楊 尚，宋興亞，趙 鵬，呂穎賢，于 翔，袁 穎，黃永震，朱緒偉*

（1.河南省蠶業(yè)科學(xué)研究院，河南 鄭州 450000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院；3.河南省農(nóng)學(xué)會(huì)；4.河南省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所）

家蠶又名桑蠶，是一種具有極高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的鱗翅目昆蟲，不僅用于養(yǎng)蠶業(yè)，還用于許多科學(xué)領(lǐng)域。從農(nóng)耕文明的養(yǎng)蠶繅絲到工業(yè)文明的輕紡工業(yè)，家蠶一直扮演著重要角色。在我國(guó)悠久的養(yǎng)蠶歷史中，不同地區(qū)因地制宜，飼養(yǎng)適應(yīng)當(dāng)?shù)貤l件的家蠶品種。自然條件和人為干預(yù)的選擇使得分布在不同地區(qū)家蠶的遺傳資源更加復(fù)雜化和多樣化，這為選育工作提供了豐富的原始資料。對(duì)家蠶品種選育方法的改進(jìn)可以提高養(yǎng)蠶的生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益，從而推動(dòng)整個(gè)家蠶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 家蠶選育的必要性

家蠶養(yǎng)殖技術(shù)起源于中國(guó)，隨著“一帶一路”倡議在國(guó)際上被廣泛認(rèn)同，南亞、東南亞及非洲等地的一些國(guó)家對(duì)蠶絲的熱情格外高漲［1］。豐富的土地資源和廉價(jià)的勞動(dòng)力使得這些國(guó)家發(fā)展桑蠶產(chǎn)業(yè)有著得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。印度的蠶絲生產(chǎn)量已經(jīng)緊隨中國(guó)之后，位居世界第二，而巴西雖然產(chǎn)業(yè)規(guī)模小，但能生產(chǎn)世界最優(yōu)質(zhì)的生絲，成為一些世界奢侈品的原料專供地［2］。這些國(guó)家蠶桑業(yè)的發(fā)展使得我國(guó)蠶桑業(yè)遭受極大的考驗(yàn)，發(fā)展環(huán)境不容樂觀。加快產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型和品種培育便是提高我國(guó)蠶桑產(chǎn)品國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力的出路。因此，培育出“體質(zhì)強(qiáng)健、多抗好養(yǎng)、優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)、繁育能力強(qiáng)”的優(yōu)質(zhì)蠶種勢(shì)在必行。

2 家蠶育種基本思路

2.1 確定合理的育種目標(biāo)

育種目標(biāo)的確定是為了讓動(dòng)物生產(chǎn)獲得更大的經(jīng)濟(jì)效益，這是育種工作中最為重要的決策。目標(biāo)的偏離或是不合理，會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物世代間的遺傳進(jìn)展極大降低甚至背道相馳。因此，合理的育種目標(biāo)可以為育種計(jì)劃的制定指明方向，讓育種工作少走彎路。

確定合理的育種目標(biāo)需要綜合多方面因素全面考慮，主要需要包括以下要素：

2.1.1 市場(chǎng)需求

動(dòng)物生產(chǎn)的最終目的都是為人類提供服務(wù)，這決定了家蠶育種也必須以市場(chǎng)需求為出發(fā)點(diǎn)，明確在育種中應(yīng)該提升或改變哪些性狀。綜合考慮家蠶和蠶絲的相關(guān)性狀來順應(yīng)市場(chǎng)需求，這樣的育種工作才有意義。但同時(shí)因?yàn)橛N的效果存在滯后性，即育種群的遺傳進(jìn)展要經(jīng)過雜交繁育的代代傳遞，并且世代之間取得的遺傳進(jìn)展有限，同時(shí)我國(guó)的家蠶良種繁育采用嚴(yán)格的三級(jí)繁育、四級(jí)制種制度，一個(gè)優(yōu)良家蠶品種從理論育成到實(shí)際推廣，需要幾年時(shí)間。所以在制定育種目標(biāo)的時(shí)候不能只簡(jiǎn)單地看到當(dāng)下的市場(chǎng)需求，必須要對(duì)市場(chǎng)做出一定的預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)短期、中期、長(zhǎng)期的市場(chǎng)需求。

2.1.2 育種素材

預(yù)測(cè)市場(chǎng)需求后，育種工作的開展已經(jīng)有了方向，但要實(shí)際開展，必須要有物質(zhì)條件——育種素材，有滿足條件的育種素材才可以繼續(xù)進(jìn)行實(shí)際的育種工作。因此，必須充分了解現(xiàn)有的育種群，包括核心群數(shù)量、群體結(jié)構(gòu)、性狀均值、遺傳參數(shù)、近交系數(shù)和群體之間的配合力等等。然后再根據(jù)這些育種群的情況，來選擇符合育種目標(biāo)的育種群進(jìn)行雜交，標(biāo)準(zhǔn)品種不能滿足需要的時(shí)候可以引進(jìn)地方品種血統(tǒng)。

2.2 選擇育種素材

根據(jù)育種目標(biāo)選定改良的性狀，選出符合條件的純種群體，如育成帶有對(duì)生產(chǎn)影響大的家蠶疾病抗性基因的蠶種、某些產(chǎn)品對(duì)蠶絲品質(zhì)有更高的要求、部分地區(qū)受氟污染影響嚴(yán)重需要選育出耐氟品種等等。當(dāng)前主要通過多元雜交的方式進(jìn)行育種，這就要選擇帶有不同突出性狀的種群作為父本和母本，從而把雙親的性狀綜合到新品種身上。

2.3 預(yù)測(cè)育種效果

我國(guó)家蠶品種資源豐富，僅根據(jù)育種目標(biāo)初步篩選出的育種群，可能會(huì)有很多群體進(jìn)入備選名單。如果直接開展雜交試驗(yàn)，結(jié)果不盡人意，就會(huì)耗費(fèi)大量人力物力和時(shí)間，因此在進(jìn)行雜交之前，需要對(duì)不同組合的雜交效果進(jìn)行大致估計(jì)，以此篩選出成功率較高、雜交效果好的組合進(jìn)行雜交試驗(yàn)。

長(zhǎng)期以來人們一直在探索可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)出雜交效果的方法，現(xiàn)在被廣泛應(yīng)用的方法主要有兩種：一是遺傳距離法；二是配合力預(yù)測(cè)法。遺傳距離法利用基因的相對(duì)距離來反映基因交換的概率，但其只能估計(jì)群體間的差異程度，對(duì)單獨(dú)性狀的生產(chǎn)性能無法準(zhǔn)確預(yù)測(cè)。之前有研究通過DNA 多態(tài)性遺傳距離來預(yù)測(cè)雜交效果，結(jié)果顯示以DNA 多態(tài)性遺傳距離篩選出的雜交組合能夠獲得更優(yōu)的生產(chǎn)性能［3］。配合力預(yù)測(cè)法目前發(fā)展較為成熟，在生產(chǎn)實(shí)踐中廣泛應(yīng)用。在其他動(dòng)物的研究中有將配合力預(yù)測(cè)放在基因組水平上的報(bào)道［4］，可以在早期選種節(jié)約時(shí)間，提高選擇效率，目前在家蠶中尚未見有此研究。

2.4 新品系選育

根據(jù)確定好的育種目標(biāo)和雜交組合，采用雜交的方式，再對(duì)子代進(jìn)行系統(tǒng)選擇，一般雜交進(jìn)行到第3、4代后，換為同蛾區(qū)交配的方式，即互為全同胞的雌雄個(gè)體之間交配，可以比較容易地得到更加穩(wěn)定的遺傳性狀。

3 育種技術(shù)進(jìn)展

20世紀(jì)以來，連續(xù)個(gè)體選擇法和系統(tǒng)選擇法的出現(xiàn)，使得家蠶育種取得兩次飛躍性的進(jìn)步［5］，也將家蠶育種推向了一個(gè)高峰。隨著時(shí)間的遷移，傳統(tǒng)育種方法的局限性慢慢顯露出來：有限的遺傳資源在漫長(zhǎng)的時(shí)間里幾乎被發(fā)掘完全。

但隨著技術(shù)的快速進(jìn)步，分子生物學(xué)等領(lǐng)域取得許多技術(shù)創(chuàng)新和技術(shù)突破，并被迅速應(yīng)用在動(dòng)物育種上，讓育種工作可以在基因水平挖掘品種的潛力，為育種工作的開展注入新的活力［6］。

3.1 物理誘變制造育種素材

物理誘變是制造基因突變的有效手段，但由于其誘變方向的不確定性和生物安全問題，物理誘變?cè)趧?dòng)物育種中的應(yīng)用不如在植物和微生物中的廣泛。誘變方向的不確定性使得誘變育種在動(dòng)物育種上的應(yīng)用極大受限，原因是動(dòng)物相較于植物和微生物而言，存在繁殖力低、世代間隔長(zhǎng)、培育成本高等特點(diǎn)。家蠶作為昆蟲，與其他動(dòng)物相比，繁殖性能強(qiáng)且世代間隔短，因此，20 世紀(jì)末一些科研院所應(yīng)用物理誘變的方法來獲取新的家蠶育種材料。

安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所和中國(guó)科學(xué)院等離子體物理所聯(lián)合開展低能氮離子（N+）對(duì)家蠶的誘變育種研究：將N+注入家蠶雌蛹及卵中，誘發(fā)基因突變，隨后在獲得的變異群體中選擇表現(xiàn)優(yōu)于對(duì)照組，即獲得有益突變的個(gè)體，作為育種素材，用以培育新的優(yōu)良品種［7］。山東蠶業(yè)科學(xué)研究所育成的“C66”和“煙6”以及遼寧蠶業(yè)科學(xué)研究所選育的“多絲3 號(hào)”都是采用激光照射處理蠶卵或蠶蛹獲得的柞蠶新品種［8］，也可參考用在家蠶的誘變育種中。

3.2 基因組技術(shù)挖掘育種潛力

隨著基因組技術(shù)的發(fā)展，我國(guó)在1996 年提出家蠶基因組計(jì)劃，在2004年公布了家蠶基因組序列草稿，隨后以西南大學(xué)為主的跨國(guó)研究團(tuán)隊(duì)于2008年在此基礎(chǔ)上完成了家蠶基因組精細(xì)圖譜，將家蠶全長(zhǎng)cDNA序列整合成長(zhǎng)度為432Mb、包含14 623 個(gè)基因的完整基因組序列、次年以29 種家蠶和11 種野生蠶為材料進(jìn)行了全基因組重測(cè)序，鑒定了基因組多態(tài)性，構(gòu)建了單堿基對(duì)解析的高精度家蠶遺傳變異圖。有關(guān)專家基于重測(cè)序數(shù)據(jù)構(gòu)建了第1個(gè)針對(duì)家蠶的CNV圖譜，并在家蠶基因組中共鑒定出319個(gè)CNVs。這些研究在家蠶基因組中篩選出了大量穩(wěn)定存在的SNPs 和SVs 等遺傳突變，提出了許多與家蠶的生長(zhǎng)發(fā)育及經(jīng)濟(jì)性狀等關(guān)聯(lián)的候選基因，可作為家蠶分子育種的分子標(biāo)記，揭示家蠶雜交育種機(jī)理的同時(shí)，為廣泛開展分子育種工作打下了基礎(chǔ)。

3.3 基因編輯拓寬育種道路

越來越多物種基因組的公布，基因組編輯也應(yīng)運(yùn)而生。ZFN、TALEN 等基因核酸酶的發(fā)現(xiàn)，還有被稱為“基因魔剪”的CRISPR使得基因編輯技術(shù)在世界范圍內(nèi)引起空前關(guān)注。

3.3.1 依賴ZFNs的基因組編輯

ZFN基因編輯技術(shù)適用于家蠶育種，將ZFN mRNA直接注射到胚胎中，可以省去構(gòu)建表達(dá)載體等步驟并且不需要酶的異位表達(dá)，極大地縮減了進(jìn)行家蠶基因編輯的時(shí)間。該技術(shù)另一個(gè)主要的優(yōu)勢(shì)在于ZFs 可以進(jìn)行自定義修飾，以構(gòu)建具有新的切割特異性的核酸酶。

3.3.2 依賴TALEN的基因組編輯

TALEN可以對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)突變是基于細(xì)菌TAL效應(yīng)蛋白的作用，步驟包括TALEN 的組裝，離體TALEN RNA 的合成、胚胎顯微注射及突變檢測(cè)和PCR 分析。有關(guān)專家同樣用BmBLOS2 基因來表示TALEN 基因編輯的準(zhǔn)確性，結(jié)果證實(shí)TALEN有更高的成功率，該結(jié)論在其他動(dòng)物中也得到了驗(yàn)證，并且TALENs的設(shè)計(jì)和構(gòu)建非常簡(jiǎn)單和快速。

3.3.3 依賴CRISPR-Cas的基因組編輯

在當(dāng)下各種基因編輯方法中，避免脫靶效應(yīng)至關(guān)重要。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)以其高效率、高保真性和簡(jiǎn)單性，從而成為最受歡迎和最廣泛應(yīng)用的系統(tǒng)。CRISPR/Cas9通常由一個(gè)Cas9蛋白質(zhì)與單一引導(dǎo)RNA（gRNA），兩者形成一個(gè)蛋白質(zhì)-RNA 復(fù)合物，然后切割目標(biāo)。使用CRISPR-Cas 系統(tǒng)對(duì)家蠶的大多數(shù)研究都集中在使用CRISPR-Cas系統(tǒng)進(jìn)行功能基因分析，以闡明某些機(jī)制，或增強(qiáng)蠶對(duì)BmNPV 的抵抗力。

有關(guān)專家首次報(bào)道了使用CRISPR-Cas9 工具編輯家蠶基因組的成功操作：作者針對(duì)一個(gè)必需基因BmBlos2，它與人類Blos2 基因直系同源。設(shè)計(jì)了兩個(gè)sgRNA（23-bp）以誘導(dǎo)導(dǎo)致靶基因功能喪失的突變。由1 個(gè)sgRNA 和Cas9 核酸酶形成的每個(gè)復(fù)合物都被注射到前胚層胚胎階段。通常，幼蟲體被不透明，但當(dāng)BmBlos2 基因功能喪失，外皮變成半透明。這種效應(yīng)可以被視為突變體檢測(cè)的表型標(biāo)記。

有關(guān)專家在家蠶中利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)獲得去除家蠶核多角體病毒的轉(zhuǎn)基因個(gè)體，揭示了一種通過使用強(qiáng)大的CRISPR-Cas 方法抑制不同家蠶的有前景的策略。IGFLP已被證實(shí)在家蠶體內(nèi)參與成長(zhǎng)過程，有關(guān)學(xué)者使用CRISPR/Cas9基因組編輯工具敲除IGFLP基因，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，IGFLP 基因的缺失導(dǎo)致卵巢更小，產(chǎn)卵數(shù)量更少。

為了讓家蠶能夠生產(chǎn)高性能纖維，有關(guān)專家使用CRISPR-Cas9 成功敲入了蠶基因組中的蜘蛛絲基因，為了避免干擾蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，將蜘蛛絲基因敲入BmFibL或BmFibH 的內(nèi)含子之一，證明了在家蠶中使用CRISPR-Cas9 在工業(yè)規(guī)模上獲得具有增強(qiáng)機(jī)械性能絲綢的可行性。

有關(guān)專家發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新的CRISPR 系統(tǒng)Saca 9 和AsCpf 1，這兩個(gè)系統(tǒng)也可以進(jìn)行高效的位點(diǎn)特異性基因組編輯，并構(gòu)建了完整的CRISPR系統(tǒng)，通過集成系統(tǒng)，在平均6.5個(gè)堿基對(duì)中就找到一個(gè)可定位的靶點(diǎn)，極大地便利了基因組水平開展的育種工作。

此外，CRISPR-Cas 還被用于家蠶中進(jìn)行表觀遺傳修飾。在這種情況下，有關(guān)專家探討甲基化對(duì)家蠶發(fā)育的影響。該研究為研究靶位點(diǎn)DNA 甲基化重要性提供了一種策略，具有重要意義。此外，他們的研究代表了探索DNA 甲基化狀態(tài)對(duì)家蠶及其他不同表型影響的起點(diǎn)。

家蠶育種在我國(guó)已經(jīng)有近千年的歷史，技術(shù)的飛快進(jìn)步和育種工作者的辛勤勞動(dòng)給家蠶育種行業(yè)注入了源源不斷的動(dòng)力。育種工作從確定育種目標(biāo)到選擇育種素材、從預(yù)測(cè)育種效果到選育新品系，步步是關(guān)鍵。21世紀(jì)生物技術(shù)的飛速發(fā)展，從隨機(jī)突變到精確敲除、從單純的基因突變體制作到多樣化的基因組精確編輯，家蠶全基因組的公布和基因編輯工具的升級(jí)給家蠶的研究與育種帶來了變革性的影響，抓住機(jī)遇，家蠶育種將進(jìn)入全新的高速時(shí)代。