曾寶輝，過新民，郭順華

（廣州市紅十字會醫(yī)院/暨南大學附屬廣州紅十字會醫(yī)院 超聲科，廣東 廣州 510220）

乳腺癌是世界范圍內發(fā)病率最高的女性惡性腫瘤。根據(jù)2018 年的全球癌癥數(shù)據(jù)[1]統(tǒng)計，乳腺癌新發(fā)病例占全部女性惡性腫瘤的25%。隨著乳腺癌的診治水平的不斷提高，乳腺癌患者的預后有了極大改善。但是，絕大部分乳腺癌患者仍不可能避免地出現(xiàn)轉移和復發(fā)，導致乳腺癌仍然是女性癌癥相關死亡的第二大癌種[2]。目前乳腺癌研究領域正致力于開發(fā)新的分子標記物和治療靶點，以進一步提高乳腺癌的診治效果[3]。開發(fā)新的分子標記物對于乳腺癌的早期診斷、藥物反應預測和復發(fā)風險的評估都有很大的幫助，同時為乳腺癌的精準治療提供新的工具[4-6]。

垂體瘤轉化基因1（pituitary tumor transforming gene 1，PTTG1）是一種癌基因，參與調控細胞周期和姐妹染色單體的分離。PTTG1 在多種腫瘤中高表達，且其產物具有體外轉化活性和體內致瘤的活性，提示PTTG1 可能在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[7]。既往研究[8]發(fā)現(xiàn)高表達的PTTG1 與更強的腫瘤侵襲性及腫瘤血管生成密切相關。PTTG1可以通過與多種蛋白相互作用參與調控細胞轉錄過程，與細胞周期、代謝控制和信號轉導通路等密切相關[9]。越來越多的證據(jù)[7-9]表明，PTTG1 可作為癌癥侵襲轉移的生物標志物。但乳腺癌中PTTG1的表達水平及其與患者預后的關系并不清楚，同時PTTG1 與乳腺癌免疫浸潤是否有關系也是未知。

本研究通過公共數(shù)據(jù)庫（包括Oncomine 在線網站、Coexpedia 數(shù)據(jù)庫和TIMER 數(shù)據(jù)庫）評估乳腺癌組織中PTTG1 mRNA 水平與乳腺癌患者預后之間的關系，進一步探討PTTG1 mRNA 水平與乳腺癌患者的臨床病理特征以及腫瘤免疫細胞浸潤的關系，揭示PTTG1 在乳腺癌中的表達情況及其作用，為乳腺癌診斷和治療提供潛在的新靶點。

1 材料與方法

1.1 PTTG在乳腺癌中的表達水平及其與生存預后的關系

筆者利用Oncomine 4.5 數(shù)據(jù)庫中Curtis Breast、Richardson Breast 和Zhao Breast 等[10-12]乳腺癌測序數(shù)據(jù)，分析乳腺癌組織與癌旁正常乳腺組織中PTTG1的mRNA 表達和DNA 拷貝數(shù)[13]。隨后，利用Kaplan-Meier Plotter（https://kmplot.com）在線分析平臺對Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫中1 402 例乳腺癌患者進行預后分析[14-15]，明確PTTG1 的表達水平與患者總生存率的關系。最后，使用UALCAN 在線數(shù)據(jù)分析工具（http://ualcan.path.uab.edu）分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中1 097 例乳腺癌患者的PTTG1 表達水平與患者臨床病理特征的關系。

1.2 Coexpedia分析

Coexpedia（http：//www.coexpedia.org/）數(shù)據(jù)庫是從GEO 中多個人類和小鼠數(shù)據(jù)集整合構建的基因共表達數(shù)據(jù)庫[16]。利用Coexpedia 分析在乳腺癌中與PTTG1 表達顯著相關的基因，并選取排名前50 的基因做后續(xù)分析。

1.3 富集分析

使用R 語言中的clusterProfiler 包將PTTG1 共表達的前50 基因進行GO 和KEGG 通路富集分析[17]。

1.4 腫瘤免疫細胞浸潤相關性分析

通過TIMER 數(shù)據(jù)庫（https://cistrome.shinyapps.io/timer）分析PTTG1 的表達水平及其與6 種免疫細胞（CD4+Th1 細胞、CD4+Th2 細胞、巨噬細胞、CD8+T 細胞、B 細胞和中性粒細胞）浸潤水平的相關性。

1.5 microRNA預測

使用R 語言包“multiMiR”預測PTTG1 以及其共表達基因相互作用的microRNA[18]，并使用Cytoscape 3.6.0 構建microRNA-mRNA 可視化網絡[19]。

2 結 果

2.1 PTTG1 在乳腺癌組織中高表達且與患者不良預后相關

對來自TCGA 數(shù)據(jù)庫的多個乳腺癌研究中PTTG1 的mRNA 和DNA 拷貝數(shù)水平進行分析。數(shù)據(jù)顯示，在乳腺癌組織中，PTTG1 的mRNA 表達和DNA 拷貝數(shù)變異（CNV）顯著高于正常乳腺組織（P<0.05）（圖1A-E）。對Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫中1 402 例乳腺癌患者進行預后分析，結果發(fā)現(xiàn)乳腺癌中PTTG1 mRNA 高表達患者的總生存率顯著低于低表達的患者（P<0.001）（圖1F）。隨后，TCGA數(shù)據(jù)庫中篩選出1 097 例乳腺癌患者，根據(jù)患者的臨床分期、種族、年齡、TP53 狀態(tài)和淋巴結轉移等情況進行分組分析。結果顯示，各個分組中乳腺癌的PTTG1 表達均高于正常乳腺組織（圖2）。這些結果提示PTTG1 的表達水平可以作為乳腺癌潛在的診斷和預后標記物。

圖1 乳腺癌中PTTG1 mRNA 的表達水平及其與患者生存率的關系 A-D：在Curtis Breast、Richardson Breast、TCGA Breast和Zhao Breast數(shù)據(jù)集中乳腺腫瘤組織和正常乳腺組織之間PTTG1 mRNA表達水平的差異；E：TCGA數(shù)據(jù)集中乳腺腫瘤組織和正常乳腺組織之間PTTG1 DNA拷貝數(shù)的差異；F：Kaplan-Meier生存曲線分析PTTG1表達高低對總生存率的影響（n=1 402）Figure 1 The expression level of PTTG1 mRNA in breast cancer tissues and its relationship with survival rate of patients A-D: The differences of PTTG1 mRNA expression levels between breast tumor tissues and normal breast tissues in the Curtis Breast,Richardson Breast,TCGA Breast and Zhao Breast datasets;E: The difference in PTTG1 DNA copy number between breast tumor tissues and normal breast tissues in the TCGA dataset;F: Analysis the influence of PTTG1 expression level on overall survival rate with Kaplan-Meier survival curve (n=1 402)

圖2 PTTG1的表達與乳腺癌臨床病理特征的關系 A：PTTG1在不同臨床分期乳腺癌組織中的相對表達水平；B：PTTG1在不同種族乳腺癌患者中的相對表達水平；C：PTTG1在不同年齡段乳腺癌患者中的相對表達水平；D：PTTG1在不同TP53狀態(tài)的乳腺癌患者中的相對表達水平；E：PTTG1在不同淋巴結轉移狀態(tài)乳腺癌患者中的相對表達水平；F：正常乳腺組織標本和乳腺癌組織標本中PTTG1 mRNA表達水平的箱線圖Figure 2 Correlation between PTTG1 expression and clinicopathologic features in breast cancer A: The relative expression level of PTTG1 in breast cancer tissues with different clinical stages;B: The relative expression level of PTTG1 in breast cancer patients with different races;C: The relative expression levels of PTTG1 in breast cancer patients with different ages;D: The relative expression level of PTTG1 in breast cancer patients with different TP53 status;E: The relative expression level of PTTG1 in breast cancer patients with different status of lymph node metastasis;F: Boxplots of PTTG1 mRNA expression levels in normal and breast cancer tissues

2.2 乳腺癌中PTTG1 的共表達基因及其相互作用網絡

為了分析乳腺癌中PTTG1 的共表達基因及其相互作用網絡，本研究利用Coexpedia 分析PTTG1的共表達基因（圖3）。結果顯示，共有182 個與PTTG1 共表達的基因，提示PTTG1 可能具有廣泛的調控作用。篩選出其中排名前50 的基因進行后續(xù)分析?；蚋患治鲲@示，這些基因編碼的蛋白質主要定位于紡錘體、染色體以及著絲粒。這些蛋白主要功能是與微管蛋白結合，調節(jié)蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性，并參與細胞核的分裂、細胞器分離和染色體分離（圖4A-C）。KEGG 通路分析的結果顯示，這些蛋白主要在細胞周期調控、減數(shù)分裂、HTLV-1 感染中發(fā)揮作用（圖4D-E）。

圖3 PTTG1的共表達基因網絡（PTTG1用紅色圓圈標識，共表達基因用綠色圓圈標注）Figure 3 Co-expression gene network of PTTG1 (PTTG1 marked by red circles,and the co-expressed genes marked by green circles)

圖4 乳腺癌中PTTG1共表達基因的GO和KEGG通路富集分析 A：PTTG1及其共表達基因的分子功能作用；B：PTTG1及其共表達基因在細胞成分中的作用；C：PTTG1及其共表達基因所參與的生物學過程；D：PTTG1及其共表達基因的KEGG相關通路；E：細胞周期通路網絡（共表達基因在此通路中所在的位置以紅色標注）Figure 4 Enrichment analysis of GO and KEGG pathways of PTTG1 co-expressed genes in breast cancer A: Molecular functional roles of PTTG1 and its co-expressed genes;B: The role of PTTG1 and its co-expressed genes in cell components;C: Biological processes involved in PTTG1 and its co-expressed genes;D: KEGG related pathways of PTTG1 and its co-expressed genes;E: Network of cell cycle pathway (the locations of co-expressed genes in this pathway indicated in red)

利用clusterProfiler 的R 語言包對共表達基因以及富集通路進行可視化，結果發(fā)現(xiàn)PTTG1 相關的基因主要通過調節(jié)細胞周期發(fā)揮作用。其中MAD2L1、CDC20、CCNB2、CCNA2、BUB1、ESPL1、CDK1 和CCNB1 在PTTG1 調節(jié)細胞周期中發(fā)揮著重要的作用（圖5A）。PTTG1 共表達基因參與多個通路的調節(jié)，可能通過這些通路參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展（圖5B）。

圖5 乳腺癌中PTTG1共表達基因和通路的可視化網絡 A：PTTG1共表達基因可視化網絡；B：共表達基因的KEGG通路富集可視化網絡Figure 5 Visual network of PTTG1 co-expressed genes and pathways in breast cancer A: Visual network of PTTG1 coexpressed genes;B: Visual network of KEGG pathway enrichment in co-expressed genes

2.3 PTTG1 的表達與浸潤性免疫細胞的浸潤水平相關性分析

TIMER 數(shù)據(jù)庫分析顯示PTTG1 的表達與6 種免疫細胞（CD4+Th1 細胞，CD4+Th2 細胞、巨噬細胞、CD8+T 細胞、B 細胞和中性粒細胞）之間密切相關（圖6）。PTTG1 表達水平與CD4+Th1 細胞（r=0.490，P=3.52e-61）、CD4+Th2 細胞（r=0.765，P=3.7e-192）、巨噬細胞（r=0.308，P=2.8e-23）、B 細胞（r=0.228，P=3.69e-13）和中性粒細胞（r=0.121，P=1.27e-04）的浸潤水平呈正相關，與CD8+T 細胞浸潤水平呈負相關（r=-0.198，P=3.16e-10）。

圖6 PTTG1表達水平與浸潤性免疫細胞浸潤水平的關系 A-F：PTTG1的表達與CD4+ Th1細胞、CD4+ Th2細胞、巨噬細胞、CD8+ T細胞、B細胞和中性粒細胞浸潤水平呈正相關，與CD8+ T細胞浸潤程度呈負相關Figure 6 Relationship between the expression level of PTTG1 and the infiltration level of infiltrating immune cells A-F:The expression of PTTG1 positively correlated with the infiltration levels of CD4+ Th1 cells,CD4+ Th2 cells,macrophages,CD8+ T cells,B cells and neutrophils,and negatively correlated with the infiltration degree of CD8+ T cells

2.4 乳腺癌中PTTG1 和共表達基因的相互作用網絡

為進一步探討PTTG1 在乳腺癌中的作用機制，本研究利用multiMiR R 語言數(shù)據(jù)包分析了與PTTG1以及其共表達基因相互作用的microRNA。其中，與PTTG1 相互作用的microRNA 有30 個，與PTTG1共表達的排名前50 基因相互作用的microRNA 有5 130 個，共同靶向PTTG1 及其共表達基因的microRNA 共有17 個。使用Cytoscape 軟件對microRNA-基因網絡進行可視化，結果提示PTTG1可能由microRNA 以ceRNA 的機制調控（圖7）。

圖7 PTTG1-microRNA-共表達基因可視化網絡Figure 7 Visualization network of PTTG1-microRNA-Coexpression genes

3 討 論

早期診斷和預后評價是癌癥管理中極其關鍵且富有挑戰(zhàn)性的環(huán)節(jié)。乳腺癌異質性極大，需要應用多種生物標記物的協(xié)同分析，以實現(xiàn)乳腺癌的早期診斷和預后精準預測[20]。因此，當前迫切需要發(fā)現(xiàn)更多的乳腺癌生物標記物，從而實現(xiàn)乳腺癌早診早治和預后評價[21-22]。

PTTG1 在多種惡性腫瘤中高表達，被認為是一種致癌基因，它的高表達對腫瘤的生長和發(fā)展具有促進作用并與多種癌癥的不良預后有關[23-27]。PTTG1 mRNA 在腸癌組織和細胞系中表達上調，是腸癌預后的一個獨立的危險因素[23]。在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中，Li 等[24]發(fā)現(xiàn)PTTG1 在NSCLC 的侵襲、轉移中具有重要作用，通過siRNA 敲低PTTG1 表達可抑制NSCLC 細胞的侵襲。應用siRNA 干擾PTTG1 的表達后，口腔鱗狀細胞癌細胞的侵襲能力顯著降低。而microRNA-186 和microRNA-655 可抑制PTTG1 在口腔鱗狀細胞癌細胞中的表達，進而調節(jié)細胞的侵襲活性[8]。Cui 等[25]發(fā)現(xiàn)敲低PTTG1 可顯著抑制膠質母細瘤的血管生成，抑制細胞的遷移和侵襲，并促進腫瘤細胞的凋亡。Fraune 等[26]通過對12 427 例前列腺癌樣本進行免疫組化檢測，結果發(fā)現(xiàn)PPTG 可單獨或與其他生物標志物聯(lián)合使用能較好地評估前列腺癌的侵襲性。Grzechowiak 等[27]證實了PTTG1 在頭頸部鱗狀細胞癌中的具有顯著的促癌作用。這些研究表明PPTG1 是潛在的腫瘤診斷標記物和治療靶點。本研究通過對開放數(shù)據(jù)庫進行分析發(fā)現(xiàn)PTTG1在乳腺癌組織中表達升高并與不良預后相關，提示PTTG1 可能在乳腺癌中發(fā)揮癌基因的作用，是乳腺癌潛在的診斷和預后標志物。

本研究使用clusterProfiler 的R 語言分析PTTG1及其共表達基因的富集情況，結果發(fā)現(xiàn)PTTG1 的功能主要富集在核分裂、細胞器分離和染色體分離上。KEGG 通路富集則提示，PTTG1 與乳腺癌的細胞周期、減數(shù)分裂、HTLV-1、p53 信號轉導是密切相關的。細胞周期失調是癌細胞惡性增殖的基礎，細胞周期紊亂可導致癌細胞快速增殖[28]。p53是一個重要的抑癌基因，p53 突變和喪失抑癌作用是腫瘤惡變的一個重要原因[29]。而本研究發(fā)現(xiàn)PTTG1 的表達與p53 信號轉導密切相關。因此，筆者推測乳腺癌中PTTG1 高表達可能通過調控細胞周期和p53 信號通路而使得腫瘤增殖和侵襲能力增強，從而導致患者的不良預后。期待進一步的研究來驗證該假說。

大量研究[30-31]證實，腫瘤浸潤淋巴細胞與腫瘤預后和對治療的反應密切相關。PTTG1 表達與乳腺癌中多種抑制性免疫細胞浸潤水平呈正相關，同時與具有抗癌作用的CD8+T 細胞浸潤水平呈負相關，這可能是PTTG1 高表達造成患者預后不良的另一重要原因。本研究結果表明，PTTG1 參與調控乳腺癌的免疫微環(huán)境，推測PTTG1 的表達可能與免疫治療的療效相關，這值得后續(xù)進一步研究。

綜上所述，本研究證實乳腺癌組織中PTTG1表達上調且其高表達與乳腺癌患者的不良預后相關。PTTG1 與乳腺癌的免疫浸潤密切相關，是乳腺癌潛在的診斷標記物和治療靶點。但是，PTTG1 在乳腺癌中發(fā)揮作用的具體機制還需要進一步的研究加以闡明。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。