張 娟，綦 艷，嚴家俊，楊純佳，佘之蘊，周臣清

（廣東產品質量監(jiān)督檢驗研究院,廣東 佛山 510670）

生物安全問題是影響世界公共衛(wèi)生安全的主要問題之一。近年來，寄生蟲、病毒、細菌等生物危害不僅嚴重影響著人類的身體健康和正常生活，也阻礙了我國畜牧業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)和種植業(yè)的有序發(fā)展。因此，如何做到對這些生物危害更為快速、準確的檢測成為當務之急。隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，各種新技術層出不窮，等溫核酸擴增技術作為一種新型的檢測技術，與傳統(tǒng)的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測技術相比，憑借其恒溫擴增、操作簡便、降低成本、應用范圍廣等特點被廣泛應用[1]。環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術、重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）技術和重組酶介導擴增（recombinase-aid amplification，RAA）技術是目前發(fā)展比較成熟的3種等溫核酸擴增技術，其中，RAA技術是目前唯一可能研究出體內核酸擴增技術的后備技術[2]。本文重點闡述了RAA技術在寄生蟲、病毒、細菌、動物源性成分、植物病原等生物安全檢測領域的應用，并對其未來發(fā)展前景予以展望，以期為RAA技術的應用開發(fā)提供依據(jù)。

1 RAA技術的簡介

RAA技術是一種新型的恒溫核酸擴增方法，它的顯著特點在于可實現(xiàn)常溫下的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）解鏈和擴增，且可用于定時定量分析[2-3]（見圖1）。和傳統(tǒng)的PCR技術相比，該技術無疑是一種升級換代的體外核酸快速擴增技術。除此之外，還有一種常溫核酸擴增技術—RPA，兩者的主要差別在于前者的重組酶是從細菌或真菌中獲得的，而后者是較難獲得的噬菌體重組酶[4]。RAA技術是我國自主研發(fā)的新型檢測技術，相對RPA來說，其重組酶來源相對廣泛，完全滿足我國快速檢測的需求。RAA技術憑借其反應迅速、靈敏度高、操作簡便等獨特優(yōu)勢，吸引了眾多生物學者的關注。傳統(tǒng)RAA技術的結果判斷需要通過凝膠電泳，隨著檢測技術的飛速發(fā)展，RAA通過與其他檢測方法相結合衍生出眾多新的檢測技術，例如實時熒光重組酶介導擴增（real time-recombinase-aid amplification，real time-RAA）、重組酶介導擴增側向流試紙檢測（recombinase-aidamplification-lateralflowdipstic，RAA-LFD）、RAA微流控芯片檢測等，已廣泛應用于診斷、醫(yī)療、食品安全、農業(yè)等領域，體現(xiàn)出了極大的應用價值。

圖1 重組酶介導擴增法的原理示意圖Fig.1 Principle schematic diagram of recombinase-mediated amplification

2 RAA技術的應用研究

2.1 在寄生蟲檢測方面的應用

RAA檢測技術憑借其自身的優(yōu)勢，逐漸開始應用于寄生蟲病的檢測，成為推進寄生蟲病防控和現(xiàn)場快速檢測的重要手段。丁昕等[5]建立了一種快速、靈敏、特異檢測細粒棘球絳蟲的熒光RAA法，最低可檢測質粒DNA 10拷貝/μL和0.1 ng/μL基因組DNA。同樣是針對細粒棘球絳蟲的RAA檢測方法，周鴻讓等[6]建立針對細粒棘球絳蟲G1的RAA檢測技術，最低可檢測量為200 fg/μL，最低檢出質?？截悢?shù)為200拷貝/μL，可望用于該蟲種的鑒定以及棘球蚴病基因診斷。上述相同的檢測方法和研究對象，檢測靈敏度雖有所不同，但均展現(xiàn)出較高的靈敏度。此外，周鴻讓研究團隊還分別建立了基于RAA技術和雙重RAA技術的多房棘球絳蟲的檢測方法，為多房棘球絳蟲鑒定與棘球蚴病診斷提供技術支撐[7-8]。張學勇等[9]則建立了RAA多重核酸檢測技術，用于多房棘球絳蟲、細粒棘球絳蟲和石渠棘球絳蟲的快速鑒定，基因組DNA的最低檢測限分別為2.0 pg/μL、2.5 pg/μL和3.1 pg/μL，為棘球蚴病病原檢測和疫病監(jiān)測提供了一種新的檢測工具。張強等[10]建立了一種可用于廣州管圓線蟲核酸檢測的熒光RAA法，該法最低檢出限分別為10拷貝/μL重組質粒和100 pg/μL基因組DNA，具有較好的敏感性和特異性。同時，該團隊利用同樣的方法檢測華支睪吸蟲，重組質粒的最低檢出限為10拷貝/μL，基因組DNA最低檢出限為3 pg/μL[11]。鄭偉等[12]建立了可檢測瘧疾的快速檢測方法，可對100個拷貝的目的基因進行擴增，并具有較好的特異性。針對血吸蟲病，眾多學者利用該技術在血吸蟲的檢測方面做出了較多研究成果。趙松等[13-14]建立了一種可用于檢測日本血吸蟲特異性基因片段的RAA方法，可特異性擴增成蟲及蟲卵基因組DNA，最低可檢出的質粒拷貝數(shù)為20個/μL，具有應用于日本血吸蟲病基因診斷的價值。隨后，該研究團隊又建立了可檢測日本血吸蟲核酸片段的實時熒光RAA方法，在5 min時即可觀察到明顯的熒光信號，不同拷貝數(shù)的擴增均可在10 min內完成，最低可檢出的質粒濃度為10拷貝/μL。此外，該團隊還基于該方法建立了曼氏血吸蟲的檢測技術，最低可檢出質?？截悢?shù)為10拷貝/μL和0.1 fg/μL[15]。董萱等[16]前期建立的RAA方法能辨別出包括早期感染在內的血吸蟲感染性釘螺，檢測結果一致性高、重復性好，可用于日本血吸蟲感染性釘螺的早期檢測。此外，該研究團隊基于熒光RAA法最低可檢測出100只陰性釘螺中混有1只感染性釘螺[17]，同時也對該方法檢測日本血吸蟲感染性釘螺的效能進行評價，證明該方法具有良好檢測效能，在日本血吸蟲感染性釘螺篩查中具有一定應用前景[18]。針對生活飲用水中比較受關注的賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲，有學者也基于上述方法做了相關研究。倪碧嫻等[19-20]分別建立了可檢測藍氏賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲的熒光RAA方法，其中藍氏賈第鞭毛蟲以重組質粒和基因組DNA為模板，檢測敏感性可達102拷貝/μL和1 pg/μL；隱孢子蟲對重組質粒、不同濃度隱孢子蟲卵囊基因組DNA和不同數(shù)量隱孢子蟲卵囊基因組DNA的最低檢出限分別為102拷貝/μL、1 pg/μL和1個/50 μL。兩者的檢測靈敏度高且一致，特異性強，檢測過程中無交叉反應，相比現(xiàn)有的檢測方法，適用性更強。

2.2 在病毒檢測方面的應用

針對目前口岸傳染病巡查手段局限，主要靠測溫儀發(fā)現(xiàn)發(fā)熱病人，而引起發(fā)熱癥狀的傳染病涵蓋廣泛，主要包括蟲媒傳染病和呼吸道傳播疾病。目前對該類病毒感染的確診主要基于核酸檢測，RAA技術依靠自身優(yōu)勢在輸入性傳染病排查方面顯示出明顯的優(yōu)越性。鄭偉等[21]基于RAA技術建立了黃熱病毒的口岸快速檢測方法，檢測下限可達100 copy，與登革熱病毒、西尼羅病毒等蚊媒病毒無交叉反應。此外，針對該類蟲媒病毒，李樊等[22]采用反轉錄重組酶介導核酸擴增（reverse translation-recombinase-aid amplification，RT-RAA）法建立了塔希納病毒檢測方法，質粒標準品的檢測下線為100拷貝/反應，病毒培養(yǎng)物最低檢出限為10空斑形成單位/反應。呂沁風等[23]則建立了西尼羅病毒的RT-RAA檢測方法，檢測限可達10 copies，與其他蚊媒病毒無交叉反應。張勤等[24]基于RT-RAA技術建立了日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）分型鑒定方法，檢測靈敏度可達100拷貝/μL，其中JEV I的靈敏度可達10拷貝/μL，適用于口岸現(xiàn)場JEV的快速檢測。此外，該團隊還建立了快速鑒定登革病毒血清型的方法，檢測的靈敏度可達102copies/μL，為確定登革病毒分子流行病學趨勢提供技術支持[25]。針對新冠病毒的爆發(fā)，研究學者也做出快速反應。XUE G H等[26]建立了該病毒的RT-RAA快速檢測方法，檢測結果與實時PCR結果一致，為該病毒的檢測提供了一種簡單可靠的方法。ZHENG Y Z等[27]建立了新冠病毒的反轉錄重組酶介導核酸擴增-側流層析試紙條（RT-RAALFD）檢測方法，該方法檢出限達1 copy/μL，在檢測臨床樣本時，與實時定量PCR檢測結果保持高度一致的特異性和靈敏度。趙凱穎等[28]為建立非洲豬瘟病毒簡便且高效的基層臨床檢測方法，基于RAA技術建立了與世界動物衛(wèi)生組織（Office International Des épizooties，OIE）推薦的熒光定量PCR方法靈敏度相當?shù)臋z測方法，靈敏度可達10 copies/μL。徐超等[29]建立了檢測鴨瘟病毒的普通和熒光RAA方法，其靈敏度分別為100 copies/μL和10 copies/μL，檢測結果與商業(yè)化PCR試劑盒的符合率為100%。趙康辰等[30]建立了H7N9禽流感病毒的反轉錄重組酶介導核酸擴增（RT-RAA）技術，H7反應體系和N9反應體系的最低檢出限分別為10 copy/μL和100 copy/μL，為該病毒快速檢測提供了新的分子工具。陳淑丹等[31]采用反轉錄重組酶介導核酸擴增技術建立檢測人鼻病毒的快速方法，最低擴增拷貝數(shù)為100拷貝。該研究團隊同樣利用該技術建立了禽流感病毒H5N1的快速檢測方法，對質粒檢測靈敏度可達10拷貝[32]。

2.3 在細菌檢測方面的應用

RAA技術由于彌補了傳統(tǒng)培養(yǎng)和依賴溫變設備技術的不足，能在現(xiàn)場和非實驗室環(huán)境進行即時檢測，所以進一步奠定了其在細菌檢測這方面的應用前景。首先，在食源性致病菌的檢測方面展現(xiàn)了巨大的潛力。方微微等[33]基于RAA技術建立了快速、靈敏、特異檢測哈維弧菌的方法，檢測細菌純培養(yǎng)物的最低檢測濃度為7.55×10-1copies/μL，且與其他食源性致病菌無交叉反應。郝林慧等[34]建立了水產品中副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）的RAA快速檢測方法，檢出限為5.3 CFU/mL，與其他弧菌屬菌種不存在交叉反應，和傳統(tǒng)培養(yǎng)法結果高度一致。同樣是對于副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）的檢測，孫曉紅等[35]則將RAA技術與側流層析試紙條結合，建立可準確、高效地檢測副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）的方法，靈敏度比常規(guī)PCR高出十倍數(shù)量級，細菌純培養(yǎng)物最低檢測限可達1.89×10 copies/μL。同樣基于RAA與側流層析試紙條結合技術，后來旺等[36]則建立了金黃色葡萄球菌（Staphy-lococcus aureus）的可視化快速檢測方法，檢出限分別為4 fg/μL DNA與183 CFU/mL純菌液，為牛奶中金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的檢測提供新的發(fā)展方向。魏瑩等[37]利用RAA技術建立快速檢測A族乙型溶血性鏈球菌（Streptococcus hemolytic-β）的方法，在39 ℃，20 min內即可完成檢測，靈敏度為10 拷貝/μL。張小平等[38]基于該技術建立了沙門氏菌（Salmonella）的快速檢測方法，檢測下限為102拷貝/μL，與大腸桿菌（Escherichia coli）、志賀氏菌（Shigella）無交叉反應，特異性良好。同樣是基于對沙門氏菌（Salmonella）的檢測，周冬根等[39]建立的方法對細菌純培養(yǎng)物的靈敏度為19 CFU/mL，對模擬樣品的靈敏度為190 CFU/mL，該方法在食源性疫情現(xiàn)場調查以及監(jiān)測中將發(fā)揮重要作用。崔榮飛等[40]基于該技術建立了食品中單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的快速檢測方法，最低可檢出的質?？截悢?shù)為10拷貝/反應。王金鳳等[41]建立了一種快速檢測銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的實時熒光RAA檢測方法，對基因組DNA的檢出限為3.0×103fg/μL，對純培養(yǎng)物的檢出限為1.0×103CFU/μL。成簇的規(guī)律間隔短回文重復序列及其相關蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein，CRISPR/Cas）系統(tǒng)是原核生物用來抵御外來遺傳物質入侵的免疫防御系統(tǒng)，現(xiàn)已被改造成一種高效的基因編輯工具[42]。葛以躍等[43]將該檢測系統(tǒng)與RAA技術相結合，建立了快速檢測副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）的RAA-Cas13a檢測方法，靈敏度為10拷貝DNA分子/反應，與實時PCR對臨床樣本的檢測結果一致性較高。其次，在環(huán)境病原微生物的檢測方面也頗具競爭力。郭雨等[44]建立一種快速、靈敏檢測土壤沙門氏菌（Salmonella）的實時重組酶介導等溫核酸擴增（RT-RAA）方法，最低檢測質?？截悢?shù)為10拷貝/反應。此外，朱立葦?shù)萚45]則采用該技術監(jiān)測血站采供血過程中的金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和溶血性鏈球菌（Streptococcus pyogens），對兩種致病菌的最低檢出限均為102CFU/mL，檢測結果與形態(tài)學-生化法相同，為血站采供血過程中致病菌的檢測提供一種快捷的檢測方法，提高了臨床用血安全。綜上所述，RAA技術可以替代PCR技術作為新型恒溫核酸檢測技術用于食源性致病菌檢測。

2.4 在動物源性成分檢測方面的應用

肉制品摻雜摻假是食品安全問題的一個重要方面，不僅侵犯了消費者的權益，甚至會影響畜牧業(yè)的健康發(fā)展和進出口貿易的有序進行。隨著核酸擴增技術的發(fā)展，目前應用于動物源性成分檢測的主流技術是實時熒光PCR。RAA作為一種新興的檢測技術，憑借其自身的優(yōu)勢為肉源性成分的快速檢測提供了新的發(fā)展方向。苗麗等[46]為了快速準確檢測出肉制品中的雞源性成分，建立了實時熒光RAA方法，可穩(wěn)定檢出最低質量分數(shù)為0.1%的雞源性成分，與豬肉、牛肉、羊肉均沒有交叉反應。沈泓等[47]以水牛角鑒別為例建立中藥RAA快速鑒別方法，用于水牛角及其混偽品牦牛角的鑒別，在中藥現(xiàn)場鑒定、藥檢抽查等方面有著廣闊的應用前景。周新麗等[48]將離心式微流控芯片和RAA技術相結合，用于牛、羊、豬、鴨和雞源性成分的快速檢測，檢出的最小質量分數(shù)分別為1.0%、1.0%、0.1%、0.1%、1.0%，檢測的特異性良好，無交叉反應。新方法的建立為有快速檢測需求的食品安全監(jiān)管部門提供了有效的技術支撐。

2.5 在植物病原檢測方面的應用

RAA技術在植物病原檢測方面開始嶄露頭角，尤其在農作物病害田間早期診斷、種子病害以及貯藏期病害快速檢測等方面。玉米細菌性枯萎病菌是我國進境植物檢疫性病原物之一，單長林等[49]基于熒光RAA技術建立了該病菌的快速檢測技術，靈敏度達280 fg/μL，可用于現(xiàn)場檢測。新菠蘿灰粉蚧是我國進境植物檢疫性害蟲，能傳播鳳梨凋萎病毒，唐慧驥等[50]利用RAA技術建立了該害蟲的快速鑒定方法，檢測DNA質量濃度限值為1.6×103μg/mL，可大大提高一線口岸截獲粉蚧的鑒定效率。褐飛虱是亞洲稻區(qū)最嚴重的水稻害蟲之一，還可以傳播病毒，因此，準確預測預報蟲情是防治的關鍵。羅舉等[51]建立了褐飛虱的RAA-LFD鑒定技術可用于其與近似種的快速區(qū)分，為植保領域的現(xiàn)場即時檢測提供了新的契機。RAA技術的應用研究成果見表1。

表1 重組酶介導擴增法的應用研究成果Table 1 Application research results of the recombinase-mediated amplification

綜上所述，RAA技術在各研究領域的應用都展現(xiàn)出較高的靈敏度。雖然對于相同的研究對象，不同的研究學者得出的靈敏度略有不同，但基本與現(xiàn)有的實時熒光PCR檢測技術表現(xiàn)出較為一致的靈敏度。在保證較高靈敏度的前提下，RAA檢測方法的優(yōu)勢將進一步凸顯，為其更廣闊的發(fā)展領域奠定堅實基礎。

3 展望

傳統(tǒng)PCR技術自研發(fā)之初，一直飽受儀器設備、人員能力、空間、電力等諸多因素的限制?；诖?，常溫核酸擴增技術的優(yōu)勢顯而易見，其中RPA和RAA作為該技術的典型代表，主要區(qū)別在于重組酶的獲取來源不同。RPA技術已經被英國TwistDx公司申請專利，基于該技術的相關研究都需要依托TwistDx研發(fā)的系列試劑盒[52]。RAA技術目前已經在國內申報了專利，技術的便攜性能充分擴大核酸擴增技術的應用領域，使其有望在很大程度上突破傳統(tǒng)PCR技術的使用限制。RAA技術雖然還處于前期階段，但作為一種基礎的研究手段，取得的成績已不俗。RAA技術的產生和發(fā)展促進了分子生物學的研究，在未來有可能進一步促進功能基因組學和植物分子生物學獲得突破性進展。同時，隨著該技術的進一步深化、完善，其檢測對象可以從核酸擴大到蛋白質、糖類及其他大分子化合物，并可能開發(fā)出系列快速診斷產品，定時定量檢測特定疾病。以RAA技術為基礎的各類核酸快速擴增技術或產品，將為人類健康和動植物疫病的防治提供及時的診斷。