文雨松，李召軍，胡飛，林丹丹

江西省寄生蟲(chóng)病防治研究所，江西省血吸蟲(chóng)病預(yù)防控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330096

血吸蟲(chóng)病是一種在世界范圍內(nèi)廣泛分布的寄生蟲(chóng)病，嚴(yán)重阻礙社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、威脅公共衛(wèi)生安全[1]。人或動(dòng)物主要是通過(guò)接觸含有血吸蟲(chóng)尾蚴的水體而感染，感染的高發(fā)時(shí)期是春秋時(shí)節(jié)和長(zhǎng)江汛期[2-3]。當(dāng)前血吸蟲(chóng)病在我國(guó)已呈低流行態(tài)勢(shì)，構(gòu)建實(shí)施有效的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，加強(qiáng)監(jiān)測(cè)工作是控制血吸蟲(chóng)病的重點(diǎn)[4]。對(duì)重點(diǎn)區(qū)域的水體監(jiān)測(cè)能及時(shí)發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)并采取應(yīng)急防控措施，從而有效保護(hù)人群的身體健康。因此，對(duì)水體日本血吸蟲(chóng)尾蚴監(jiān)測(cè)預(yù)警是及時(shí)發(fā)現(xiàn)和處置疫情的重要措施之一[5]。尾蚴監(jiān)測(cè)預(yù)警的核心內(nèi)容是尾蚴檢測(cè)，本文主要就水體日本血吸蟲(chóng)尾蚴檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展做一綜述。

1 哨鼠法

哨鼠法是目前使用最廣泛的水體日本血吸蟲(chóng)感染性檢測(cè)技術(shù)。哨鼠法是將人工飼養(yǎng)的成年健康小白鼠放入特制的鼠籠中，投放于需測(cè)定的水體，使小白鼠的腹部及尾部接觸水體，一般持續(xù)2天，每天投放4 小時(shí)，現(xiàn)場(chǎng)投放后轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)35天后解剖查蟲(chóng)觀察血吸蟲(chóng)感染情況[6]。

自20 世紀(jì)50 年代中期，哨鼠法一直是我國(guó)水體尾蚴檢測(cè)的主要方法，廣泛應(yīng)用在血吸蟲(chóng)病綜合防治工作、汛期重點(diǎn)水域的監(jiān)測(cè)和科研實(shí)驗(yàn)中[7-12]。例如陳陵等[11]利用哨鼠法在四川省血吸蟲(chóng)病重點(diǎn)地區(qū)的重點(diǎn)水域開(kāi)展血吸蟲(chóng)監(jiān)測(cè)工作；涂永紅等[12]應(yīng)用哨鼠法在鄱陽(yáng)湖區(qū)進(jìn)行以傳染源控制為主的血吸蟲(chóng)病綜合防治工作。哨鼠法簡(jiǎn)單易學(xué)，可適用于不同環(huán)境水體的測(cè)定，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但是周期長(zhǎng)，通常需要1 個(gè)月左右，且存在哨鼠死亡或丟失的風(fēng)險(xiǎn)。

為減少在監(jiān)測(cè)過(guò)程中哨鼠死亡或丟失的情況，吳鋒等[13]設(shè)計(jì)制作了漂浮式哨鼠籠，其能隨水位自由升降同時(shí)保證小鼠與水面充分接觸。在多年的現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用中，該鼠籠因總回收率和哨鼠回收率高、成本低廉，已廣泛應(yīng)用于國(guó)家監(jiān)測(cè)點(diǎn)的疫水檢測(cè)。楊坤等[14]針對(duì)血吸蟲(chóng)尾蚴懸浮于水面不能主動(dòng)移位的特性，采用智能化技術(shù)，研發(fā)了一種運(yùn)動(dòng)式哨鼠血吸蟲(chóng)感染性水體檢測(cè)儀，以增加血吸蟲(chóng)尾蚴被檢測(cè)的概率。該設(shè)備能夠在水體中遙控航行，大幅增加哨鼠接觸血吸蟲(chóng)尾蚴的機(jī)會(huì)，使現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)時(shí)間由傳統(tǒng)方法的8 小時(shí)減少到1 小時(shí)，哨鼠感染率由15%增加到40%，哨鼠感染度（蟲(chóng)負(fù)荷）由0.25條/只增加到2.55 條/只，大幅提高了現(xiàn)場(chǎng)疫水檢測(cè)的效能，目前已在江蘇省沿江重點(diǎn)水域監(jiān)測(cè)預(yù)警體系中發(fā)揮重要作用[6]。

為解決檢測(cè)周期長(zhǎng)和尾蚴感染度低時(shí)解剖哨鼠查蟲(chóng)法可能存在漏檢的缺點(diǎn)，有研究者利用分子生物學(xué)方法來(lái)提高檢測(cè)效率和精度。張凡等[15]以SjR2為目的片段建立巢式PCR法，發(fā)現(xiàn)巢式PCR可以快速敏感地檢測(cè)出血吸蟲(chóng)尾蚴，在2013年的監(jiān)測(cè)工作中發(fā)現(xiàn)8個(gè)哨鼠監(jiān)測(cè)點(diǎn)中有2只小鼠血清巢式PCR擴(kuò)增陽(yáng)性，但在小鼠解剖時(shí)并未發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)體。王玠等[16]利用Western blot檢測(cè)哨鼠血清中Sj23HD抗體，可發(fā)現(xiàn)哨鼠早期感染，使哨鼠法的預(yù)警時(shí)間比解剖查蟲(chóng)法提前2～3周，從而提高哨鼠法的預(yù)警效能。上述方法在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)均取得了較好的效果，但尚未在現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)中推廣應(yīng)用。

2 黏附法

2.1 粘取法 此法是根據(jù)日本血吸蟲(chóng)尾蚴常停留在水體表面和易吸附在物體上的特性而設(shè)計(jì)。一般采用尼龍絹或卡普隆制作成長(zhǎng)條縫在竹竿上，展開(kāi)紗布在水面上粘觸；每粘觸8～10 m2水面后，卷起紗布放入甲醛中染色固定，鏡檢查蚴。粘取法由陳光裕等多次改進(jìn)后被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)中。陳光裕等[17-19]發(fā)現(xiàn)粘取法與水面尾蚴密度有一定關(guān)系，在實(shí)驗(yàn)中當(dāng)尾蚴密度超過(guò)34條/m2時(shí)，每次都能查到尾蚴；隨著尾蚴密度降低，尾蚴的檢出率隨之下降。隨著我國(guó)血吸蟲(chóng)病的控制，水體中尾蚴密度降低，目前粘取法很少應(yīng)用在現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)中。

2.2 C-6膜法 C-6膜是蔡士椿等[20]篩選的一種吸附力強(qiáng)的薄膜材料，可以吸附血吸蟲(chóng)尾蚴。在黏蚴后的C-6膜面上直接噴布CS16染液，可使尾蚴著染黃、藍(lán)雙色且體態(tài)完好率高，易于識(shí)別，故檢測(cè)結(jié)果較準(zhǔn)確。該法曾在20世紀(jì)90年代現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)中廣泛應(yīng)用。周云等[21]認(rèn)為C-6 膜法成本低，每次檢測(cè)費(fèi)用約為哨鼠法的1%，操作簡(jiǎn)單，鏡檢即可判斷。黃四喜等[22]分別采用C-6膜法和哨鼠法測(cè)定水體中日本血吸蟲(chóng)尾蚴，發(fā)現(xiàn)用C-6 膜獲取尾蚴陽(yáng)性率為1.73%（1/58），哨鼠法陽(yáng)性率2.83%（6/213），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；劉榆華等[23]現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)結(jié)果認(rèn)為在陽(yáng)性螺密度高的地區(qū)C-6 膜法和哨鼠法檢出效果無(wú)差異，但在陽(yáng)性螺密度低的地區(qū)C-6 膜法檢出率低于哨鼠法。在當(dāng)前低流行狀態(tài)下，傳統(tǒng)C-6 膜法收集尾蚴效果甚微。曲國(guó)立等[24]利用大豆油、異佛爾酮等試劑結(jié)合C-6膜、PE膜檢測(cè)方法來(lái)探索適用于湖區(qū)的快速敏感的疫水檢測(cè)技術(shù)，其結(jié)果表明利用擴(kuò)展劑可以提高C-6膜和PE膜收集尾蚴的效果，能快速檢出低密度的水體尾蚴。

2.3 網(wǎng)撈法 此法于1961 年由俞順章等介紹，網(wǎng)撈法一般使用細(xì)卡普隆紗布，制作尖底的漏頂形網(wǎng)袋（口徑和形式可根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)情況制定），用回形針臨時(shí)封閉底部[25]。在待檢測(cè)的水域范圍內(nèi)撈取若干次后，收集網(wǎng)袋利用染色劑鏡下觀察尾蚴。陽(yáng)桂芬等[26]使用C-6膜法和網(wǎng)撈法對(duì)東洞庭湖外洲部分水域進(jìn)行了檢測(cè)，在同一環(huán)境中網(wǎng)撈法查獲5條尾蚴，C-6膜法查獲1條，在后續(xù)的兩次實(shí)驗(yàn)中網(wǎng)撈法效果均優(yōu)于C-6膜法，兩種方法都能快速獲得檢測(cè)結(jié)果。

3 富集法

高艷春等[27]根據(jù)血吸蟲(chóng)尾蚴的生活習(xí)性和生理特點(diǎn)，設(shè)計(jì)機(jī)械裝置來(lái)收集尾蚴并對(duì)影響富集效率的各種技術(shù)參數(shù)進(jìn)行了研究。其研究結(jié)果表明，在潛水泵功率40 W、濾網(wǎng)目數(shù)為400目的情況下工作5 小時(shí)的尾蚴富集效果最好。該裝置操作簡(jiǎn)單，使用方便，并且可以檢測(cè)到活的尾蚴；但在尾蚴密度較低時(shí)，難以富集。

4 仿生膜法

以往的尾蚴收集方法多屬于被動(dòng)收集方式，而彭國(guó)華等[28]根據(jù)尾蚴趨向動(dòng)物皮脂的特性，研制仿生膜用以吸附尾蚴，同時(shí)結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)進(jìn)行尾蚴的快速檢測(cè)。其結(jié)果表明，利用豬皮為主要原料制成的仿生動(dòng)物皮膜采集器，在實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)均能檢測(cè)到血吸蟲(chóng)尾蚴，檢測(cè)效果與哨鼠法相近，但工作效率顯著高于哨鼠法。進(jìn)一步比較不同組成材料的動(dòng)物皮膜檢測(cè)效果，結(jié)果表明添加與未添加苯甲酸鈉的動(dòng)物皮膜檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩種膜與尾蚴對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，只要有尾蚴黏附在膜上均能有效檢出[29]。孫成松等[30]在安徽省對(duì)受洪澇災(zāi)害影響的血吸蟲(chóng)病高風(fēng)險(xiǎn)環(huán)境，分別使用了智能哨鼠疫水檢測(cè)儀和仿生皮膜水面尾蚴快速檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，在兩處環(huán)境中仿生膜檢測(cè)到尾蚴而哨鼠法卻未檢測(cè)到尾蚴，認(rèn)為仿生膜法在檢測(cè)敏感性和即時(shí)性等方面均優(yōu)于哨鼠法。

5 環(huán)境DNA（environmental DNA,eDNA）法

eDNA法是指從環(huán)境樣品（土壤、沉積物和水體等）中直接提取DNA片段后利用測(cè)序技術(shù)進(jìn)行定性或定量分析的方法，目前廣泛應(yīng)用于水生生物的檢測(cè)，是一種檢測(cè)速度快、特異性高的方法[31]。國(guó)外有研究[32]表明，eDNA 法可應(yīng)用于華支睪吸蟲(chóng)及其中間宿主魚(yú)類(lèi)的檢測(cè)。Alzaylaee等[33-34]在實(shí)驗(yàn)室通過(guò)eDNA法檢測(cè)含有曼氏血吸蟲(chóng)尾蚴的水體，發(fā)現(xiàn)eDNA 法可以準(zhǔn)確地檢測(cè)出曼氏血吸蟲(chóng)尾蚴；在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中，部分水樣也可檢測(cè)到尾蚴。Sato 等[35]應(yīng)用eDNA 法在馬達(dá)加斯加血吸蟲(chóng)病流行地區(qū)取樣檢測(cè)，在提取的水樣中檢測(cè)到曼氏血吸蟲(chóng)尾蚴。Fornillos 等[36]應(yīng)用eDNA 法在菲律賓血吸蟲(chóng)病流行區(qū)取樣檢測(cè)，可以檢測(cè)出血吸蟲(chóng)及其中間宿主的存在，但無(wú)法確定水中是否存在尾蚴，認(rèn)為eDNA法對(duì)于血吸蟲(chóng)病防治有著較好的應(yīng)用前景。

6 結(jié) 語(yǔ)

綜上，哨鼠法是目前現(xiàn)場(chǎng)工作較為常用的方法，缺點(diǎn)是時(shí)效性低，無(wú)法即時(shí)預(yù)警。C-6膜法結(jié)合擴(kuò)散劑在實(shí)驗(yàn)室中有良好的效果，但尚未在現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)中進(jìn)行效果評(píng)估，且使用的擴(kuò)散劑會(huì)造成一定程度的水體污染。尾蚴富集法雖操作簡(jiǎn)單方便，可以檢測(cè)到活體尾蚴，但在水體尾蚴密度低的情況下檢測(cè)效果不理想，還需進(jìn)一步優(yōu)化。仿生膜法檢測(cè)速度快但檢測(cè)過(guò)程相對(duì)復(fù)雜，不同材質(zhì)的仿生膜尾蚴收集效果存在差異。eDNA 法敏感性高、水樣采集便捷，但在血吸蟲(chóng)病防治中的實(shí)際應(yīng)用效果尚未有系統(tǒng)性的研究，且檢測(cè)費(fèi)用較高。

隨著我國(guó)消除血吸蟲(chóng)病進(jìn)程的推進(jìn)，血吸蟲(chóng)病流行區(qū)呈現(xiàn)低感染率和低感染度的態(tài)勢(shì)，這種低流行態(tài)勢(shì)對(duì)水體感染性監(jiān)測(cè)提出了更高要求，傳統(tǒng)檢測(cè)方法的敏感性已難以滿足防治需求。通過(guò)多學(xué)科交叉融合，利用分子生物學(xué)、計(jì)算機(jī)工程等先進(jìn)技術(shù)，研發(fā)敏感、特異、便捷且適宜現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用的血吸蟲(chóng)水體感染性檢測(cè)技術(shù)，探索適合當(dāng)前防治工作需要的血吸蟲(chóng)病監(jiān)測(cè)預(yù)警系統(tǒng)與監(jiān)測(cè)技術(shù)，提升我國(guó)血吸蟲(chóng)病監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的敏感性，是我國(guó)血吸蟲(chóng)病消除工作待解決的重大課題[37]。