車(chē)艷杰，康亞男，呂茂杰，李建麗

天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司，天津 300308

豬偽狂犬病是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一種以發(fā)熱、奇癢（豬除外）、腦脊髓炎為主的急性傳染病[1]。不同日齡豬均可感染發(fā)病，常引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎；15 日齡內(nèi)仔豬死亡率高達(dá)100%，表現(xiàn)出體溫突然升高、嘔吐、腹瀉、精神高度沉郁；成年豬感染率較低，不表現(xiàn)臨床癥狀或僅有輕微體溫升高[2-3]。據(jù)報(bào)道，2011 年開(kāi)始，我國(guó)出現(xiàn)了豬偽狂犬病病毒變異株，造成現(xiàn)有的商品化疫苗保護(hù)效力下降，并呈現(xiàn)一定范圍的流行和發(fā)病，引起嚴(yán)重的母豬繁殖障礙和初生乳豬死亡，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司研究院（以下簡(jiǎn)稱(chēng)瑞普生物研究院）從臨床發(fā)病豬只中分離到多株P(guān)RV 變異株，并篩選了1 株免疫原性?xún)?yōu)良的疫苗候選株（RP02 株）。本研究根據(jù)臨床需求和瑞普生物研究院前期基礎(chǔ)性研究，制備了3 種佐劑的變異株疫苗，并采用本動(dòng)物和非本動(dòng)物相結(jié)合的雙重安全評(píng)價(jià)法，評(píng)價(jià)3 種佐劑疫苗的安全性，以期為后續(xù)PRV 變異株滅活疫苗的研制提供數(shù)據(jù)支撐和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1）毒種與細(xì)胞。豬偽狂犬病毒變異株（RP02株）和ST 細(xì)胞，均由天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司研究院鑒定和保存。

2）佐劑。佐劑1 屬于水溶性載體類(lèi)，佐劑2 屬于研究院自主研制的水溶型，均由天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司制備和保存；佐劑3 屬于油乳劑W/O/W 型，購(gòu)于賽彼科公司。

3）試驗(yàn)動(dòng)物。4～5 周齡SPF 級(jí)BALB/c 小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。3～4 周齡仔豬（PRV 抗原、抗體雙陰性），購(gòu)自天津某養(yǎng)殖場(chǎng)。

4）其他材料。新生牛血清，購(gòu)自?xún)?nèi)蒙古金源康生物工程股份有限公司；胰酶和DMEM 購(gòu)自Gibco公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1）疫苗制備。將培養(yǎng)48 h 的ST 細(xì)胞，按培養(yǎng)體積1%比例接種豬偽狂犬病毒RP02 株，待細(xì)胞病變達(dá)到90%以上時(shí)收獲病毒液。反復(fù)凍融2 次后，經(jīng)膜包濃縮和分子篩純化后得到純化病毒液，再經(jīng)4%二乙烯亞胺（BEI）滅活，將滅活檢驗(yàn)合格病毒液分別按佐劑使用說(shuō)明配制3 種佐劑疫苗，備用。配苗時(shí)，滅活前抗原含量不低于108.5TCID50/mL。

2）病毒含量測(cè)定。將病毒液樣品用含2%新生牛血清的DMEM 培養(yǎng)液做10 倍系列稀釋?zhuān)?0-6、10-7、10-8、10-94 個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度分別接種生長(zhǎng)良好單層ST 細(xì)胞的96 孔細(xì)胞板，每個(gè)稀釋度6孔，100 μL/孔，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照6 孔，置37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中吸附1 h，而后每孔補(bǔ)加含2.0%新生牛血清的DMEM 維持液100 μL，置37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4～5 d，每天觀察并記錄細(xì)胞病變（CPE）孔數(shù)，根據(jù)每個(gè)稀釋度的病變細(xì)胞孔數(shù)，按Reed-Muench 方法計(jì)算TCID50。

3）滅活檢驗(yàn)。采用細(xì)胞法進(jìn)行滅活檢驗(yàn)。取滅活后的病毒液，10 倍稀釋后接種生長(zhǎng)良好單層BHK-21 細(xì)胞的6 孔細(xì)胞板，平行接種2 孔，每孔1.0 mL，置37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱吸附1 h，棄去液體，加入含2%新生牛血清的DMEM 培養(yǎng)液2.0 mL，同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照和正常細(xì)胞對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)含5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4～5 d，觀察細(xì)胞病變情況，判定病毒是否完全滅活。

4）疫苗檢驗(yàn)。制備疫苗按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》三部附錄進(jìn)行相關(guān)檢驗(yàn)，應(yīng)符合規(guī)定。

5）安全性評(píng)價(jià)。①小鼠安全性評(píng)價(jià)。選取4～5周齡BALB/c 小鼠40 只，隨機(jī)分成4 組，每組10只。第1～3 組分別接種3 種佐劑疫苗，背部皮下注射，接種2 次，間隔14 d，0.5 mL/次，第4 組為空白對(duì)照組。于首免后14 d 和二免后14 d，各組分別隨機(jī)抽取5 只小鼠剖檢，觀察注射部位及疫苗吸收情況。②仔豬安全性評(píng)價(jià)。選取3～4 周齡PRV 雙陰性豬只20 頭，隨機(jī)分成4 組，第1～3 組分別接種3 種佐劑疫苗，頸部肌肉注射，4.0 mL/頭，第4 組為空白對(duì)照組。連續(xù)觀察14 d，記錄試驗(yàn)豬只的精神狀態(tài)、采食、行為活動(dòng)；同時(shí)，從注射當(dāng)日連續(xù)測(cè)溫7 d，觀察試驗(yàn)豬只的體溫變化；14 d 后試驗(yàn)豬進(jìn)行剖檢，觀察注射部位及疫苗吸收情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原含量測(cè)定

將ST 細(xì)胞培養(yǎng)獲得30 L 病毒液（RP02 株），按Reed-Muench 方法測(cè)定和計(jì)算其TCID50，結(jié)果表明，培養(yǎng)毒液的病毒含量為109TCID50/mL，符合配苗標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.2 滅活檢驗(yàn)結(jié)果

采用細(xì)胞法驗(yàn)證滅檢效果，結(jié)果顯示，滅活病毒液檢驗(yàn)孔和正常細(xì)胞對(duì)照孔均無(wú)細(xì)胞病變，病毒陽(yáng)性對(duì)照孔出現(xiàn)融合、拉網(wǎng)、崩解等典型的細(xì)胞病變（圖1），結(jié)果表明，病毒液（RP02 株）已滅活完全，滅活工藝符合標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 PRV（RP02 株）病毒滅活前后細(xì)胞病變觀察

2.3 疫苗成品檢驗(yàn)

按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》三部附錄進(jìn)行3種佐劑疫苗相關(guān)檢驗(yàn)。結(jié)果表明，制備的3 種佐劑PRV 變異株疫苗均符合規(guī)定（表1）。

表1 疫苗檢驗(yàn)結(jié)果

2.4 安全性評(píng)價(jià)

1）小鼠安全性評(píng)價(jià)。從試驗(yàn)小鼠的精神狀態(tài)、注射局部炎癥和吸收程度3 個(gè)方面評(píng)價(jià)3 種佐劑疫苗對(duì)小鼠的安全性。3 組疫苗免疫2 次后，在觀察期內(nèi)，3 組免疫小鼠均行動(dòng)敏捷、精神狀態(tài)良好，未見(jiàn)被毛蓬亂、精神沉郁等眼觀不良現(xiàn)象（圖2）；首免后14 d 和二免后14 d，每組隨機(jī)取5 只小鼠觀察注射部位，3 組疫苗的注射部位均未見(jiàn)腫脹、起皰、結(jié)塊等不良現(xiàn)象；注射部位剖檢顯示，佐劑1 疫苗組和佐劑2 疫苗組均吸收良好，而佐劑3 疫苗組仍有少量肉眼可見(jiàn)的未吸收疫苗（圖3）。以上結(jié)果綜合表明，在安全性上，佐劑1 和佐劑2 無(wú)差異，均優(yōu)于佐劑3。

圖2 小鼠注射疫苗后精神狀態(tài)的眼觀結(jié)果

圖3 小鼠注射部位疫苗吸收情況觀察

2）仔豬安全性評(píng)價(jià)。從臨床整體觀察、注射局部炎癥反應(yīng)、吸收效果和體溫變化4 個(gè)方面評(píng)價(jià)疫苗對(duì)仔豬的安全性。疫苗免疫后在觀察期內(nèi)，3 組佐劑疫苗的試驗(yàn)豬只采食飲水均正常，精神狀態(tài)良好，均未見(jiàn)精神沉郁、免疫不良反應(yīng)等現(xiàn)象（表2）；注射部位也未見(jiàn)腫脹、硬結(jié)等局部不良炎癥反應(yīng)；疫苗吸收均良好，未見(jiàn)眼觀可見(jiàn)的吸收不良現(xiàn)象；在體溫方面，佐劑1 疫苗組和佐劑2 疫苗組均無(wú)明顯的體溫變化，但佐劑3 疫苗組，在免疫后1 d 出現(xiàn)一過(guò)性體溫升高現(xiàn)象，見(jiàn)圖4。以上結(jié)果綜合提示，在安全性上，佐劑1 和佐劑2 無(wú)差異，均優(yōu)于佐劑3。

表2 仔豬安全性評(píng)價(jià)結(jié)果

圖4 注射后體溫監(jiān)測(cè)結(jié)果

3 討 論

疫苗免疫仍是防控PRV 流行和危害的有效措施之一。隨著近些年P(guān)RV 變異株的出現(xiàn)，PRV 變異株滅活疫苗得到了臨床應(yīng)用，獲得了一定的臨床效果。開(kāi)發(fā)一種安全、高效的PRV 變異株滅活疫苗是當(dāng)務(wù)之急。

關(guān)于PRV 變異株滅活疫苗的研究與開(kāi)發(fā)，涉及PRV 變異毒株分離、鑒定、培養(yǎng)、免疫原性、滅活、佐劑等眾多方面，其中免疫佐劑在PRV 變異株滅活疫苗的安全性和有效性方面起關(guān)鍵性作用。目前，最常用的動(dòng)物用免疫佐劑可分為油乳劑類(lèi)和水溶性類(lèi)等，油乳劑類(lèi)又分為水包油型（W/O）、油包水型（O/W）、水包油包水型（W/O/W）；水溶性類(lèi)佐劑包括鋁鹽、聚合物、載體蛋白等載體類(lèi)。本研究在天津瑞普研究院前期PRV 變異毒株的分離、鑒定、培養(yǎng)等研究的基礎(chǔ)上，選擇具有代表性的油乳劑類(lèi)水包油包水型（W/O/W）、水溶性載體類(lèi)卡波姆佐劑以及自主開(kāi)發(fā)的水溶性佐劑，分別制備PRV 變異株滅活疫苗，并通過(guò)本動(dòng)物和非動(dòng)物開(kāi)展雙重安全性試驗(yàn)驗(yàn)證佐劑的安全性，旨在為開(kāi)發(fā)新型、安全、高效PRV變異株滅活疫苗提供數(shù)據(jù)支撐。

水性佐劑疫苗因免疫副反應(yīng)低、吸收速度快等特點(diǎn)逐漸受到臨床使用者的認(rèn)可。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在本動(dòng)物和非本動(dòng)物的安全性方面，水溶性佐劑無(wú)論是載體類(lèi)卡波姆佐劑還是自主研發(fā)的佐劑，均優(yōu)于油乳劑類(lèi)水包油包水型（W/O/W）。研究表明，卡波姆分子鏈相互共價(jià)交聯(lián)，構(gòu)成高分子聚合物，具有一定的緩釋作用[5]。其既能明顯刺激動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答，又能有效地激活體液免疫應(yīng)答，已在豬圓環(huán)病毒、豬支原體肺炎、豬塞內(nèi)卡病毒和禽流感疫苗研究中得到驗(yàn)證[6-9]。本研究結(jié)果可為后續(xù)基于卡波姆佐劑的疫苗研發(fā)提供技術(shù)參考。