王 帥，宋 奇，范 影，馮 超

（安徽新天生物科技有限公司，安徽 阜陽(yáng) 236600）

桑葚（Fructus mori），又名桑椹子，為桑科植物桑樹(shù)的成熟果穗，大多為紅紫色或黑色橢圓型聚花果，甜酸清香，營(yíng)養(yǎng)成分豐富[1]。桑葚富含粗纖維、游離酸、氨基酸以及人體所必需的礦物質(zhì)和微量元素，此外，還含有維生素、酚類(lèi)化合物、花青素、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等多種生物活性物質(zhì)，桑葚也是醫(yī)療保健價(jià)值較高的一種“藥食同源”農(nóng)產(chǎn)品[2-4]。中醫(yī)認(rèn)為，桑葚味甘酸、性寒，入肺、肝、腎、大腸經(jīng)，具有補(bǔ)肝益腎、滋陰補(bǔ)血、降壓消渴、美容養(yǎng)顏等功效[5]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究也表明：桑葚中的脂肪酸具有分解脂肪、降低血脂，防止血管硬化等作用，桑葚中含有的抗氧化和生物活性成分，具有延緩衰老、增強(qiáng)免疫力、防癌抗癌、明目等功效[6]。

食用酵素是以新鮮的蔬菜、水果、藥食同源中藥等為原料，破碎、榨汁、萃取等一系列工藝處理后，經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵所產(chǎn)生的含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分以及生物活性物質(zhì)的發(fā)酵液[7]。它不僅保留了原料中原有的多種維生素、氨基酸、酚類(lèi)、多糖等功效成分，還通過(guò)微生物發(fā)酵過(guò)程中的代謝作用將不易被人體所吸收的大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化成更易于被人體所吸收和利用的小分子物質(zhì)，此外，還產(chǎn)生新的生物活性成分，大大提高了酵素的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[8-9]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者對(duì)沙棘酵素[10]、蘋(píng)果酵素[11]、枇杷酵素[12]、銀耳藍(lán)莓酵素[13]等發(fā)酵過(guò)程中理化性質(zhì)及抗氧化活性進(jìn)行了深入的研究，對(duì)相關(guān)酵素生產(chǎn)過(guò)程的控制起到重要的指導(dǎo)意義。

本實(shí)驗(yàn)以桑葚酵素為研究對(duì)象，通過(guò)桑葚酵素發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)及生物活性物質(zhì)的測(cè)定，研究了pH、總酸、總酚等含量的變化趨勢(shì)，并測(cè)定了發(fā)酵過(guò)程中2,2'-聯(lián)氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）ammonium salt，ABTS）自由基清除能力、超氧化物歧化酶（SOD）活性等抗氧化能力的變化情況。采用Pearson相關(guān)系數(shù)法進(jìn)行相關(guān)性分析，初步探究了抗氧化活性與理化指標(biāo)、活性物質(zhì)等的相關(guān)性，為桑葚酵素的發(fā)酵過(guò)程中的精準(zhǔn)控制提供相關(guān)數(shù)據(jù)理論支持，同時(shí)，也對(duì)桑葚酵素的保健功能機(jī)理的研究及其綜合開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮桑葚果實(shí)：采摘于安徽太和縣桑葚果園；白砂糖（食品級(jí)）：市售；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、醋化醋桿菌（Acetobacter aceti）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。NaOH、雙縮脲試劑（均為分析純）：廣州和為醫(yī)藥科技有限公司；SOD活性檢測(cè)試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖、硫酸、苯酚、ABTS（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酸性氧化電位水、純化水：安徽新天生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-50SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；TG16G臺(tái)式離心機(jī)：常州金壇良友儀器有限公司；752N紫外分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；2WAJ阿貝折射儀：上海光學(xué)儀器一廠(chǎng)；YP502N電子分析天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C pH計(jì)：上海雷磁儀器有限公司；SCPJ-10錘式破碎輸送機(jī)：靖江艾莉特食品機(jī)械有限公司；50 L發(fā)酵罐：安徽神健化工醫(yī)藥裝備股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葚酵素的制備

新鮮桑葚用酸性氧化電位水、純化水沖洗后，自然瀝干，打漿，將桑葚果漿與白砂糖按料液比10∶1（g∶mL）加入酵素發(fā)酵罐中，再加入1%調(diào)配好的菌液（釀酒酵母∶醋化醋桿菌∶嗜熱鏈球菌體積比為0.2∶0.4∶0.4），攪拌均勻后，于20～25 ℃條件下避光發(fā)酵49 d。每隔7 d攪拌一次，每次攪拌10 min，攪拌結(jié)束后，取樣，10 000 r/min離心5 min，棄沉淀，上清液即為桑葚酵素，放置在-20 ℃冰箱中保存。

1.3.2 分析檢測(cè)

pH的測(cè)定：采用PHS-3C pH計(jì)；總酸含量的測(cè)定：參照國(guó)標(biāo)GB/T 12456—2021《食品中總酸的測(cè)定》；可溶性固形物含量的測(cè)定：采用阿貝折射儀[14]；蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：采用雙縮脲試劑法[15]；總糖含量的測(cè)定：采用苯酚-硫酸法[16]；總酚含量的測(cè)定：采用Folin-Ciocalteus法[17-18]；超氧化物歧化酶（SOD）活性的檢測(cè)：SOD活性檢測(cè)試劑盒[19-20]。

ABTS自由基清除能力的測(cè)定：參照張浩然等[10]的方法制備ABTS自由基稀釋液，取7.5 μL樣品，用5 mmol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（pH7.4）補(bǔ)充至300 μL，加入5 mL ABTS自由基稀釋液，30 ℃條件下反應(yīng)1 h，在波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定吸光度值。計(jì)算ABTS自由基清除率，其計(jì)算公式如下[21]：

式中：A1是空白管的吸光度值，A2是為樣品測(cè)定管的吸光度值，A3為對(duì)照管的吸光度值。

1.3.3 理化指標(biāo)與抗氧化指標(biāo)相關(guān)性分析

采用Pearson相關(guān)系數(shù)法利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行理化指標(biāo)與抗氧化指標(biāo)的相關(guān)性分析。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（n≥3）表示，采用Origin 2017軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葚酵素發(fā)酵過(guò)程中pH和總酸含量的變化

pH和總酸含量是判斷發(fā)酵是否正常和衡量發(fā)酵液品質(zhì)的主要理化指標(biāo)[7]。桑葚酵素發(fā)酵過(guò)程中pH值和總酸含量的變化見(jiàn)圖1。由圖1可知，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，pH值和總酸含量的變化趨勢(shì)是相反的，pH隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷降低，而總酸含量則不斷升高，直至發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液中pH值和總酸含量都趨于穩(wěn)定，不再發(fā)生變化。在發(fā)酵前42 d，總酸含量呈現(xiàn)顯著的增長(zhǎng)，這主要是由于在該發(fā)酵階段，醋化醋桿菌、嗜熱鏈球菌等微生物快速繁殖，產(chǎn)生乳酸、醋酸等多種代謝產(chǎn)物導(dǎo)致pH持續(xù)降低，總酸含量的不斷增長(zhǎng)[22]。42 d至發(fā)酵結(jié)束，pH穩(wěn)定在3.60，總酸含量穩(wěn)定在6.65 mg/mL，隨后總酸含量出現(xiàn)輕微下降，pH升高至3.65，這可能是由于在發(fā)酵后期，較低的pH影響到微生物的總酸代謝積累，且微生物降解了一部分有機(jī)酸，導(dǎo)致總酸含量略有下降。

圖1 桑葚酵素發(fā)酵過(guò)程中pH及總酸含量的變化Fig.1 Changes of pH and total acid contents in the fermentation process of mulberry Jiaosu

2.2 桑葚酵素發(fā)酵過(guò)程中可溶性固形物和蛋白質(zhì)含量的變化

桑葚酵素發(fā)酵過(guò)程中，可溶性固形物和蛋白質(zhì)含量可較為直觀(guān)反映發(fā)酵液品質(zhì)，其含量隨發(fā)酵時(shí)間的變化見(jiàn)圖2[23]。

圖2 桑葚酵素發(fā)酵過(guò)程中可溶性固形物及蛋白質(zhì)含量的變化Fig.2 Changes of soluble solids and protein contents in the fermentation process of mulberry Jiaosu

由圖2可知，發(fā)酵前7 d可溶性固形物含量迅速下降，蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，該階段營(yíng)養(yǎng)成分充足，微生物迅速繁殖，大量的消耗利用糖類(lèi)等可溶性的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物蛋白質(zhì)和少量的酶類(lèi)，使可溶性固形物含量迅速下降，7 d至發(fā)酵結(jié)束，可溶性固形物呈現(xiàn)先稍微上升隨后下降并趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，而蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)先下降后上升最終趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，這可能是微生物為維持生命活動(dòng)，開(kāi)始將桑葚發(fā)酵液中蛋白質(zhì)等物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可溶性碳水化合物并被逐漸利用，同時(shí)，不斷代謝產(chǎn)生蛋白質(zhì)、酶等代謝產(chǎn)物，使蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，至發(fā)酵結(jié)束（49 d），蛋白質(zhì)含量基本穩(wěn)定在31.85mg/g，可溶性固形物含量穩(wěn)定在6.00%。

2.3 桑葚酵素發(fā)酵過(guò)程中總糖含量的變化

糖作為微生物發(fā)酵過(guò)程中的主要碳源，其含量變化反映微生物的生長(zhǎng)和代謝情況[24]。桑葚酵素發(fā)酵過(guò)程中總糖含量的變化見(jiàn)圖3。

圖3 桑葚酵素發(fā)酵過(guò)程中總糖含量的變化Fig.3 Changes of total sugar contents in the fermentation process of mulberry Jiaosu

由圖3可知，發(fā)酵前14 d，總糖含量出現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)，這可能是有由于此階段微生物進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，糖類(lèi)物質(zhì)主要被釀酒酵母、醋化醋桿菌、嗜熱鏈球菌等微生物用于增殖和代謝，發(fā)酵至14 d，總糖含量達(dá)到4.73 mg/mL，發(fā)酵第14天至發(fā)酵結(jié)束，總糖含量有緩慢增加的趨勢(shì)，并逐漸趨于穩(wěn)定在6.85 mg/mL。這可能是由于微生物的大量生長(zhǎng)和繁殖，分解了桑葚的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，生成了糖類(lèi)代謝產(chǎn)物，使發(fā)酵液的總糖含量升高，當(dāng)微生物消耗的總糖與糖類(lèi)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生量趨于平衡時(shí)，發(fā)酵液中的總糖含量基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，發(fā)酵結(jié)束。

2.4 桑葚酵素發(fā)酵過(guò)程中總酚含量的變化

作為優(yōu)良的天然抗氧化物質(zhì)，酚類(lèi)化合物具有抗氧化、延緩衰老、消炎等功能特性[25]。桑葚酵素發(fā)酵過(guò)程中總酚含量的變化見(jiàn)圖4。由圖4可知，發(fā)酵前7 d，總酚含量上升較慢，這可能是由于處于發(fā)酵前期的桑葚在高滲透壓作用下多酚類(lèi)物質(zhì)的溶出所致。7～42 d總酚含量快速上升，在42 d時(shí)達(dá)到最大值1.61 mg/mL，這可能是由于微生物大量繁殖，代謝較為迅速，產(chǎn)生大量的酚類(lèi)次生代謝產(chǎn)物；總酚含量的上升會(huì)對(duì)微生物的生長(zhǎng)起到一定的抑制作用，此時(shí)，發(fā)酵液中的優(yōu)勢(shì)菌群為了維持自身的正常生命活動(dòng)，一些多酚氧化酶被活化，促進(jìn)酚類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化成其他代謝產(chǎn)物，從而導(dǎo)致在發(fā)酵后期桑葚酵素的總酚含量出現(xiàn)稍微下降的現(xiàn)象。

圖4 桑葚酵素發(fā)酵過(guò)程中總酚含量的變化Fig.4 Changes of total phenol contents in the fermentation process of mulberry Jiaosu

2.5 桑葚酵素發(fā)酵過(guò)程中ABTS自由基清除率的變化

ABTS自由基是一種穩(wěn)定存在的自由基，其清除能力是評(píng)價(jià)親水性和親脂性物質(zhì)的抗氧化能力的指標(biāo)之一[26]。桑葚酵素發(fā)酵過(guò)程中ABTS自由基的清除率變化見(jiàn)圖5。由圖5可知，發(fā)酵過(guò)程中ABTS自由基清除率呈現(xiàn)先上升后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，從發(fā)酵開(kāi)始23.46%的清除率上升至42 d時(shí)的69.86%的清除率，隨后，逐漸趨于穩(wěn)定，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程桑葚酵素的ABTS自由基清除率增長(zhǎng)了約3倍。研究表明，酚類(lèi)化合物、有機(jī)酸等化合物與ABTS自由基清除率存在著密切的關(guān)系，這也可能是使桑葚酵素發(fā)酵液的ABTS自由基清除率逐漸增高并最終趨于穩(wěn)定的主要因素[27]。

圖5 桑葚酵素發(fā)酵過(guò)程中ABTS自由基清除能力的變化Fig.5 Changes of ABTS free radical scavenging rates in the fermentation process of mulberry Jiaosu

2.6 桑葚酵素發(fā)酵過(guò)程中超氧化物歧化酶活性的變化

超氧化物歧化酶廣泛分布在微生物體內(nèi)，是生物體系中抗氧化酶系的重要組成部分，具有延緩皮膚衰老、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等功能[28]。桑葚酵素發(fā)酵過(guò)程中SOD活性的變化見(jiàn)圖6。由圖6可知，SOD活性隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸增加趨勢(shì)，發(fā)酵35 d后緩慢增加并趨于穩(wěn)定，發(fā)酵結(jié)束時(shí)SOD活性從發(fā)酵初期的12.75 U/mL增至93.35 U/mL。說(shuō)明桑葚經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物中含有超氧化物歧化酶或能提高超氧化物歧化酶活力的活性物質(zhì)，這可能也是桑葚酵素具有較強(qiáng)自由基清除能力的重要原因之一。

圖6 桑葚酵素發(fā)酵過(guò)程中超氧化物歧化酶活性的變化Fig.6 Changes of superoxide dismutase activities in the fermentation process of mulberry Jiaosu

2.7 桑葚酵素發(fā)酵過(guò)程中各指標(biāo)之間相關(guān)性分析

在不同的發(fā)酵過(guò)程中，桑葚酵素ABTS自由基清除率、SOD活性這兩個(gè)抗氧化指標(biāo)具有明顯的差異性，這可能與桑葚酵素中的pH、可溶性固形物、總酸、總糖、總酚等有關(guān)，對(duì)發(fā)酵過(guò)程中上述參數(shù)與ABTS自由基清除率、SOD活性進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 桑葚酵素發(fā)酵過(guò)程中各參數(shù)相關(guān)性分析結(jié)果Table 1 Correlation analysis results of various parameters in the fermentation process of mulberry Jiaosu

由表1可知，ABTS自由基清除率和SOD活性這兩個(gè)抗氧化指標(biāo)之間存在極顯著的正相關(guān)性（P＜0.01），總酸、蛋白質(zhì)和總酚與兩個(gè)抗氧化指標(biāo)之間呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)（P＜0.01），而pH、可溶性固形物、總糖與抗氧化指標(biāo)之間呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)果表明，在發(fā)酵過(guò)程中，微生物所產(chǎn)生的有機(jī)酸、酚類(lèi)化合物、蛋白質(zhì)等代謝產(chǎn)物具有一定的抗氧化作用，而糖類(lèi)物質(zhì)在微生物發(fā)酵過(guò)程中被消耗代謝產(chǎn)生有機(jī)酸、酚類(lèi)化合物等活性物質(zhì)，進(jìn)而提高其抗氧化能力。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究了桑葚酵素自然發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)、代謝物含量及抗氧化活性的變化，并對(duì)各個(gè)指標(biāo)之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，pH呈不斷下降的趨勢(shì)，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)，pH在3.65左右趨于穩(wěn)定，總酸含量的變化則與pH相反，發(fā)酵結(jié)束時(shí)總酸含量為6.65 mg/mL?？偺呛涂扇苄怨绦挝锍尸F(xiàn)相同的先快速下降后略有上升，最后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)?？偡雍?、ABTS自由基清除率和SOD活性的變化趨勢(shì)基本相同，呈現(xiàn)先上升后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，這也說(shuō)明了微生物發(fā)酵過(guò)程有生物活性成分的產(chǎn)生，提升了桑葚酵素的抗氧化能力。通過(guò)相關(guān)性分析，也進(jìn)一步說(shuō)明了抗氧化活性的提高與總酸、蛋白質(zhì)和總酚含量的變化呈現(xiàn)極顯著的相關(guān)性（P＜0.01）。通過(guò)對(duì)桑葚酵素發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)和代謝產(chǎn)物含量變化的研究，能較為直觀(guān)的反映出發(fā)酵進(jìn)程和生物活性物質(zhì)的累積情況，為桑葚酵素的研究提供一定的數(shù)據(jù)支持，也為桑葚酵素系列產(chǎn)品的推廣提供了一定的理論基礎(chǔ)。