謝鋒華 農(nóng)知旺 吳 娟 郭珍珍 竺錫武

（湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，湖南婁底 417000）

植物病蟲害嚴(yán)重威脅作物的生長，影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。雖然噴施化學(xué)農(nóng)藥能有效減輕病蟲害對作物的危害，但長期大量使用化學(xué)農(nóng)藥易使其產(chǎn)生抗性，也會對環(huán)境造成污染。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，基因改良在作物抗病蟲害中的應(yīng)用越來越多。RNAi具有特異性、高效性、高穩(wěn)定性、可遺傳性和可傳遞性等優(yōu)點[1]，對病蟲害防治具有重大意義。

1 RNAi的概念及原理

1.1 RNAi概述

RNAi即 RNA 干擾（RNA interference），是指在進化過程中高度保守的、由mRNA同源互補序列的雙鏈RNA（dsRNA）介導(dǎo)的、mRNA高效特異性降解的基因沉默現(xiàn)象[2-3]。RNAi是近年來在基因功能研究中的重要發(fā)現(xiàn)，發(fā)生在除原核細(xì)胞以外的所有真核生物細(xì)胞內(nèi)，具有重要的生物學(xué)功能[4-5]。RNAi發(fā)生過程主要有3個階段：第一階段，dsRNA被細(xì)胞內(nèi)的核酸內(nèi)切酶Dicer切割成21～23 bp的具有特定結(jié)構(gòu)的小分子雙鏈 RNA（small interfering RNA，siRNA）[6]；第二階段，siRNA在解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，再由反義siRNA在核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶及解旋酶的輔助下識別同源序列蛋白，與siRNA結(jié)合形成siRNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（siRNA-induced interference complex，RISC），RISC 會 與 靶 mRNA 識別并將其降解[7-9]；第三階段，siRNA反義鏈可以作為引物與靶mRNA結(jié)合，在依賴于RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）的催化下形成新的dsRNA[10]，新合成的dsRNA又可以被Dicer剪切形成大量新的siRNA，這樣不斷進行隨機降解性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（random degradative PCR），使細(xì)胞中的siRNA分子不斷增多，RNAi的作用被進一步放大，最終將靶mRNA完全降解[11-12]。

1.2 病毒誘導(dǎo)的基因沉默

病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）是以RNA干擾為基礎(chǔ)，主要用于研究動植物基因功能的一種遺傳技術(shù)。它是通過插入目的基因片段的重組病毒載體侵染植物后，沉默植物或動物的內(nèi)源基因，使其功能表型出現(xiàn)變化，根據(jù)表型變化來研究基因功能，其屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默（posttranscriptional gene silencing，PTGS）。 VIGS 是植物防御RNA病毒侵染的自然機制，可以阻止病毒在植物細(xì)胞中的增殖與擴散，在阻止病毒入侵的同時，也會抑制與植物內(nèi)源基因同源片段的表達，屬于一種PTGS的類RNAi現(xiàn)象，普遍存在于植物體中[13-15]。

1.3 寄主誘導(dǎo)的基因沉默

寄主誘導(dǎo)的基因沉默（host induced gene silencing，HIGS）是以RNA干擾為基礎(chǔ)，對VIGS的進一步發(fā)展。在病害防治中，以病原真菌生長發(fā)育和侵染過程中的關(guān)鍵基因為靶基因，通過靶標(biāo)基因的RNA干擾載體在寄主植物中表達，沉默病原真菌中的靶標(biāo)基因，抑制病原真菌的生長與入侵，從而提高寄主植物的抗病性[16-18]。在蟲害防治中，主要以害蟲生長發(fā)育或重要行為過程中的關(guān)鍵基因為靶基因，通過靶標(biāo)基因的小干擾RNA抑制目的基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄，沉默靶標(biāo)信使RNA，使害蟲的正常生長發(fā)育受到阻礙，從而提高寄主植物抗蟲的能力[19-20]。

2 RNAi在植物病害防治中的應(yīng)用

植物病毒種類多、危害嚴(yán)重，感染病毒的作物產(chǎn)量和品質(zhì)大幅度下降。利用RNA干擾技術(shù)可以特異性降解植物中病毒的靶基因，使病毒基因沉默，從而防治植物病害。

在小麥病害防治上，楊鵬[21]以赤霉菌基因（Chs7-3，Chs7-4，Gls-6 和 Myo II-14）為靶基因，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入小麥，得到的轉(zhuǎn)基因植株增強了小麥對赤霉病的抗性。Panwar等[22]等通過根癌農(nóng)桿菌的介導(dǎo)，沉默了小麥銹菌編碼的親環(huán)蛋白（PtCYC1）、MAP激酶（PtMAPK1）、鈣調(diào)磷酸酶 B（PtCNB）基因，沉默后抑制了菌絲的生長和真菌孢子的產(chǎn)生，明顯減輕小麥銹病的發(fā)生。BSMV-HIGS體系[23]成功沉默了小麥銹菌中的多個致病基因，如分泌蛋白基因Pst8713、蛋白激酶（Ps SRPKL）[24]、MADX 轉(zhuǎn)錄子（PstMCM1-1）[25]、小的 GTP 結(jié)合蛋白（PsRan）等，沉默后會抑制菌絲的生長與擴散，從而減輕小麥銹病的發(fā)生。

在水稻病害防治上，許趙蒙[26]對OsSBR1過表達水稻株系和基因編輯純合突變株系進行離體葉片接種鑒定，根據(jù)病斑面積大小，OsSBR1過表達株系表現(xiàn)出紋枯病感病，而基因編輯株系表現(xiàn)出抗病，從而驗證了OsSBR1對紋枯病抗性的負(fù)調(diào)控。唐 喆等[27]利用對稻瘟病菌分生孢子萌發(fā)有重要作用的RHO1基因為靶基因構(gòu)建RNAi干擾載體，將其導(dǎo)入日本晴水稻品種中，得到了抗稻瘟病菌的轉(zhuǎn)基因水稻。Zhu等[28]通過雀麥花葉病毒誘導(dǎo)的RNA干擾，以MoMAC1、MoABC1和MoPMK1等3個致病基因為靶基因，將其接種到水稻上，能夠顯著提高水稻對稻瘟病菌的抗性。趙玉丹等[29]以EIL6基因為靶標(biāo)基因構(gòu)建RNAi干擾載體pRTV-nHA-OsEIL6，將其導(dǎo)入水稻品種泰粳394中，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)基因水稻降低了對稻瘟病的抗性。Ahmed等[30]以水稻黑條矮縮病毒的致病關(guān)鍵基因P7-2和P8為靶標(biāo)基因?qū)胨竞?，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻對病毒有較強的抗性。

在其他作物病害防治上，Xu等[31]在棉花中表達靶向棉花黃萎病病菌G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（Vd-RGS1）的RNA干擾載體，增強了棉花對黃萎病的抗性。Ghag等[32]通過內(nèi)含子發(fā)夾RNA（ihpRNA）介導(dǎo)的真菌基因為靶基因構(gòu)建小干擾RNA（ihpRNA-VEL和ihpRNA-FTF1），利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入香蕉，得到的轉(zhuǎn)基因香蕉株系能夠抑制枯萎菌絲的生長，從而提高了香蕉植株對枯萎病的抗性。Zhang等[33]利用參與植物細(xì)胞分化、增殖、衰老和死亡的DEKs基因為靶基因構(gòu)建RNAi干擾載體，沉默后發(fā)現(xiàn)番茄對灰霉病菌和假單胞菌的抗病性降低。Noman[34]等利用MYB轉(zhuǎn)錄因子CaPHL8基因為靶基因，將其轉(zhuǎn)入辣椒后發(fā)現(xiàn)接種青枯病病菌植株的CaPHL8表達上調(diào)，使辣椒降低了對青枯病的抗病性。

3 RNAi在害蟲防治中的應(yīng)用

RNAi抗蟲技術(shù)利用RNAi技術(shù)沉默在害蟲生長發(fā)育或重要行為過程中的關(guān)鍵基因，阻礙害蟲正常的生長和繁殖，導(dǎo)致害蟲死亡，從而降低害蟲的危害程度。

大多數(shù)研究通過RNAi技術(shù)抑制害蟲生長發(fā)育來防治害蟲，孫李曈[35]以脫落酸合成的一種關(guān)鍵基因9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶基因（OsNCED3）為靶基因，發(fā)現(xiàn)過表達OsNCED3基因的水稻上褐飛虱的數(shù)量最低，且水稻植株平均受害級別顯著低于對照，使稻飛虱的生長發(fā)育受阻，說明過表達OsNCED3基因的水稻對褐飛虱具有一定的抗性。將以棉鈴蟲幾丁質(zhì)酶基因（HaCHI）為靶基因的dsRNA轉(zhuǎn)入煙草中，沉默了棉鈴蟲的幾丁質(zhì)酶基因，使棉鈴蟲幼蟲發(fā)育畸形，從而抑制棉鈴蟲的生長[36]。梁思佳[37]以影響中黑盲蝽生殖能力的As FAR基因為靶標(biāo)，將其轉(zhuǎn)入棉花，當(dāng)中黑盲蝽取食該轉(zhuǎn)基因棉花后，發(fā)現(xiàn)中黑盲蝽的生長發(fā)育受到了影響，說明該轉(zhuǎn)基因棉花對中黑盲蝽有較強的抗性。Gurusamy等[38]利用Cellfectin Ⅱ轉(zhuǎn)染試劑構(gòu)建的RNAi干擾載體，將其飼喂草地貪夜蛾幼蟲，發(fā)現(xiàn)iap基因顯著下調(diào)，導(dǎo)致幼蟲的生長發(fā)育受到影響，從而抑制害蟲草地貪夜蛾的生長。Shivakumara等[39]利用msp-18和msp-20基因為靶基因，得到表達msp-18和msp-20的轉(zhuǎn)基因茄子，在轉(zhuǎn)基因茄子中南方根瘤菌的增殖分別減少了43.64%～69.68%和41.74%～67.30%，在生長發(fā)育的線蟲中，南方根瘤菌細(xì)胞壁修飾酶（CWMEs）與先鋒基因有著相互作用，先鋒基因msp-18和msp-20通過影響入侵線蟲CWME基因的穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)錄水平來提高茄子的抗線蟲性。

還有些研究是利用RNAi技術(shù)降低害蟲對化學(xué)農(nóng)藥的抗性來防治害蟲。常 蕾等[40]利用Q型煙粉虱的一個P450基因（CYP6CM1）和一個羧酸酯酶基因（Coe1）為靶基因構(gòu)建雙價RNAi載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入煙草，采用轉(zhuǎn)基因煙草喂養(yǎng)煙粉虱，發(fā)現(xiàn)煙粉虱CYP6CM1基因和Coe1基因的表達顯著降低，從而降低了煙粉虱對有機磷類殺蟲劑辛硫磷和煙堿類殺蟲劑阿維·吡蟲啉的抗藥性，顯著提高了殺蟲劑的防治效果。范繼巧等[41]利用蘋果黃蚜的P450基因AcCYP6CY14為靶基因構(gòu)建RNAi載體，沉默了蘋果黃蚜的P450基因AcCYP6CY14，沉默后極顯著提高了蘋果黃蚜對吡蟲啉的敏感性，蘋果黃蚜的死亡率提高了65.2%，從而提高了殺蟲劑的防治效果。

4 存在的問題及展望

RNAi技術(shù)作為新型綠色環(huán)保的病蟲害防治技術(shù)，有著良好的應(yīng)用前景，特別是在動植物基因功能的發(fā)掘與鑒定中發(fā)揮著重要作用。但是，RNAi技術(shù)的應(yīng)用也存在一些問題。首先，RNAi能夠特異性地降低或抑制靶基因表達，但靶基因的沉默效率難以控制，且建立遺傳轉(zhuǎn)化體系需要很長時間，增加了科研周期[42]。同時，得到的轉(zhuǎn)基因植株在鑒定時會出現(xiàn)假陽性以及轉(zhuǎn)基因植物的安全性都是無法回避的問題。其次，RNAi如何實現(xiàn)大田應(yīng)用，在大田使用RNAi防治病蟲害是否也會像化學(xué)農(nóng)藥一樣使病蟲害對其產(chǎn)生抗性等問題都有待深入研究[43-44]。隨著科研的不斷攻關(guān)，越來越多的技術(shù)將會被發(fā)掘，而用RNAi聯(lián)合其他措施對病蟲害進行綜合防治將會成為一種趨勢[45]。相信隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，RNAi的應(yīng)用前景會越來越廣闊。