趙劍鋒, 陳 凱

(1. 江蘇省泰興市中醫(yī)院 院辦, 江蘇 泰興, 225400;2. 南京醫(yī)科大學(xué)泰州臨床醫(yī)學(xué)院/南京醫(yī)科大學(xué)附屬泰州人民醫(yī)院 藥學(xué)部, 江蘇 泰州, 225300)

梔子大黃湯為漢代張仲景所著《金匱要略》中經(jīng)典名方，由梔子、大黃、枳實和淡豆豉4味藥材組成。方中梔子、大黃清泄?jié)駸?，枳實破氣行滯，淡豆豉輕清宣散，諸藥相合，共奏清肝利膽、理氣退黃之效[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[2]表明，梔子大黃湯具有顯著的利膽、抗炎活性。目前，梔子大黃湯已被廣泛應(yīng)用于熱重濕輕之肝膽疾患或心經(jīng)郁熱者的臨床治療，如新生兒病理性黃疸、黃疸型肝炎等[3-4]。然而梔子大黃湯的作用機(jī)制尚未闡明，加之中藥成分復(fù)雜，作用靶點和途徑較多，故其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的概念于2007年由英國學(xué)者Hopkins提出，其基于系統(tǒng)生物學(xué)、藥理學(xué)、計算分析等多學(xué)科理論，多層次探討藥物干預(yù)疾病的分子機(jī)制。大量研究[5-7]發(fā)現(xiàn)，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究中藥的作用機(jī)制符合中醫(yī)藥的整體作用特點，且效果準(zhǔn)確可靠。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選梔子大黃湯的活性成分和靶點，構(gòu)建“藥材-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)模式，旨在為進(jìn)一步闡述梔子大黃湯抗肝損傷的作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 梔子大黃湯潛在活性成分篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP Ver 2.3, http://tcmspw.com/tcmsp.php)、中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫(ETCM, http://www.tcmip.cn/ETCM/)檢索梔子、大黃、枳實和淡豆豉化合物，建立梔子大黃湯化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。篩選口服生物利用度(OB)≥30%且類藥性(DL)≥0.18的化合物作為潛在活性成分，并納入相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]報道的重要活性成分。

1.2 潛在活性成分相關(guān)基因靶標(biāo)獲取與“藥材-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

借助STITCH DB Ver 5.0(http://stitch.embl.de)進(jìn)行研究，物種設(shè)置為“智人”，閾值設(shè)置為默認(rèn)，將有證據(jù)驗證的靶點基因納入成分相關(guān)靶點，否則剔除。通過Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建“藥材-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，并分析節(jié)點和邊。

1.3 疾病相關(guān)靶點獲取

肝損傷相關(guān)靶點來源于GeneCards Ver 5.12.0(https://www.genecards.org)和Pharm GKB (https://www.pharmgkb.org), 檢索關(guān)鍵詞"liver injury", 其中GeneCards數(shù)據(jù)庫選取相關(guān)性大于1的靶點。將獲得的靶點通過Uniport數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)進(jìn)行名稱標(biāo)準(zhǔn)化。

1.4 藥物-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)建設(shè)

為了明確梔子大黃湯治療肝損傷潛在靶點之間的相互作用，將藥物成分靶點與疾病靶點進(jìn)行交集。應(yīng)用STRING平臺(https://string-db.org, Ver 11.0)進(jìn)行分析，蛋白來源種類設(shè)置為“智人”，相互作用閾值設(shè)置為默認(rèn)，獲取蛋白-蛋白相互作用(PPI), 然后通過Cytoscape軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。通過Cytoscape軟件的CytoNCA插件獲得PPI網(wǎng)絡(luò)中的自由度中心性(DC)、介度中心性(BC)、接近性中心性(CC)、特征向量中心性(EC)、網(wǎng)絡(luò)中心性(NC)、局部邊連通性(LAC)。篩選標(biāo)準(zhǔn): 指標(biāo)數(shù)值大于中位數(shù)，即為關(guān)鍵基因。

1.5 基因通路與功能分析

借助R語言軟件(Ver 4.03)的clusterprofiler包將藥物與疾病交集的靶標(biāo)基因名轉(zhuǎn)化成基因ID, 并對梔子大黃湯潛在抗肝損傷靶點進(jìn)行基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)信號通路富集分析。以q≤0.05為閾值，再應(yīng)用R語言軟件中的ggplot包繪制條形圖。

1.6 化合物與靶點相互作用的分子對接

為了闡明潛在化合物與其潛在靶標(biāo)的相互作用，選擇關(guān)鍵靶點基因與活性化合物進(jìn)行分子對接。通過PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)獲得所選活性化合物的SDF結(jié)構(gòu)，然后通過ChemBio3D 17.0獲得化合物最低能量的MOL2結(jié)構(gòu)。關(guān)鍵靶點基因?qū)?yīng)蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)來源于PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org), 優(yōu)先選擇“智人”種屬、分辨率大于2.5 ?、含有活性配體、X射線晶體結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)，利用PyMol軟件進(jìn)行去水、加氫、調(diào)整電荷等預(yù)處理。使用Autodock 4.2和AutodockTool計算所選化合物和目標(biāo)靶點蛋白之間的結(jié)合親和力。目標(biāo)靶點蛋白包括細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)(PDB ID: 1P53)、腫瘤壞死因子(TNF)(PDB ID: 1TNR)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)(PDB ID: 6ESM)的X射線晶體結(jié)構(gòu)) 和白細(xì)胞介素-10(IL-10)(PDB ID: 2H24)。

2 結(jié) 果

2.1 活性化合物的篩選與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過TCMSP和ETCM數(shù)據(jù)庫檢索梔子、大黃、枳實、淡豆豉化合物，以O(shè)B≥30%且DL≥0.18為條件篩選出活性成分81個(其中18個來自梔子, 21個來自大黃, 33個來自枳實, 9個來自淡豆豉)，剔除重復(fù)成分10個，最終獲得71個成分。利用STITCH數(shù)據(jù)庫共檢索到138個相關(guān)靶點基因，無靶點基因的化合物未被納入本研究，最終共獲得31種活性成分，見表1。利用通過Cytoscape軟件構(gòu)建的“藥材-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，共?69個節(jié)點和460條對應(yīng)相互關(guān)系的邊，見圖1。

2.2 肝損傷相關(guān)靶點篩選

檢索GeneCards、PharmGKB數(shù)據(jù)庫，分別獲取肝損傷相關(guān)靶點401、20個，剔除重復(fù)項，校正后最終獲得341個靶點。

2.3 梔子大黃湯抗肝損傷PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點篩選

將341個疾病相關(guān)靶點與138個化合物靶點取交集，得到共同靶點47個，見圖2。應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建梔子大黃湯藥材抗肝損傷的PPI網(wǎng)絡(luò)，靶點-靶點相互作用關(guān)系的邊共410條。

表1 梔子大黃湯中活性成分的基本信息

采用CytoNCA插件根據(jù)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的拓?fù)鋵傩赃M(jìn)行2次篩選，共獲取關(guān)鍵靶點基因7個，包括TNF、血紅素加氧酶1(HMOX1)、白細(xì)胞介素-6(IL6)、絲裂原激活蛋白激酶8(MAPK8)、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2(PTGS2)、熱休克蛋白90 Alpha家族A級成員1(HSP90AA1)、半胱天冬酶3(CASP3), 見圖3。

2.4 GO功能富集分析

GO功能富集分析結(jié)果見圖4, 橫軸表示基因富集數(shù)目，縱軸為富集條目,q值用不同顏色表示，顏色越深表示差異性越顯著。① 生物過程(BP)注釋主要包括: 對外源物質(zhì)的反應(yīng); 類固醇代謝過程; 對脂多糖的反應(yīng); 對氧化應(yīng)激的反應(yīng); 對細(xì)菌源分子的反應(yīng); 細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng); 外源生物代謝過程; 細(xì)胞對外源性刺激的反應(yīng); 脂肪酸代謝過程; 小分子代謝過程的調(diào)控。② 細(xì)胞組成(CC)注釋主要包括: 膜筏; 質(zhì)膜微區(qū); 內(nèi)吞囊泡腔; 囊泡腔; 乳糜微粒; 轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合體; 小窩蛋白; 極低密度脂蛋白顆粒; 富含甘油三酯的血漿脂蛋白顆粒; 內(nèi)吞膜泡。③ 分子功能(MF)注釋主要包括: 氧化還原酶活性，作用于成對供體，以分子氧、還原黃素或黃素蛋白為1個供體，摻入1個原子氧; 血紅素結(jié)合; 單加氧酶活力; 四吡咯結(jié)合; 氧化還原酶活性，作用于配對的供體，結(jié)合或減少分子氧; 甾體羥化酶活性; 氧化還原酶活性，作用于配對的供體，與分子氧結(jié)合或還原, NAD(P)H作為1個供體，并結(jié)合1個氧原子; 鐵離子結(jié)合; 芳香化酶活性; 核受體活性。

2.5 KEGG信號通路富集分析

根據(jù) KEGG富集條目繪制前15條信號通路的條形圖，其中橫軸表示富集數(shù)目，縱軸表示通路名稱，不同顏色表示不同大小的q值，見圖5。結(jié)果顯示，梔子大黃湯抗肝損傷通路主要與脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、百日咳、非酒精性脂肪肝、化學(xué)致癌-受體激活、IL-17信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、流體剪切力與動脈粥樣硬化、耶爾森菌感染、恰加斯病、胰島素抵抗、TNF信號通路、細(xì)胞色素P450對外源物質(zhì)的代謝、化學(xué)致癌-活性氧、甾體激素生物合成、酒精性肝病相關(guān)。

2.6 分子對接結(jié)果

對PPI網(wǎng)絡(luò)中的基因進(jìn)行2次篩選后共獲得7個關(guān)鍵靶點基因，從PDB數(shù)據(jù)庫下載其對應(yīng)蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)，即TNF(PDB: 7JRA)、HMOX1(PDB: 3HOK)、IL6(PDB: 1ALU)、MAPK8(PDB: 4L7F)、PTGS2(PDB: 5F1A)、HSP90AA1(PDB: 2YI7)、CASP3(PDB: 1RHJ), 在此基礎(chǔ)上進(jìn)行關(guān)鍵靶點與活性成分的分子對接。通過結(jié)合能評估對接結(jié)果，結(jié)合能越小表示分子對接效果越好，結(jié)合能數(shù)值小于-7 kcal/mol表示結(jié)合活性較好，結(jié)合能數(shù)值小于-9 kcal/mol表示結(jié)合活性非常好。分子對接結(jié)果顯示，大黃素-TNF、蘆薈大黃素-HSP90AA1、黃柏酮-CASP3這3組典型分子對接的結(jié)合活性均很高，見圖6。借助PyMol軟件將這3組分子對接結(jié)果進(jìn)行可視化，結(jié)果見圖7。

3 討 論

梔子大黃湯組方出自《金匱要略》，臨床應(yīng)用歷史悠久，目前涉及該組方中單味藥材的研究已有報道[10], 但關(guān)于全方藥材及其應(yīng)用于肝損傷治療的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制的研究尚很少見。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選梔子大黃湯的活性成分，基于成分-靶點相互作用分析篩選關(guān)鍵作用靶點，并通過富集分析篩選關(guān)鍵作用通路，最后采用分子對接技術(shù)對關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點的結(jié)合活性進(jìn)行驗證。結(jié)果顯示，梔子大黃湯的化學(xué)成分復(fù)雜，基于數(shù)據(jù)庫檢索與OB、DL篩選共檢出71種植物化學(xué)成分，其中大部分成分來源于枳實，來源于淡豆豉的成分最少。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，篩選出的潛在活性成分主要為環(huán)烯醚萜苷類、蒽醌類、黃酮類、異黃酮類，與既往研究[11-13]結(jié)論一致。

肝損傷是指在一系列理化因素作用下，肝細(xì)胞發(fā)生不同程度的腫脹、變性、壞死和凋亡，是各種肝病發(fā)生與發(fā)展的共有病理特征。肝損傷若不能及時被糾正，將使肝病慢性化，進(jìn)而導(dǎo)致更嚴(yán)重的肝臟疾病。因此，通過清除自由基、抑制肝細(xì)胞凋亡、抑制炎性反應(yīng)減輕肝組織炎癥、修復(fù)受損肝細(xì)胞，從而緩解肝損傷具有重要意義[14]。肝損傷可歸屬于中醫(yī)學(xué)“脅痛”“黃疸”“酒疸”“藥毒”“積聚”“臌脹”等范疇[15], 《黃帝內(nèi)經(jīng)》亦明確指出，脅痛的發(fā)生主要與肝膽病變相關(guān)。目前，肝損傷治療藥物大多存在作用途徑單一、療效不足、副作用大等問題，而中醫(yī)藥辨證治療肝損傷歷史悠久，開發(fā)潛力巨大，其中桅子大黃湯為代表方之一。近年來，諸多學(xué)者將現(xiàn)代科技應(yīng)用于桅子大黃湯治療肝損傷的實驗研究，并取得了一定進(jìn)展。劉天鳳等[16]采用α-萘異硫氰酸酯 (ANIT)制備大鼠急性肝內(nèi)膽汁淤積模型，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯部位為梔子大黃湯抗肝內(nèi)膽汁淤積的有效部位，能顯著改善模型大鼠血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽紅素(TBIL)水平，并顯著改善血清堿性磷酸酶(ALP)、總膽汁酸(TBA)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)和肝組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平。李倫等[17]研究了梔子大黃湯對四氯化碳所致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)梔子大黃湯可顯著降低血清ALT、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、MDA水平，提升肝組織SOD活性，減輕肝細(xì)胞變形、壞死程度，其藥效機(jī)制與下調(diào)肝組織Bax、Cleaved-Caspase-3表達(dá)和上調(diào)Bcl-2表達(dá)有關(guān)。張曉書等[18]建立體內(nèi)外酒精性肝損傷模型發(fā)現(xiàn)，梔子大黃湯可有效降低模型組大鼠升高的血清ALT、AST和甘油三酯(TG)水平，并降低受損肝組織中MDA含量，提升肝組織SOD活性和谷胱甘肽(GSH)含量，對酒精性肝損傷具有明顯的防治作用。

中藥復(fù)方具有整體性和多樣性的特點，可發(fā)揮多層次、多環(huán)節(jié)、多靶點綜合作用，所以梔子大黃湯對肝損傷的防治作用可能來源于多重藥理作用與分子機(jī)制。本研究通過檢索并篩選獲得341個疾病相關(guān)靶點與138個藥物潛在靶點，將其交集后得到47個交集靶點，進(jìn)一步對靶點-靶點進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，篩選出TNF、HMOX1、IL6、MAPK8、PTGS2、HSP90AA1、CASP3為梔子大黃湯治療肝損傷的關(guān)鍵靶點基因。多種因素會對肝臟造成損傷，導(dǎo)致肝臟出現(xiàn)炎癥，因此抑制炎癥是緩解肝損傷的重要途徑之一。TNF、IL6、PTGS2是參與炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵效應(yīng)因子，梔子大黃湯可通過降低TNF、IL6、PTGS2等炎癥因子水平發(fā)揮防治肝損傷的效果。Caspase-3作為Caspase家族成員中執(zhí)行細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶之一，是細(xì)胞凋亡的中樞效應(yīng)器，可被多種刺激因素激活，經(jīng)剪切活化成Cleaved-Caspase-3, 然后裂解多種蛋白，阻止DNA復(fù)制和細(xì)胞修復(fù)，破壞細(xì)胞核整體結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。梔子大黃湯可以抑制Caspase-3活化，減少肝細(xì)胞的凋亡，從而緩解肝臟損傷。GO功能分析和KEGG通路分析結(jié)果表明，梔子大黃湯可降低肝臟脂質(zhì)過氧化水平，提高抗氧化酶水平，從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，還可通過抑制TNF信號通路發(fā)揮抗炎作用，與相關(guān)研究[13-15]結(jié)論一致。此外，分子對接結(jié)果表明梔子大黃湯中關(guān)鍵活性成分大黃素、蘆薈大黃素、黃柏酮等與關(guān)鍵蛋白TNF、CASP3等的結(jié)合活力非常高，進(jìn)一步確證梔子大黃湯能夠通過抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、肝細(xì)胞凋亡等途徑發(fā)揮治療肝損傷的效果。