免疫水平(唐志剛等,2010)。肉雞免疫器官是機(jī)體實(shí)現(xiàn)免疫功能的組織者(郭欣怡等,2016)。研究表明,復(fù)合益生菌制劑能通過提高肉雞免疫器官指數(shù)來提高肉雞免疫功能(葉思霖等,2021;桂雪兒,2020)。但益生菌提高肉雞免疫器官指數(shù)的作用機(jī)制尚不明確。因此,本試驗(yàn)研究益生菌對肉雞脾臟組織發(fā)育和淋巴細(xì)胞增殖的影響,確定益生菌影響肉雞脾臟免疫功能的作用途徑,從而為養(yǎng)禽業(yè)合理使用益生菌提供理論指導(dǎo)。
1.1 動(dòng)物飼養(yǎng)及取材 試驗(yàn)將75 只1日齡雄性肉雞隨機(jī)分為A、B、C、D 和E 5 組,每組5 只,每組3 個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)組A、B、C、D 組分別添加不同益生菌(益生菌具體成分和添加量如下表1示),E 為空白對照組,飼喂基礎(chǔ)日糧?;A(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表2。其中益生菌A、益生菌B 和益生菌D 是固態(tài)益生菌,與飼料混合添加,益生菌C 是液態(tài)益生菌,稀釋于水中飲用。益生菌由河南金百合生物科技股份有限公司提供。自由飲水,自由采食。飼養(yǎng)至21 d 后處死,取其脾臟于福爾馬林中固定。
表1 益生菌成分及添加劑量
表2 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平
1.2 石蠟切片制作 取出固定的脾臟組織進(jìn)行脫水和石蠟包埋,制作5 μm 厚的石蠟切片。
1.3 HE 染色 HE 染色步驟:二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min,逐級(jí)酒精各3 min,蘇木素6 min,1% 鹽酸酒精10 s,自來水10 min,逐級(jí)酒精3 min,伊紅1 min,95% 乙醇I 3 min、100% 乙醇3 min,二甲苯Ⅰ 3 min、二甲苯Ⅱ 3 min,中性樹膠封片。
1.4 免疫組織化學(xué)染色 免疫組織化學(xué)染色步驟:二甲苯I 和II,各10 min,逐級(jí)酒精各3 min,修復(fù)液水浴18 min,溫度 95℃。冷卻至常溫,0.01 mol PBS 漂洗3 次,每次5 min,3% 過氧化甲醇避光20~30 min。0.01 mol PBS 漂洗3 次,每次5 min,5% 山羊血清37℃ 30 min,PCNA 一抗(1 ∶4000)4℃冰箱過夜,室溫40 min,0.01 mol PBS 漂洗3 次,每次5 min。生物素標(biāo)記的二抗(羊抗兔IgG,1 ∶300),室溫2 h,PBS 漂洗3 次,每次5 min。滴加SABC 復(fù)合物,室溫2 h,PBS漂洗3 次,每次5 min。DAB 顯色液顯色,蒸餾水5 min,蘇木精染色液10 s。分色1.5 s,自來水沖洗10 min,蒸餾水3 min,逐級(jí)酒精各3 min,二甲苯I、二甲苯II 各5 min,中性樹膠封片。
1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 將HE 染色切片和免疫組織化學(xué)染色切片用生物顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照,用軟件ImageJ 統(tǒng)計(jì)各組脾小結(jié)面積、PCNA 免疫陽性細(xì)胞光密度和陽性細(xì)胞數(shù)量。各組數(shù)據(jù)用SPSS 26 進(jìn)行顯著性分析,P<0.05 表示差異顯著。
2.1 肉雞脾小結(jié)面積大小 由表3和圖1可知,A、B、C、D 組的脾小結(jié)面積比對照組分別增加30%(P>0.05)、35.8%(P>0.05)、60.97%(P<0.05)和51.94%(P<0.05)。這表明添加益生菌能促進(jìn)肉雞脾臟、脾小結(jié)生長。
表3 21日齡肉雞脾臟PCNA 陽性細(xì)胞數(shù)量
表3 21日齡肉雞脾小結(jié)面積
2.2 肉雞脾臟PCNA 免疫陽性細(xì)胞數(shù)量 由表4和圖2可知,A、B、C、D 組脾臟PCNA 免疫陽性細(xì)胞數(shù)量比對照組免疫陽性細(xì)胞數(shù)量分別增加46.61%(P<0.05)、35.55%(P<0.05)、27.35%(P<0.05)和38.67%(P<0.05)。這表明添加不同益生菌均能顯著增加脾臟PCNA 陽性細(xì)胞數(shù)量。
2.3 肉雞脾臟PCNA 免疫陽性細(xì)胞光密度 由表5和圖2可知,A、B、C、D 組脾臟PCNA 免疫陽性細(xì)胞光密度比對照組免疫陽性細(xì)胞光密度分別顯著增加11.74%(P<0.05)、12.52%(P<0.05)、9.04%(P<0.05)和8.57%(P<0.05),表明添加不同益生菌能提高肉雞脾臟PCNA 免疫陽性細(xì)胞光密度。
表5 21日齡肉雞脾臟PCNA 陽性細(xì)胞光密度
益生菌是一種微生態(tài)制劑,具有綠色、安全、無污染等優(yōu)點(diǎn)。益生菌在肉雞生長性能和免疫強(qiáng)度提高方面發(fā)揮著重要作用。于明等(2021)研究表明,飼料中添加復(fù)合益生菌制劑能提高肉雞料重比,提高血清中IgA 和IgG 水平,增加盲腸有益菌群數(shù)量,從而提高肉雞免疫功能。李桂杰等(2000)研究表明,加酶益生素能明顯促進(jìn)肉仔雞生長,提高飼料轉(zhuǎn)化率。
張利環(huán)等(2021)研究發(fā)現(xiàn),益生菌能增強(qiáng)消化酶的分泌和活性,益生菌可以改善消化道形態(tài),調(diào)節(jié)細(xì)胞膜GLUT2 過表達(dá),促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn),從而提高肉雞生長性能。同樣,劉鳳美等(2018)研究發(fā)現(xiàn),益生菌能提高肉雞生產(chǎn)性能、胸腺、脾臟和法氏囊指數(shù),改善肉雞免疫抗病能力。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)益生菌能通過增加脾小結(jié)的面積來促進(jìn)脾臟發(fā)育。
益生菌可能通過促進(jìn)免疫器官、淋巴細(xì)胞的增殖來提高肉雞的免疫功能。韓亞楠等(2021)發(fā)現(xiàn),益生菌可以增強(qiáng)肉雞法氏囊的免疫功能,從而提高肉雞免疫力。本試驗(yàn)結(jié)果表明,添加不同益生菌均能提高脾臟增殖淋巴細(xì)胞的數(shù)量和光密度,表明益生菌能提高免疫器官淋巴細(xì)胞的增殖。
本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與對照組相比,試驗(yàn)組脾臟免疫陽性細(xì)胞數(shù)量和免疫陽性細(xì)胞光密度具有顯著差異,表明益生菌對肉雞脾臟發(fā)育和脾臟內(nèi)淋巴細(xì)胞增殖具有一定的促進(jìn)作用。