張利衛(wèi)，白欣潔，劉冠慧，張 曼，王 軍，彭永帥，李月勤，李 果，宋予震*

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院，河南鄭州 450046；2.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，北京 102442；3.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲 056038）

在畜牧生產(chǎn)中，抗生素的使用受到了限制，為了提高畜禽生產(chǎn)性能和免疫功能，新型替抗產(chǎn)品得到了人們的廣泛關(guān)注。益生菌能產(chǎn)生活性物質(zhì)和抗菌物質(zhì)，而這些產(chǎn)物在清除腸道致病菌，增強(qiáng)宿主腸道黏膜完整性等方面具有重要作用（Park等，2016；朱學(xué)泰，2007）。研究表明，復(fù)合益生菌制劑可以提高肉雞免疫功能，改善肉雞腸道菌群（謝文惠，2018；張曼等，2015）。付麗等（2015）研究表明，飼料中添加乳酸菌可以提高肉仔雞血清抗體水平。李可等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加丁酸梭菌、屎腸球菌等菌類可提高AA 肉仔雞的免疫器官指數(shù)。另外，Wu 等（2010）發(fā)現(xiàn)，長雙歧桿菌有助于提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力。益生菌能對機(jī)體免疫器官的生長發(fā)育產(chǎn)生一定的刺激，從而提高機(jī)體免疫水平（唐志剛等，2010）。肉雞免疫器官是機(jī)體實(shí)現(xiàn)免疫功能的組織者（郭欣怡等，2016）。研究表明，復(fù)合益生菌制劑能通過提高肉雞免疫器官指數(shù)來提高肉雞免疫功能（葉思霖等，2021；桂雪兒，2020）。但益生菌提高肉雞免疫器官指數(shù)的作用機(jī)制尚不明確。因此，本試驗(yàn)研究益生菌對肉雞脾臟組織發(fā)育和淋巴細(xì)胞增殖的影響，確定益生菌影響肉雞脾臟免疫功能的作用途徑，從而為養(yǎng)禽業(yè)合理使用益生菌提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物飼養(yǎng)及取材 試驗(yàn)將75 只1日齡雄性肉雞隨機(jī)分為A、B、C、D 和E 5 組，每組5 只，每組3 個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)組A、B、C、D 組分別添加不同益生菌（益生菌具體成分和添加量如下表1示），E 為空白對照組，飼喂基礎(chǔ)日糧?；A(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表2。其中益生菌A、益生菌B 和益生菌D 是固態(tài)益生菌，與飼料混合添加，益生菌C 是液態(tài)益生菌，稀釋于水中飲用。益生菌由河南金百合生物科技股份有限公司提供。自由飲水，自由采食。飼養(yǎng)至21 d 后處死，取其脾臟于福爾馬林中固定。

表1 益生菌成分及添加劑量

表2 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平

1.2 石蠟切片制作 取出固定的脾臟組織進(jìn)行脫水和石蠟包埋，制作5 μm 厚的石蠟切片。

1.3 HE 染色 HE 染色步驟：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min，逐級(jí)酒精各3 min，蘇木素6 min，1% 鹽酸酒精10 s，自來水10 min，逐級(jí)酒精3 min，伊紅1 min，95% 乙醇I 3 min、100% 乙醇3 min，二甲苯Ⅰ 3 min、二甲苯Ⅱ 3 min，中性樹膠封片。

1.4 免疫組織化學(xué)染色 免疫組織化學(xué)染色步驟：二甲苯I 和II，各10 min，逐級(jí)酒精各3 min，修復(fù)液水浴18 min，溫度 95℃。冷卻至常溫，0.01 mol PBS 漂洗3 次，每次5 min，3% 過氧化甲醇避光20～30 min。0.01 mol PBS 漂洗3 次，每次5 min，5% 山羊血清37℃ 30 min，PCNA 一抗（1 ∶4000）4℃冰箱過夜，室溫40 min，0.01 mol PBS 漂洗3 次，每次5 min。生物素標(biāo)記的二抗（羊抗兔IgG，1 ∶300），室溫2 h，PBS 漂洗3 次，每次5 min。滴加SABC 復(fù)合物，室溫2 h，PBS漂洗3 次，每次5 min。DAB 顯色液顯色，蒸餾水5 min，蘇木精染色液10 s。分色1.5 s，自來水沖洗10 min，蒸餾水3 min，逐級(jí)酒精各3 min，二甲苯I、二甲苯II 各5 min，中性樹膠封片。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 將HE 染色切片和免疫組織化學(xué)染色切片用生物顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照，用軟件ImageJ 統(tǒng)計(jì)各組脾小結(jié)面積、PCNA 免疫陽性細(xì)胞光密度和陽性細(xì)胞數(shù)量。各組數(shù)據(jù)用SPSS 26 進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉雞脾小結(jié)面積大小 由表3和圖1可知，A、B、C、D 組的脾小結(jié)面積比對照組分別增加30%（P＞0.05）、35.8%（P＞0.05）、60.97%（P＜0.05）和51.94%（P＜0.05）。這表明添加益生菌能促進(jìn)肉雞脾臟、脾小結(jié)生長。

表3 21日齡肉雞脾臟PCNA 陽性細(xì)胞數(shù)量

表3 21日齡肉雞脾小結(jié)面積

2.2 肉雞脾臟PCNA 免疫陽性細(xì)胞數(shù)量 由表4和圖2可知，A、B、C、D 組脾臟PCNA 免疫陽性細(xì)胞數(shù)量比對照組免疫陽性細(xì)胞數(shù)量分別增加46.61%（P＜0.05）、35.55%（P＜0.05）、27.35%（P＜0.05）和38.67%（P＜0.05）。這表明添加不同益生菌均能顯著增加脾臟PCNA 陽性細(xì)胞數(shù)量。

2.3 肉雞脾臟PCNA 免疫陽性細(xì)胞光密度 由表5和圖2可知，A、B、C、D 組脾臟PCNA 免疫陽性細(xì)胞光密度比對照組免疫陽性細(xì)胞光密度分別顯著增加11.74%（P＜0.05）、12.52%（P＜0.05）、9.04%（P＜0.05）和8.57%（P＜0.05），表明添加不同益生菌能提高肉雞脾臟PCNA 免疫陽性細(xì)胞光密度。

表5 21日齡肉雞脾臟PCNA 陽性細(xì)胞光密度

3 討論

益生菌是一種微生態(tài)制劑，具有綠色、安全、無污染等優(yōu)點(diǎn)。益生菌在肉雞生長性能和免疫強(qiáng)度提高方面發(fā)揮著重要作用。于明等（2021）研究表明，飼料中添加復(fù)合益生菌制劑能提高肉雞料重比，提高血清中IgA 和IgG 水平，增加盲腸有益菌群數(shù)量，從而提高肉雞免疫功能。李桂杰等（2000）研究表明，加酶益生素能明顯促進(jìn)肉仔雞生長，提高飼料轉(zhuǎn)化率。

張利環(huán)等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，益生菌能增強(qiáng)消化酶的分泌和活性，益生菌可以改善消化道形態(tài)，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜GLUT2 過表達(dá)，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，從而提高肉雞生長性能。同樣，劉鳳美等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，益生菌能提高肉雞生產(chǎn)性能、胸腺、脾臟和法氏囊指數(shù)，改善肉雞免疫抗病能力。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)益生菌能通過增加脾小結(jié)的面積來促進(jìn)脾臟發(fā)育。

益生菌可能通過促進(jìn)免疫器官、淋巴細(xì)胞的增殖來提高肉雞的免疫功能。韓亞楠等（2021）發(fā)現(xiàn)，益生菌可以增強(qiáng)肉雞法氏囊的免疫功能，從而提高肉雞免疫力。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加不同益生菌均能提高脾臟增殖淋巴細(xì)胞的數(shù)量和光密度，表明益生菌能提高免疫器官淋巴細(xì)胞的增殖。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，試驗(yàn)組脾臟免疫陽性細(xì)胞數(shù)量和免疫陽性細(xì)胞光密度具有顯著差異，表明益生菌對肉雞脾臟發(fā)育和脾臟內(nèi)淋巴細(xì)胞增殖具有一定的促進(jìn)作用。