高心雨，葉 玲，曾廣豐，李 婷*

（1.深圳市深業(yè)航天食品與環(huán)境檢測科技有限公司，廣東 深圳 518040；2.廣州檢驗檢測認證集團有限公司 國家加工食品質量檢驗中心（廣東），廣東 廣州 511447；3.廣州海關技術中心 廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室，廣東 廣州 510623）

桂皮是我國日常調味品中一種常見的原料，由樟科樟屬植物樹皮經過晾曬或烘烤干燥后制得[1]，因為其含有揮發(fā)油、丁香酚、香豆素等易揮發(fā)性物質，具有芳香氣味，因而常被用于復合調味料的制作或在烹飪中直接使用。其中，所含有的香豆素具有抗炎鎮(zhèn)痛的功效[2-3]，同時還在抗腫瘤藥物的開發(fā)領域得到廣泛的關注[4]。近年來，也有研究表明，香豆素的合成衍生物和仿生香豆素類似物對乳腺癌細胞有一定的抑制作用[5-7]。然而，也有相關研究表明，香豆素的代謝產物具有一定的毒性，可影響肝臟功能[8-9]。2017年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構也將香豆素列為3類致癌物。由于香豆素香味獨特，常被作為增味劑添加到食品中，容易出現(xiàn)違法添加及用量超標的情況。因此，建立桂皮中香豆素的檢測方法具有重要的現(xiàn)實意義，將有助于企業(yè)規(guī)避貿易壁壘的風險。

目前，國標GB 5009.284—2021《食品安全國家標準食品中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的測定》建立了嬰幼兒配方食品、糕點、飲料、乳制品以及小麥粉中香蘭素及香豆素的相關測定方法，但天然香辛料中香豆素的測定相關標準及法律法規(guī)尚未建立，檢測方法的相關報道也較少。2021年11月30日，印度食品安全標準局（food safety standards authority of India，F(xiàn)SSAI）發(fā)布公告對進口肉桂中的香豆素展開檢驗，要求所有進口肉桂均需檢驗香豆素含量，且香豆素含量不得超過0.3%。我國年均出口貿易數(shù)量逐年增加，都在215萬t以上。由于印度是香料消費大國，有不少企業(yè)從我國進口桂皮。

目前，已報道的香豆素及其同系物的測定方法主要集中在高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[10-13]、高效液相色譜-質譜法（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）[14-17]和氣相色譜-質譜法（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）[18-22]，而桂皮中香豆素的相關測定方法報道較少。對于大部分的化合物測定，高效液相色譜法選擇性較低，前處理凈化步驟復雜，且儀器檢出限較高[23]。高效液相色譜-串聯(lián)質譜法和氣相色譜-質譜法對目標物的選擇性較高，但受基質干擾明顯，可能會存在假陽性的情況[24]。因此，本研究通過響應面設計優(yōu)化桂皮中香豆素的提取條件，建立超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法（ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF/MS）測定桂皮中香豆素的含量，并進行方法學考察，以期為桂皮中香豆素及其同系物的測定提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桂皮：市售；香豆素和香豆素-d4（純度均≥98.5%）：天津阿爾塔科技有限公司；甲酸、乙腈、乙酸乙酯、甲醇（均為色譜級）：美國Thermo Fisher Scientific公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

API5600+質譜儀：美國AB SCIEX公司；LC-30AD液相色譜儀：日本島津公司；Milli-Q Advantage A10超純水設備：法國默克密理博公司；1-14K高速冷凍離心機：德國希格瑪公司；MultiReax渦旋振蕩器：德國Heidolph公司；KQ-800DB超聲波清洗儀：昆山超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取0.5 g桂皮樣品（打粉后過3號篩，50目）于50 mL離心管中，加入25 mL甲醇，渦旋混勻，于50 ℃水浴超聲提取25 min（超聲儀工作參數(shù)為功率480 W，頻率40 kHz）。然后置于離心機中以10 000 r/min離心5 min，轉移上清液于50 mL比色管中。殘渣用25 mL甲醇重復提取一次，10 000 r/min離心5 min，合并上清液，采用甲醇定容至50 mL。取上清液過0.22 μm有機濾膜，移取0.9 mL濾液加入0.1 mL的5 mg/L香豆素-d4（內標）溶液，混勻，采用UPLC-Q-TOF/MS測定香豆素含量。

1.3.2 UPLC-Q-TOF/MS分析條件

色譜條件：Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，3.0 μm）；流動相以乙腈為A相，0.1%甲酸水溶液為B相，流速0.4 mL/min；進樣體積5 μL；柱溫35 ℃；梯度洗脫程序：0～5 min，20～90%A；5～7 min，90%A；5～7 min，90%A；7～7.5 min，90%～20%A；7.5～10 min：20%A。

質譜條件：采用電噴霧電離和大氣壓化學電離復合源，以正離子模式進行掃描；一級飛行時間質譜（time of flight mass spectrometry，TOF-MS）掃描質量范圍為50～1 000 m/z；二級信息依賴型質譜（information dependent acquisition mass spectrometry，IDA-MS）掃描準確質量范圍為50～1 000 m/z；校正液流速0.5 mL/min；氣簾氣為氮氣（N2），流速35 psi；離子源霧化氣N2流速50 psi；離子源加熱輔助氣N2流速50 psi；離子源溫度450 ℃；離子源電壓5 500 V；去簇電壓DP為90 V；碰撞能量為（30±10）eV；監(jiān)測模式：飛行時間結合信息依賴型掃描（TOF-IDA-MS）；每10個樣品自動校正1次。

定性、定量：以母離子的精確質量數(shù)及出峰時間進行定性，另外兩對響應較高的子離子的精確質量數(shù)輔助定性。采用內標法定量。香豆素及香豆素-d4的具體離子參數(shù)見表1。

表1 香豆素及香豆素-d4的質譜分析參數(shù)Table 1 Parameters of coumarin and coumarin-d4 analyzed by mass spectrometry

1.3.3 桂皮中香豆素提取條件優(yōu)化

單因素試驗：以甲醇用量20 mL、超聲20 min、提取溫度30 ℃、重復提取2次為初始提取條件，依次考察提取溶劑（50%甲醇-水、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、水）、提取溶劑體積（10 mL、15 mL、20 mL、25 mL、30 mL）（合并兩次提取液后，定容至100 mL）、提取溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃）及提取時間（10 min、15 min、20 min、25 min、30 min）對香豆素響應強度的影響。

響應面試驗：在單因素試驗的基礎上，以香豆素響應強度為評價指標，甲醇用量（A）、提取時間（B）及提取溫度（C）為考察因素，采用Design Expert 8.0.6設計響應面試驗，試驗設計因素與水平見表2[23，25]。

表2 桂皮中香豆素提取條件優(yōu)化響應面試驗設計因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface tests for optimization of extraction conditions of coumarin in cinnamon

1.3.4 方法學驗證

按照桂皮樣品本底值附近的1、2、5倍水平，在樣品中添加不同質量濃度的香豆素標準溶液，經前處理方法處理后，供儀器測定分析。通過平行試驗測定回收率和計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。另外，以信噪比3倍和10倍為基準，通過稀釋樣品液的方法測定方法檢出限（limit of detection，LOD）和方法定量限（limit of quantitation，LOQ）[26-29]。

1.3.5 實際樣品的檢測

使用優(yōu)化后的前處理參數(shù)和儀器參數(shù)對市售的10個隨機桂皮樣品進行處理和測定，每個樣品重復6次平行試驗。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016軟件繪圖；化合物的碎片信息使用Analyst TF 1.6軟件采集；采用Design Expert 8.0.6設計響應曲面試驗，并進行數(shù)據(jù)處理和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 香豆素提取條件優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 提取溶劑的選擇

由于實驗前處理方式為直接提取，且一般桂皮中所含的香豆素本底含量較大，因此前處理條件的優(yōu)化，以香豆素的響應強度代替回收率為指標進行考察。不同提取溶劑對香豆素響應強度的影響見圖1。

圖1 不同提取溶劑對香豆素響應強度的影響Fig.1 Effect of different extraction solvents on the response strength of coumarin

由圖1可知，甲醇提取的香豆素響應強度最高，其次是50%甲醇-水和乙腈，而乙酸乙酯和水較低，可能是因為乙酸乙酯極性較低，在提取香豆素的同時，提取了較多雜質，造成了一定的基質效應，而水則可能因為極性較大，香豆素在水中溶解度相對其他溶劑較低[28]。最終選擇甲醇作為提取溶劑。

2.1.2 甲醇用量的確定

甲醇用量對香豆素響應強度的影響見圖2。由圖2可知，香豆素的響應強度隨甲醇用量的增大呈先升高后穩(wěn)定的趨勢。分析原因可能是，當甲醇用量＜20 mL之前，由于甲醇較少，提取不充分，因此響應強度較低；當甲醇用量達到20 mL時，香豆素的響應強度基本達到最佳值，用量繼續(xù)增加時，響應強度增加不明顯。由于考慮到使用25 mL以上提取液提取兩次，需要定容至100 mL，不但溶劑消耗大，而且會降低方法整體靈敏度。綜合定容體積、使用溶劑量及方法檢出限考慮，最終選擇甲醇用量為20 mL。

圖2 甲醇用量對香豆素響應強度的影響Fig.2 Effect of methanol dosage on the response strength of coumarin

2.1.3 提取時間的確定

雖然香豆素性質相對穩(wěn)定，不會因為超聲時間過長而造成分解，但時間過長會嚴重影響實驗效率，增加檢驗成本，因此，考察提取時間對香豆素響應強度的影響，結果見圖3。

圖3 提取時間對香豆素響應強度的影響Fig.3 Effect of extraction time on the response strength of coumarin

由圖3可知，隨著提取時間的延長，香豆素的響應強度呈先升高后趨于穩(wěn)定的趨勢。當提取時間較短時，提取不充分，響應強度低。但當超聲時間＞20 min之后，響應強度變化不明顯，說明在超聲20 min，提取率基本能達到要求，最終選擇超聲時間為20 min。

2.1.4 提取溫度的確定

由于香豆素在加熱條件下不易揮發(fā)，因此可以通過加熱，加快提取速度，并且提高提取率。提取溫度對香豆素響應強度的影響見圖4。由圖4可知，隨著提取溫度的升高，香豆素的響應強度呈先升高后降低的趨勢，分析原因可能是隨著溫度的升高，提取速率增大，但溫度高于50 ℃之后，香豆素遭到一定的破壞，從而造成提取量損失，影響提取率。由于提取溫度為40 ℃和50 ℃時，香豆素的響應強度差異不大，因此，選擇提取溫度為40 ℃。

圖4 提取溫度對香豆素響應強度的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the response strength of coumarin

2.2 香豆素提取條件優(yōu)化響應面試驗

根據(jù)單因素試驗結果，以香豆素響應強度（Y）為評價指標，選擇甲醇用量（A）、提取時間（B）和提取溫度（C）為考察因素進行3因素3水平的響應面試驗，結果與分析見表3，方差分析結果見表4。

采用Design Expert 8.0.6軟件對表3的數(shù)據(jù)進行多元二次回歸擬合，得到回歸方程：Y=12 822+75.25A+475.25B＋1 775.5C+778.5AB-297AC+414.5BC+435.5A2-1 001.5B2+338C2。由表4可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），說明該模型中，香豆素響應強度與其他變量之間對應關系良好。決定系數(shù)R2為0.911 0，調整決定系數(shù)R2Adj為0.796 5，說明79.65%的試驗與該模型符合，適用于大多數(shù)情況。由表4亦可知，一次項C對結果影響極顯著（P＜0.01），二次項B2對結果影響顯著（P＜0.05），其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface tests

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

采用Design Expert 8.0.6軟件對模型進行求解，得到香豆素的最優(yōu)提取條件為甲醇用量24.8 mL、提取時間23.9 min和提取溫度49.9℃，該模型預測的最大響應強度為15813.7cps。為了方便實際操作，將提取條件修正為甲醇用量25 mL，提取時間25 min，提取溫度50 ℃。在此條件下進行3次平行驗證試驗，香豆素的響應強度實際值為15 774.4 cps，與預測值差異不大。最終確定香豆素的最優(yōu)提取條件為甲醇用量25 mL，提取時間25 min，提取溫度50 ℃。

2.3 基質效應

由于試驗采用純甲醇提取的前處理方式，且沒有經過凈化，因此提取液中可能會含有較多的雜質，從而使結果受到基質效應（matrix effect，ME）的影響。采用UPLC-QTOF/MS對多個桂皮樣品進行測定，選擇香豆素含量相對較低的桂皮的提取液配制香豆素，繪制香豆素基質曲線，回歸方程為Y=861.46X+52 551；采用甲醇配制香豆素，繪制香豆素標準曲線，回歸方程為Y=1 051.59X+85 240，將此基質曲線的斜率K1與純甲醇配制的外標曲線斜率K2作對比，以其比值作為ME，結果發(fā)現(xiàn)，香豆素的ME值為81.9%，說明基質效應明顯，抑制效果超過10%。因此，定量計算時，需要用基質曲線或內標進行校正，但由于桂皮中不存在香豆素陰性樣品，因此同一基質曲線對不同樣品進行計算，結果可能會有一定的偏差，操作也較繁瑣，因此最終使用內標法進行定量。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系及靈敏度

以香豆素外標（香豆素）質量濃度和內標（香豆素-d4）質量濃度比值（X）為橫坐標，外標響應強度和內標響應強度比值（Y）為縱坐標，進行一次回歸方程擬合，所得線性方程為Y=2.237 8X-0.007 9，作為內標曲線（內標法）進行定量，相關系數(shù)R2為0.999 3，說明曲線線性關系良好，能準確定量。同時，按照儀器的3倍信噪比和10倍信噪比得到測定方法的檢出限（LOD）為0.3 mg/kg，定量限（LOQ）為1.0 mg/kg，說明本方法整體的靈敏度能滿足一般樣品香豆素含量的測定要求。

2.4.2 方法的回收率及精密度

方法的回收率及精密度試驗結果的RSD見表5。由表5可知，平均回收率為89.9%～99.9%，精密度試驗結果的相對標準偏差為1.58%～3.22%。根據(jù)最終試驗結果可知，回收率及相對標準偏差均能滿足一般樣品的檢測要求。

表5 回收率及精密度試驗結果Table 5 Results of recovery rate and precision tests

2.5 桂皮樣品中香豆素的檢測

隨機選擇市售的10個桂皮樣品，采用最優(yōu)方法處理并測定其香豆素含量，結果見表6。由表6可知，桂皮樣品中的香豆素含量為20.2～661.0 mg/kg，對于不同含量的樣品，相對標準偏差均＜10%，說明本方法可準確測定桂皮中香豆素含量。

表6 桂皮樣品中香豆素含量的測定結果Table 6 Determination result of cinnamon content in cinnamon samples

3 結論

本研究采用甲醇對桂皮中的香豆素進行超聲提取，通過單因素試驗及響應面試驗得到桂皮中香豆素的最優(yōu)提取條件為甲醇用量25 mL、提取時間20 min、提取溫度50 ℃，重復提取兩次，合并提取液；采用穩(wěn)定同位素稀釋結合UPLC-Q-TOF/MS測定香豆素，使用香豆素-d4為內標物進行基質效應的校正，香豆素質量濃度在0.01～2.0 mg/L范圍內，線性關系良好，相關系數(shù)R2為0.999 3，平均回收率為89.9%～99.9%，精密度試驗結果的相對標準偏差（RSD）為1.58%～3.22%，方法檢出限（LOD）為0.3 mg/kg，定量限（LOQ）為1.0 mg/kg，說明該方法操作簡便、靈敏度高，回收率及精密度較好，可應用于桂皮中香豆素含量的測定。