王 倩 折瑞蓮 沙文瓊 林湖濱

深圳市人民醫(yī)院產(chǎn)科，廣東深圳 518020

代謝性疾病是肥胖人群健康的主要威脅，通過多種方法尋找克服肥胖問題仍然不能有效合理調(diào)控肥胖人群肝臟細(xì)胞代謝平衡[1-2]。脂肪與肥胖相關(guān)基因（fat mass and obesity-associated，F(xiàn)TO）于1999年被發(fā)現(xiàn)，2007年經(jīng)鑒定其編碼為去甲基化酶[3-4]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)FTO 與多種疾病有關(guān)，如代謝紊亂、腫瘤、肥胖、心腦血管疾病等[5-7]。FTO 編碼去甲基化酶，其底物是RNA，催化RNA 上的6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）發(fā)生去甲基化，調(diào)控基因表達(dá)，參與細(xì)胞的多種生命活動[8]。FTO 在不同組織中的功能不同，如在黑色素瘤、宮頸癌、乳腺癌、急性髓性白血病中具有癌基因的功能；在肝內(nèi)膽管癌、卵巢癌、腎癌則發(fā)現(xiàn)其具有抑癌基因的作用[9-10]。對于正常肝細(xì)胞的代謝調(diào)控作用尚不清楚，本研究采用正常肝細(xì)胞HL-7702，研究FTO 如何通過m6A 調(diào)控肝細(xì)胞增殖、脂肪代謝相關(guān)基因水平變化，為脂肪肝等肝臟疾病提供治療與指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

RPMI-1640 培養(yǎng)基（KGM31800）、CCK-8 試劑（KGA317）、TMG、cycloleucine 均購自南京凱基；m6A甲基化檢測試劑盒（ab233488）、甘油（ab133130）均購自Abcam；甘油檢測試劑盒購自Elabscience（E-BCK261-M）；胎牛血清購自杭州四季青（11011-8611）；FTO-OE 過表達(dá)載體購自廣州基旦生物；FTO-sh干擾載體購自廣州艾基生物；RT-qPCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Bio-Rad（1725121）；qPCR 引物購自上海生工。抗體購自CST 公司；人肝正常細(xì)胞HL-7702 購自武漢普諾賽公司（CL-0111）；293T 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫（GNHuh7）；SDSPAGE 凝膠試劑盒（P0012A）、蛋白裂解液RIPA（P0013C）均購自碧云天；lipofectamine 2000（11668030）、TRIzol（1590618）均購自Invitrogen。

1.2 儀器與設(shè)備

qPCR 儀器（Bio-Rad，M400）、酶標(biāo)儀（博璐騰，型號DC220）、超凈臺（蘇州超凈，型號WT-2ND）、二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo，型號BB150）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 使用RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)人肝正常細(xì)胞HL-7702、293T 細(xì)胞，并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。

1.3.2 FTO-OE 及FTO-sh 載體構(gòu)建 構(gòu)建FTO 過表達(dá)及干擾載體，使用293T 細(xì)胞。DNA（帶有綠色熒光蛋白標(biāo)簽）與轉(zhuǎn)染試劑的比例為1∶2～1∶3。250 μl Opti-MEM 稀釋2 μg 目的基因載體，室溫靜置5 min。將脂質(zhì)體混合液慢慢滴加到質(zhì)?；旌弦汗苤屑尤爰?xì)胞。4～6 h 后，棄掉培養(yǎng)基，補(bǔ)入含10%胎牛血清的正常培養(yǎng)基。

1.3.3 外源性甲基化激活劑三甲基甘氨酸與外源性甲基化抑制劑環(huán)亮氨酸分別對細(xì)胞增殖的影響 不同濃度的TMG 對肝細(xì)胞增殖的影響：HL-7702細(xì)胞貼滿96 孔板后進(jìn)行處理，試驗(yàn)分為7 組，三甲基甘氨酸終濃度分別為0、1、2、4、8、16、32 mmol，處理48 min 后CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖情況，并使用Graphpad Prism 6.0 計(jì)算IC50。不同濃度的cycloleucine 對肝細(xì)胞增殖的影響：HL-7702 細(xì)胞貼滿96 孔板后進(jìn)行處理，隨機(jī)分為4 組，cycloleucine終濃度分別為0、10、20、40 mmol，處理24 min 后采用CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖情況。

1.3.4 qPCR 分析 收集藥物作用后48 h 的細(xì)胞，加入200 μl Trizol。加入0.2 ml氯仿，輕微振蕩15 s，靜置2 min。4℃離心，12 000 g，離心15 min，取上清。加入0.5 ml 異丙醇，室溫靜置10 min。4℃離心，12 000 g，離心10 min，棄上清。加入1ml 75%乙醇，洗滌沉淀。4℃離心，7500 g，離心5 min，棄上清，加入DEPC水溶解。反轉(zhuǎn)錄條件：37℃，15 min；85℃，5 s。qPCR 體系：模板，1 μl；F 引物，0.4 μl，R 引物（10 μmol），0.4 μl；2x PerfecStar qPCR SuperMix，10 μl；Nuclease free-Water，8.2 μl。使用兩步法分析基因表達(dá)，程序如下，95℃ 5 s，60℃ 5 s，然后42 個(gè)循環(huán)擴(kuò)增分析基因表達(dá)（95℃，15 s；60℃，1 min）。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對表達(dá)，以GAPDH 表達(dá)為對照。

1.3.5 Western blot 實(shí)驗(yàn) 收集藥物作用后的細(xì)胞，蛋白裂解變性，BCA 法測定蛋白濃度。SDSPAGE 膠電泳分離樣品，并通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 上。5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，TBST 洗膜3 次，將稀釋好的一抗浸沒PVDF 膜，4℃孵育過夜。第2 天，TBST 洗膜3 次，然后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影。

1.3.6 m6A 甲基化定量檢測 細(xì)胞加藥處理后48 h收集細(xì)胞。RNA 結(jié)合：加80 μl 結(jié)合液到酶標(biāo)板。m6A RNA 捕獲：加50 μl 稀釋的捕獲抗體液。50 μl 稀釋的抗體檢測液，孵育30 min。50 μl 稀釋的增強(qiáng)液，孵育30 min。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作，使用1x TE 緩沖液稀釋陽性對照物，濃度為0.5 ng/μl。洗脫緩沖液以1∶2000 比例稀釋抗體檢測液。根據(jù)使用0.5 ng/μl 陽性對照液和1×TE 緩沖液制備6 種不同濃度，分別為0、0.2、0.4、0.8、1.6 和3.2 ng/μl，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.7 甘油水平檢測 甘油水平檢測按照試劑盒說明書進(jìn)行。細(xì)胞加藥處理，48 h 后收集細(xì)胞。按比例每（1～2）×106細(xì)胞加100 μl 裂解液，混勻裂解。65℃左右加熱10 min 滅活脂肪酶，可見絮狀沉淀出現(xiàn)。5000 r/min 離心5 min。工作溶液的配制，按R1∶R2=4∶1 比例，即取4 ml 試劑R1 試劑與1 ml 試劑R2 試劑混合。標(biāo)準(zhǔn)品稀釋，用蒸餾水、生理鹽水或與樣品緩沖液一致的液體，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，行χ2檢驗(yàn)，P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用Graphpad Prism 6.0 軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 Western blot及qPCR分析FTO表達(dá)水平

在人正常肝細(xì)胞HL-7702 過表達(dá)FTO，Western blot 及qPCR 分析其表達(dá)，發(fā)現(xiàn)FTO 的mRNA 與蛋白表達(dá)水平皆有提高（圖1A～B）。接下來，使用同樣的方法干擾FTO 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)FTO 的mRNA 與蛋白表達(dá)水平皆有降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）（圖1C～D）。這些結(jié)果表明，構(gòu)建的FTO 過表達(dá)載體（FTO-OE）及干擾載體（FTO-sh）均有效果。

2.2 三甲基甘氨酸與cycloleucine對肝細(xì)胞活性影響

參考相關(guān)研究報(bào)道[11-12]，TMG 具有抑制細(xì)胞活性的效果，細(xì)胞經(jīng)過TMG 作用后，經(jīng)計(jì)算其IC50 為8.32 mmol，為了便于藥物濃度計(jì)算，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)里TMG 濃度均為8.5 mmol（圖2A）。cycloleucine具有促進(jìn)細(xì)胞衰老的效果，在一定的濃度范圍內(nèi)具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的效果，結(jié)合圖2B，本研究選定其濃度為10 mmol 開展后續(xù)研究。

2.3 FTO對肝細(xì)胞增殖活性效果

與NC-OE 對照組相比，當(dāng)FTO 過表達(dá)后，F(xiàn)TO-OE 組增殖活性變化顯著增高（圖3A）；細(xì)胞增殖活性受到TMG 抑制（圖3A）；當(dāng)細(xì)胞過表達(dá)FTO 時(shí)，其增殖活性受到TMG 抑制（圖3A）。與NC-sh 對照組相比，加入cycloleucine 后，其本身增殖活性變化差異不明顯（圖3B）；與NC-sh 對比，F(xiàn)TO-sh 增殖活性顯著降低（圖3B）；但加入cycloleucine 后，F(xiàn)TO-sh 增殖活性降低得到緩解（圖3B），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。

2.4 FTO對肝細(xì)胞產(chǎn)生甘油效果影響

與NC-OE 對照組相比，當(dāng)FTO 過表達(dá)，細(xì)胞甘油產(chǎn)生水平顯著提高（圖4A）；甲基激活劑TMG 藥物降低了細(xì)胞甘油水平（圖4A）；FTO 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了TMG 的效果，導(dǎo)致細(xì)胞甘油水平提高（圖4A），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。與NC-sh 對照組相比，干擾FTO 的表達(dá)，細(xì)胞甘油產(chǎn)生水平降低（圖4B）；抑制劑cycloleucine 藥物顯著提高細(xì)胞甘油水平（圖4B），且FTO-sh 逆轉(zhuǎn)了cycloleucine 對甘油水平的提高，導(dǎo)致細(xì)胞甘油水平降低（圖4B），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。

2.5 FTO對肝細(xì)胞代謝基因表達(dá)水平分析

FTO 調(diào)控脂肪分解相關(guān)基因（ATGL）、成脂分化基因（c/EBPβ）、脂肪酸從頭合成相關(guān)基因（FAS）等脂肪代謝基因水平[13-15]。當(dāng)FTO 過表達(dá)，ATGL 表達(dá)水平顯著降低，c/EBPβ、FAS 水平顯著提高（圖5A）；當(dāng)被TMG 藥物作用后，ATGL 表達(dá)水平有所提高，仍然低于NC-OE 對照組（圖5A）；c/EBPβ 與FAS 表達(dá)水平顯著提高（圖5A），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。FTO-OE 逆轉(zhuǎn)了TMG 藥物的效果，導(dǎo)致ATGL 表達(dá)水平降低，c/EBPβ 與FAS 水平顯著提高（圖5A）。

當(dāng)干擾FTO 表達(dá)時(shí)，ATGL 水平升高（圖5B），c/EBPβ 與FAS 水平降低（圖5B）。當(dāng)細(xì)胞被cycloleucine 藥物作用后，ATGL 水平進(jìn)一步升高（圖5B），c/EBPβ 與FAS 水平顯著性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）（圖5B）。接下來進(jìn)一步研究，當(dāng)干擾FTO 表達(dá)，細(xì)胞受到cycloleucine 作用后，本應(yīng)該出現(xiàn)ATGL 水平升高、c/EBPβ 水平降低。但是，ATGL 水平卻降低，c/EBPβ 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）（圖5B）。只有FAS 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合預(yù)期（圖5B）。

2.6 甲基化m6A水平變化

FTO 編碼去甲基化酶，影響細(xì)胞m6A 的甲基化水平。為了進(jìn)一步研究FTO 如何調(diào)控以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步研究細(xì)胞RNA 甲基化水平變化。當(dāng)細(xì)胞FTO 過表達(dá)，m6A 甲基化水平降低；當(dāng)干擾FTO 的表達(dá)，m6A 甲基化水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。見圖6。

3 討論

FTO 是脂肪與肥胖相關(guān)基因，編碼m6A 去甲基化酶，調(diào)控RNA 甲基化水平，參與細(xì)胞增殖、存活，與代謝病存在深度關(guān)系，如糖尿病、肥胖、腎病等[13]。RNA 的m6A 修飾功能很重要，目前關(guān)于m6A 在腫瘤發(fā)生、肥胖、脂肪代謝等疾病中愈發(fā)明確[14]。FTO 通過多種途徑調(diào)節(jié)脂肪代謝，如通過過氧化物酶體、與脂肪相關(guān)的促生成因子等，從而調(diào)控肥胖的發(fā)生發(fā)展。新的研究表明，m6A 與2 型糖尿病關(guān)系十分密切，F(xiàn)TO 作為m6A 去甲基化酶廣泛參與2 型糖尿病的發(fā)生發(fā)展。有研究表明，在2 型糖尿病模型研究中，發(fā)現(xiàn)高糖高脂飲食促進(jìn)FTO 表達(dá)而導(dǎo)致m6A 甲基化水平顯著降低[15]。

另外，還有研究表明，在大鼠高糖高脂飲食實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO 過表達(dá)而導(dǎo)致甘油及三酰甘油表達(dá)水平提高，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與代謝緊密相關(guān)的基因，如ATGL、c/EBPβ 與FAS 表達(dá)水平皆有顯著性的變化[16]。本研究利用CCK-8、Western blot、qPCR 等方法，分析FTO 與正常肝細(xì)胞HL-7702 增殖、甘油、代謝基因等變化研究，發(fā)現(xiàn)FTO 過表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞增殖、甘油水平提高，ATGL 水平降低、c/EBPβ 與FAS 水平升高，m6A 甲基化水平降低。當(dāng)干擾FTO 表達(dá)時(shí)，肝細(xì)胞增殖水平減慢，甘油水平降低，F(xiàn)AS 水平升高。

FTO 通過多種信號通路調(diào)節(jié)脂肪代謝，如FTO基因通過改變m6A 水平可調(diào)節(jié)RUNX1T1 基因的表達(dá)，其存在2 種不同的異構(gòu)體。有研究表明RUNX1T1 基因能夠調(diào)節(jié)c/EBPβ 的活性[17]。有研究發(fā)現(xiàn)缺失FTO 基因并不會影響c/EBPβ 的表達(dá)水平，推測FTO 基因有可能通過一條獨(dú)立于c/EBPβ 之外的路徑來發(fā)揮作用[18]。本研究中，F(xiàn)TO 調(diào)控c/EBPβ的表達(dá)，F(xiàn)TO 過表達(dá)促進(jìn)c/EBPβ 的表達(dá)，提示FTO可能通過調(diào)節(jié)RUNX1T1 基因的表達(dá)調(diào)控脂肪代謝。

除此之外，本研究還發(fā)現(xiàn)一個(gè)異常的現(xiàn)象，當(dāng)干擾FTO 表達(dá)時(shí)，細(xì)胞受到cycloleucine 作用后，ATGL 水平降低、c/EBPβ 沒有顯著性差異。值得進(jìn)一步關(guān)注與研究。