陶丹 劉莉 楊家義

糖尿病在全球的患病率很高,根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟2013 年的最新調(diào)查結(jié)果證明,中國擁有9800 萬 糖尿病患者,是全球20～79 歲DM 患者數(shù)量最多的國家［1］。我國糖尿病流行病特點以2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM) 為主,1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)約占5%,多于兒童或青少年時期起病,在兒童及青少年患者中,T1DM 所占比例約為80%～90%［2］。根據(jù)在2009 年國際糖尿病聯(lián)合會對外公布的總數(shù)據(jù),全球T1DM 患兒約有3000 萬,其中我國有100 萬患兒［3］。且根據(jù)流行病學(xué)的調(diào)查報告研究得出T1DM 的發(fā)病率正在以每年近3%的速率急速增長,且患兒逐漸面向低齡化的趨勢［4］。T1DM 已成為危害青少年身體健康的公共衛(wèi)生問題。美國的一項流行病學(xué)調(diào)查研究結(jié)果顯示,病程在3～4 年的時間的患者,其中T1DM 的糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic Retinopathy,DR)發(fā)生率為19%,T2DM 的DR 患病率達(dá)24%；在已有20 年病程的T1DM 的患者中,患DR 的幾率幾乎為100%,在同樣有20 年病程的T2DM 患者中,患DR 的幾率達(dá)60%；而在病程＞20 年的患者中,50%左右的T1DM 患者會發(fā)生增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR)。目前DR 已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)勞動年齡人口失明的最重要原因［5］。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長度為18～25 個核苷酸、內(nèi)生性單鏈非編碼RNA分子,對DR 形成進(jìn)行期間的細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期與血管形成等過程施加了一定影響。DR 發(fā)生的發(fā)病機制不清,了解miRNA 在DR 發(fā)生發(fā)展中的作用機制,將有助于闡明DR 的發(fā)病機制,對預(yù)防和控制DR 的發(fā)生發(fā)展提供新的思路和方案,本文就miRNA與1 型糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病機制的相關(guān)研究進(jìn)展綜述如下。

1 1 型糖尿病視網(wǎng)膜病變的流行病學(xué)調(diào)查

2007～2008 年,中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會組織全國14 個省市進(jìn)行糖尿病流行病學(xué)調(diào)查［6］,調(diào)查結(jié)果顯示我國約有9240 萬的成人糖尿病患者,其中9.7%的糖尿病患者的年齡＞20 歲［7］。2011 年IDF 統(tǒng)計,全球年齡＜15 歲的兒童中,約有49 萬的T1DM 患者,每年新增7.7 萬人,年增加率約3.0%［8］。Roy 等［9］研究發(fā)現(xiàn)美國白種人及黑種人18～30 歲的T1DM 患者中,DR的發(fā)病率分別為82.3%和74.9%。Malone 等［10］研究發(fā)現(xiàn)5 年病程1613 例T1DM 的患者,67.1%患有DR。Klein 研究［11］報道T1DM 患者4 年病程內(nèi)DR 的發(fā)病率為49%,研究同時發(fā)現(xiàn)T1DM 患者病程1 年內(nèi)的DR發(fā)病率為20%,并因此建議T1DM 患者在確診1 年內(nèi)進(jìn)行擴瞳后眼底檢查。

對于T1DM 患者DR 的篩查時機沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。美國糖尿病醫(yī)療標(biāo)準(zhǔn)推薦T1DM 成年人應(yīng)在糖尿病發(fā)病后5 年內(nèi),由眼科醫(yī)師或驗光師進(jìn)行初次的散瞳眼部綜合檢查［12］。英國指南建議T1DM 患者應(yīng)從12 歲開始DR 的眼底篩查；澳大利亞指南認(rèn)為青春期前診斷的T1DM 患者應(yīng)在青春期后開始DR 篩查；加拿大指南推薦在青春期之后診斷的糖尿病患者應(yīng)在診斷3～5 年后開始DR 篩查。我國建議青春期前或青春期診斷的T1DM 患者在青春期(12 歲)后開始檢查眼底,青春期后診斷T1DM 的患者建議在病程5 年內(nèi),必須進(jìn)行第1 次DR 篩查,同時建議T1DM 患者開始DR 篩查后至少每年復(fù)查1 次［13］。

2 miRNA 概述

1993 年Lee 等［14］首次在線蟲發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)了被命名為lin-4 第1 個miRNA。此后,研究人員在多個生物物種中,都發(fā)現(xiàn)了miRNA 的存在。至今已被成功克隆排序的人類基因量在800 個以上,預(yù)估m(xù)iRNA 基因數(shù)量在1000 個以上,同時所調(diào)控的人類基因占比已達(dá)30%以上［15］。miRBase 數(shù)據(jù)庫(由英國Sanger 研究所構(gòu)建)［16］在記錄miRNA 序列諸數(shù)據(jù)庫中,其最具權(quán)威性,截止當(dāng)前,此數(shù)據(jù)庫所收錄的成熟miRNA 序列信息類型已達(dá)25141 種,涉及到193 個物種。miRNA占動物基因總數(shù)的1%～5%［17］,在人類基因組中,估計編碼＞1000 個mRNA,其中miRNA 可能調(diào)控＞1/3 的蛋白編碼基因［18］。

miRNA 屬于一類單鏈非編碼RNA 小分子,其長度為20～24 個核苷酸左右,由內(nèi)源性發(fā)夾型轉(zhuǎn)錄而 成［19］。其對任何蛋白質(zhì)均不具備編碼功能,是一類新型的基因表達(dá)調(diào)控因子。多個mRNA 的表達(dá)可被單個miRNA 調(diào)節(jié)；而且60%以上的mRNA 含若干條miRNA 的結(jié)合位點,能夠同時與若干miRNA 發(fā)生交互反應(yīng)。miRNA 所具備的特征有：表達(dá)的時序性、保守性以及高度特異性。從生物學(xué)角度看,MiRNA 的合成過程非常復(fù)雜［20］,首先,在細(xì)胞核內(nèi),在RNA 聚合酶Ⅱ介導(dǎo)下,經(jīng)轉(zhuǎn)錄生成“發(fā)夾”pri-miRNA,此物質(zhì)具備特征性莖環(huán)結(jié)構(gòu),之后,被Drosha/DGCR8 此蛋白復(fù)合體核心區(qū)域基因識別與切割,產(chǎn)生pre-miRNA。核-胞質(zhì)穿梭蛋白可識別此產(chǎn)物,同時促進(jìn)其向細(xì)胞質(zhì)遷移,在核糖核酸Ⅲ Dicer 作用下,待將較短的(21-23)nt雙鏈RNA 序列留下,接著結(jié)合Ago 蛋白,轉(zhuǎn)變?yōu)镽NA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)。此復(fù)合體的成熟態(tài)能夠互補配對結(jié)合靶mRNA 的3'非編碼區(qū)(3'UTR),對靶mRNA表達(dá)進(jìn)行阻抑,進(jìn)而抑制或降解靶mRNA 翻譯。

3 miRNA 與糖尿病視網(wǎng)膜病變

近期,miRNA 被證明是糖尿病重要的調(diào)節(jié)者和參與者。通過研究,Latreille 等［21］提出,對于胰島B 細(xì)胞生成胰島素的功能,miRNA-7a 發(fā)揮著負(fù)向調(diào)控效應(yīng),將小鼠B 細(xì)胞所含miRNA-7a 作敲除處理,可以提升胰島素分泌量。就miRNA-187 表達(dá)水平而言,相較于正常群體,T2DM 患者較高,miRNA-187 表達(dá)上調(diào),可以對HIPK3 施以調(diào)控,導(dǎo)致胰島素的釋放受抑,表明,通過下調(diào)miRNA-187 的表達(dá),能夠治療T2DM［22］。Setyowati 等［23］對GK 大鼠開展了相關(guān)研究,結(jié)果表明,相較于健康組大鼠,糖尿病組的實驗動物在29 類miRNA 的表達(dá)上,表現(xiàn)出了明顯的差別,這些miRNA中,脂肪組織內(nèi)miRNA-222 以及miRNA-27a 顯示表達(dá)增強,肝組織內(nèi)的miRNA-195 以及miRNA-103 也顯示為表達(dá)上調(diào)。在肌肉細(xì)胞中miRNA-10b 的表達(dá)下調(diào)［24］,在外周血單核細(xì)胞中miRNA-146a 的表達(dá)下調(diào)［25］。同時,Kong 等［26］通過檢測DM 患者血漿中 的miRNA 發(fā) 現(xiàn)miRNA-9、miRNA-29a、miRNA-30d、miRNA-34a、miRNA-124a、miRNA-146 及miRNA-3757 的表達(dá)發(fā)生了改變。

通過微陣列技術(shù),Xu 等［27］首次從成年小鼠中分離獲得80 個不同的miRNA,其中在視網(wǎng)膜呈特異性表達(dá)的miRNA 有23 個。近年隨著下一代測序技術(shù)(next generation sequencing,NGS)的發(fā)展和運用,大大提高了miRNA 檢出的敏感性,在視網(wǎng)膜中發(fā)現(xiàn)超過約250 個miRNA 的表達(dá)［28］。

視網(wǎng)膜新生血管的形成以及血管通透性的增強是DR 發(fā)生的重要機制。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在DR 病理反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵性的影響,若此因子水平增強,能夠促進(jìn)血管生成,同時可提升血管通透性。VEGF 與細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合后,激活細(xì)胞內(nèi)多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移、形成新生血管腔。Kovacs 等［29］對比檢測了正常和糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織的miRNA,結(jié)果發(fā)現(xiàn)86 種miRNA 在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中有顯著差異性表達(dá),這與視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生密切相關(guān)。同時證實由VEGF 誘導(dǎo)的6 種miRNA(miR-17-5p、miR-18a、miR-20a、miR-21、miR-31 和miR-155)在DR 大鼠的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(retinal endothelial cells,REC)中表達(dá)增高,提示miRNA 可能通過調(diào)控VEGF 表達(dá)增高而參與了DR 發(fā)生的病理過程。McArthur 等［30］研究發(fā)現(xiàn)miR-200b在高糖處理的內(nèi)皮細(xì)胞及DM 大鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)下降,而其直接靶基因VEGF mRNA 及蛋白表達(dá)均增加。Murray 等［31］對大鼠視網(wǎng)膜Müller 細(xì)胞采取了誘導(dǎo)處理,所用誘導(dǎo)劑為miRNA-200b 增強劑,結(jié)果發(fā)現(xiàn),同存在一定聯(lián)系關(guān)的4-羥基壬烯醛(4-HNE)此氧化應(yīng)激源顯示為程度不等的增加,可見,在視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激(OS)機制中,miRNA-200b 發(fā)揮著抗細(xì)胞凋亡效能,同時發(fā)現(xiàn)miRNA-200b 還能作用下游的抗氧化1(oxidation resistance 1,Oxr1)基因,從而對DM 起到保護(hù)作用。此外,內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)miRNA-1 表達(dá)減弱,導(dǎo)致其靶基因ET-1 和纖連蛋白量升高,導(dǎo)致眼底視網(wǎng)膜血管收縮與纖維沉淀的發(fā)生［32］。

核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)在REC 增殖以及表達(dá)諸多類型的炎癥相關(guān)基因方面,發(fā)揮著調(diào)控樞紐作用,同DR 的形成、進(jìn)行存在顯著聯(lián)系。miRNA 與視網(wǎng)膜炎性反應(yīng)有關(guān)。miR-146a 參與NF-κB 炎癥通路的調(diào)節(jié)［33］。相關(guān)實驗結(jié)果表明,對DM 小鼠的REC 具備誘導(dǎo)作用的miR-146、miR-21、miR-132 以及miR-155 存在不斷升高表現(xiàn),導(dǎo)致RECNF-κB 途徑的活化,從而促進(jìn)其下游基因MCF-1 以及黏附因子-1 的轉(zhuǎn)錄提升,對視網(wǎng)膜炎性反應(yīng)施以進(jìn)一步激發(fā)。Ye 等［34］研究發(fā)現(xiàn)miR-146a 在高糖培養(yǎng)的HREC 中表達(dá)下降,而過表達(dá)miR-146a 能夠使TLR4/NF-κB 以及TNF-α 下調(diào),表明在DR 炎癥機制中miR-146a 參與了NF-κB 活化的負(fù)性調(diào)節(jié)。Feng等［35］研究發(fā)現(xiàn)miR-146a 在T1DM 大鼠模型中REC的表達(dá)減弱,纖維黏連蛋白(FN)則表達(dá)上調(diào),促使視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、損傷,引起相關(guān)DR 的病理改變。

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生和神經(jīng)元凋亡是DR 主要的神經(jīng)損傷改變。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的功能障礙［36］、神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡先于視網(wǎng)膜周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡出現(xiàn)［37］。在DR 中,若p53 活化,會增強miR-34 家族(miRNA-34a/b/c)表達(dá),表明,miR-34 家族同由p53誘導(dǎo)所致的REC 凋亡存在一定聯(lián)系。He 等［38］敲除老鼠miRNA-34 基因發(fā)現(xiàn)p53 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡被阻滯,表明在p53 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中,miRNA-34 扮演著重要的角色。Kovacs 等［29］研究也發(fā)現(xiàn)miRNA-34c 在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織及視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中表達(dá)有顯著上調(diào),同時發(fā)現(xiàn)在DR 中有p53 的活化,因此認(rèn)為由miRNA-34 家族成員介導(dǎo)的p53 誘發(fā)的細(xì)胞凋亡和神經(jīng)退變參與了DR 的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述,miRNA 是糖尿病重要的調(diào)節(jié)者和參與者,目前已有循環(huán)miRNA 用于T2DM 早期診斷的生物標(biāo)志物。DR 中患者的外周血血清、視網(wǎng)膜細(xì)胞中也存在很多表達(dá)異常的miRNA,這些miRNA 在DR 的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用,有的促進(jìn)DR 的發(fā)生發(fā)展,有的抑制DR 發(fā)生發(fā)展。隨著miRNA 在DR 發(fā)生發(fā)展中的分子機制研究逐漸深入,越來越多的miRNA及其對DR 的調(diào)控機制將被證實。但目前對其在DR作用機制中的分子機制研究尚無明確定論。進(jìn)一步研究miRNA 在DR 的分子作用機制,miRNA 有可能成為早期預(yù)警、早期診斷及早期干預(yù)DR 的生物學(xué)指標(biāo),并成為DR 新的基因靶向治療提供理論依據(jù)。