朱 曦，李英俊，梅余霞，查 宇，王朝瑞，梁運(yùn)祥*

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2.湖北藍(lán)谷中微生物技術(shù)有限公司，湖北 宜昌 443100

丁酸梭狀芽孢桿菌（Clostridium butyricum），又名丁酸菌、宮入菌、酪酸菌，在自然界中多分布在腸道、酒窖、奶酪中。1933 年，由日本千葉醫(yī)科大學(xué)宮入近治博士首次發(fā)現(xiàn)[1]。丁酸梭菌屬于嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陽(yáng)性內(nèi)生芽孢桿菌，細(xì)胞直徑（0.6～1.2）μm×（3.0～7.0）μm；在梭菌增菌培養(yǎng)基（RCM）平板上和高層瓊脂柱內(nèi)菌落呈奶白色，邊緣不整齊；顯微視野中菌體呈桿狀或梭狀，多數(shù)單個(gè)，少數(shù)呈短鏈，部分菌株在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期菌體會(huì)呈現(xiàn)長(zhǎng)絲狀[2]。

近幾年來(lái)，丁酸梭菌作為微生態(tài)制劑被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料與養(yǎng)殖等領(lǐng)域[3]。2009 年7 月，原農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)了丁酸梭菌為新飼料添加劑[4]。丁酸梭菌作為微生態(tài)制劑飼料添加劑，具有較強(qiáng)的抗生素耐受性，對(duì)氨芐西林、強(qiáng)力霉素、甲硝唑等抗生素均不敏感，相對(duì)于乳酸菌、枯草芽孢桿菌等常規(guī)菌劑，與抗生素聯(lián)用時(shí)受限度較小[5]。因丁酸梭菌是腸道原生有益菌，作為口服的丁酸梭菌制劑較其他益生菌類更能適應(yīng)腸道生存環(huán)境，增強(qiáng)本菌株在腸道中的菌群優(yōu)勢(shì)；同時(shí)，其與雙歧桿菌、乳酸菌、糞腸球菌等有益菌不僅共生還可促進(jìn)增殖，維護(hù)腸道良性微生態(tài)平衡[6]；其產(chǎn)生的以丁酸、乙酸為主的短鏈脂肪酸可抑制有害菌，大量動(dòng)物試驗(yàn)和人體臨床試驗(yàn)表明，丁酸不僅可以修復(fù)腸道黏膜，還是腸道上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的直接能量來(lái)源，促進(jìn)腸道絨毛發(fā)育，增強(qiáng)腸道對(duì)有害物質(zhì)的屏障能力，常用于治療腸道疾病[7]，在抑制動(dòng)物腹瀉、提高動(dòng)物免疫力等方面具有積極的效果。丁酸梭菌產(chǎn)生的胞外活性酶如淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等，可幫助機(jī)體分解多糖、纖維素、脂肪、蛋白質(zhì)等，利于機(jī)體消化吸收[8]。雖然丁酸梭菌是嚴(yán)格厭氧菌，因其是產(chǎn)芽孢桿菌，芽孢不僅具有耐熱、耐胃酸、膽酸還耐氧，使其具有一定的抗逆性，便于工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)、運(yùn)輸、保存和在常規(guī)環(huán)境下使用。

自丁酸梭菌被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，國(guó)內(nèi)外很多生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域的學(xué)者對(duì)丁酸梭菌進(jìn)行了深入的研究，重點(diǎn)在菌株分離鑒定及其應(yīng)用機(jī)理，而在丁酸梭菌規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)工藝及菌數(shù)檢測(cè)等方面的基礎(chǔ)研究還不夠深入，生產(chǎn)發(fā)酵水平偏低。目前在國(guó)內(nèi)，1 t 以上的發(fā)酵罐產(chǎn)出的發(fā)酵液芽孢數(shù)普遍只在2×108～109CFU/mL。少數(shù)企業(yè)在后處理時(shí)經(jīng)離心濃縮、噴霧干燥后有效活菌數(shù)才能達(dá)到1×1010CFU/g，市場(chǎng)上現(xiàn)有的丁酸梭菌相關(guān)產(chǎn)品普遍存在有效活菌數(shù)低、貨架期短、價(jià)格偏貴等問題[9]。隨著相關(guān)專業(yè)人員和普通大眾“減抗、禁抗”意識(shí)的增強(qiáng)及對(duì)益生菌劑認(rèn)知的提高，現(xiàn)有的生產(chǎn)發(fā)酵水平已難以滿足食品、醫(yī)藥、養(yǎng)殖及飼料加工等行業(yè)對(duì)丁酸梭菌需求量大、有效活菌數(shù)高、貨架期長(zhǎng)且價(jià)格低廉等要求，嚴(yán)重制約了丁酸梭菌的推廣和應(yīng)用，各生產(chǎn)和使用廠家急切需要解決發(fā)酵工藝中的限制問題，突破現(xiàn)有發(fā)酵水平，降低發(fā)酵成本。本試驗(yàn)通過探究丁酸梭菌的營(yíng)養(yǎng)條件及其發(fā)酵工藝優(yōu)化，以期能在實(shí)際生產(chǎn)及應(yīng)用等方面提供解決思路和策略，實(shí)現(xiàn)丁酸梭菌的高密度發(fā)酵，從而大幅度提高有效活菌數(shù)和芽孢轉(zhuǎn)化率及降低規(guī)?；a(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 菌種來(lái)源

丁酸梭狀芽孢桿菌C.butyricumMY-Z，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)儀器

DL-CJ-2ND1 潔凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；顯微鏡GC-8860 氣相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；GI54DWS 型高壓滅菌鍋；AOE INSTRUMENTS UV-1500 分光光度計(jì)；P70D20TLD4 格蘭仕微波爐；UPR-II-5/10T 超純水儀；C22-IH960D 蘇泊爾電磁爐。

1.3 培養(yǎng)基

梭菌增殖培養(yǎng)基（RCM 培養(yǎng)基）：酵母粉3 g，牛肉浸膏10 g，胰蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，可溶性淀粉1 g，氯化鈉5 g，三水合乙酸鈉3 g，半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g，0.5%美藍(lán)0.2 mL，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 至7.0±0.2。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、牛肉粉10.0 g、可溶性淀粉2.0 g、K2HPO41.05 g、MgSO4·7H2O 1.21 g、NaCl 0.3 g、CaCO31.5 g、MnSO4·H2O 0.012 g、促生長(zhǎng)因子0.2 g、蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 至7.0±0.2。

計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：梭菌增殖培養(yǎng)基（RCM 培養(yǎng)基）加0.4%～0.8%的瓊脂，分裝試管，上封液體石蠟，制成高層半固體培養(yǎng)基。

計(jì)數(shù)稀釋液：0.85%的生理鹽水加0.03%的吐溫80。

上述培養(yǎng)基均115 ℃滅菌30 min。

1.4 培養(yǎng)方法

1）種子活化及培養(yǎng)方法：取超低溫保存的甘油管菌種100 μL，接種到含有15 mL 的已除氧溶化冷卻至40 ℃的RCM 半固體培養(yǎng)基的試管中，培養(yǎng)基表面覆蓋高2～3 cm 液體石蠟以隔絕空氣，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)12～18 h。再取此菌液100 μL 接種到已除氧RCM 培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期作為種子液備用。

2）丁酸梭菌發(fā)酵培養(yǎng)：采用液體深層靜止培養(yǎng)，250 mL 試劑瓶，裝液量150 mL，表面覆蓋高2～3 cm 液體石蠟以隔絕氧氣，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)24 h 后計(jì)數(shù)。

1.5 檢測(cè)方法

1）丁酸梭菌芽孢計(jì)數(shù)方法（試管高層半固體瓊脂法）。取菌液于80 ℃水浴加熱10 min，取經(jīng)處理后的待測(cè)菌液10 mL 加到90 mL 去氧液封稀釋液內(nèi)，并用移液管攪打均勻，不形成氣泡，制成1∶10 的均勻稀釋液，取此菌懸液1 mL 注入到9 mL 去氧液封稀釋液內(nèi)，同上，制成1∶100 均勻稀釋液，按上述操作依次進(jìn)行10 倍遞增稀釋，選擇1～3 個(gè)合適的稀釋度，取1 mL 注入到10～15 mL 已除氧高層半固體培養(yǎng)基內(nèi)，每個(gè)梯度做3 管平行，置（36±1）℃培養(yǎng)16～24 h，計(jì)數(shù)。

2）還原糖的檢測(cè)方法。采用3，5 二硝基水楊酸法（DNS 法）。

3）氣相色譜測(cè)定丁酸產(chǎn)量。取發(fā)酵液10 mL，用50%硫酸和乙醚提取丁酸，以丁酸標(biāo)準(zhǔn)品為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行氣相色譜儀測(cè)定。色譜條件：柱流量為1 mL/min，F(xiàn)ID 檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度為250 ℃，進(jìn)樣量為1 μL；升溫程序如下：60 ℃保持4 min，以6 ℃/min 的速度升溫至180 ℃，再以20 ℃/min 的速度升溫至200 ℃，保持5 min。

1.6 單因素試驗(yàn)

1）最佳接種量及初始pH 的確定。分別以1%、2%、3%、4%、5%、10%的接種量接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，另將基礎(chǔ)培養(yǎng)基初始pH 分別用0.5 mol/L 的鹽酸溶液和飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)制成pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，其他培養(yǎng)條件不變，以確定最佳接種量及初始pH。

2）碳源的篩選。分別以1.0%的量添加紅糖、糖蜜、甘油、麩皮、玉米粉、可溶性淀粉、乙酸鈉等原料替換初始培養(yǎng)基中的碳源，其他營(yíng)養(yǎng)組分不變，以初始培養(yǎng)基為對(duì)照，探究不同碳源對(duì)丁酸梭菌增菌的影響。3%的接種量，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，取樣測(cè)定菌落數(shù)。

3）優(yōu)勢(shì)碳源添加量的確定。篩選出優(yōu)勢(shì)碳源后，再分別以2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、5.0%的量替代初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，以確定最佳添加量。接種量及培養(yǎng)方法同1.6 2）。

4）氮源的篩選。在1.6 3）的基礎(chǔ)上，分別以2.0%的肽、玉米漿、魚粉、花生粕、酵母粉、豆粕、酶解羽毛粉、硫酸銨等量替代初始發(fā)酵培養(yǎng)基中胰蛋白胨和蛋白胨2 種主要的氮源，考察不同的氮源對(duì)丁酸梭菌增菌的影響，接種量及培養(yǎng)方法同1.6 2）。

5）最佳氮源添加量的篩選。在1.6 4）的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)采用增菌明顯的酵母粉、肽粉和魚粉分別以2.5%、3.0%、4.0%、5.0%的量替代初始培養(yǎng)基中的胰蛋白胨和蛋白胨，以確定最佳添加量，接種量及培養(yǎng)方法同1.6 2）。

1.7 發(fā)酵工藝的研究

以下試驗(yàn)培養(yǎng)基均以2.5%的葡萄糖、3.5%魚粉和0.5%的酵母粉，其他營(yíng)養(yǎng)成分與比例同初始培養(yǎng)基。

1）發(fā)酵過程中間歇調(diào)控pH 對(duì)增菌的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，三角瓶發(fā)酵靜置培養(yǎng)至10 h，10、15 h 時(shí)分別用濃度為20%的NaOH 溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH 至6.0，并檢測(cè)葡萄糖，接種量及培養(yǎng)方法同1.6 2）。

2）在發(fā)酵過程中補(bǔ)料對(duì)增菌的影響。本試驗(yàn)在1.7 1）的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)至10、15 h 時(shí)分別按1.0%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、5.0%的量向發(fā)酵液中補(bǔ)充初始培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)液，接種量及培養(yǎng)方法同本文1.6 2）。

3）發(fā)酵過程中在線控制pH 并補(bǔ)料對(duì)增菌的影響。50 L 自控發(fā)酵罐，配制優(yōu)化后的培養(yǎng)基，裝液系數(shù)60%，上覆2～3 cm 厚的液體石蠟或連續(xù)通入氮?dú)庖员ＷC相對(duì)厭氧環(huán)境，低速攪拌，接種量3%，培養(yǎng)溫度37 ℃，培養(yǎng)至10 h 開始變量流加補(bǔ)充培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)液，總流加量為5%，同時(shí)用中和劑維持培養(yǎng)液pH 在6.0。發(fā)酵過程中分時(shí)段取樣檢測(cè)葡萄糖、丁酸及芽孢數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同的接種量和初始pH 值對(duì)菌數(shù)的影響

從圖1 可以看出，接種量為3%的發(fā)酵液生物量最高，隨著接種量的增加，生物量略有下降。分析原因：由于接種量大，生長(zhǎng)速率快，營(yíng)養(yǎng)消耗快，且接種量過大，種液中的代謝物特別是酸性物質(zhì)降低了培養(yǎng)基的初始pH 值，縮短了菌體的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期。由此可見，在實(shí)際應(yīng)用中并不是接種量越大越好，應(yīng)根據(jù)實(shí)際的試驗(yàn)和生產(chǎn)情況確定相應(yīng)的接種量。另外，在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)接種量越小，相對(duì)啟動(dòng)耗時(shí)越長(zhǎng)，接種量越大，發(fā)酵啟動(dòng)越快，接種量為10%的發(fā)酵液?jiǎn)?dòng)時(shí)間比1%組提前了約1.5 h，接種量過低啟動(dòng)時(shí)間過長(zhǎng)，增加了動(dòng)力消耗和發(fā)酵液污染的風(fēng)險(xiǎn)。本研究后面試驗(yàn)均采用3%的接種量。

圖1 不同的接種量對(duì)菌落數(shù)的影響

由圖2 可知，初始pH 為5.5 時(shí)，丁酸梭菌的啟動(dòng)很慢，生長(zhǎng)很弱，隨著pH 值的升高菌數(shù)增加，pH值為6.0 時(shí)菌數(shù)最高，pH 6.5 時(shí)菌數(shù)略低，2 組差異不明顯。此后，隨著pH 升高，菌數(shù)開始下降，由此表明初始pH 在偏酸范圍內(nèi)較好。后面試驗(yàn)確定初始pH 值為6.0。

圖2 不同的初始pH 值對(duì)菌落數(shù)的影響

2.2 不同碳源篩選

碳源是微生物培養(yǎng)基的主要營(yíng)養(yǎng)成分，為微生物的生長(zhǎng)繁殖、構(gòu)成菌體細(xì)胞和代謝活動(dòng)提供能源。丁酸梭菌可以利用多種碳源，包括單糖和多糖。本試驗(yàn)所選的8 種碳源中包括單糖、多糖及乙酸鈉。由圖3 可知，葡萄糖作為碳源時(shí)芽孢數(shù)最高，達(dá)到0.98×108CFU/mL，明顯高于其他碳源組（P>0.05），因此優(yōu)選葡萄糖作為本次后續(xù)試驗(yàn)碳源。紅糖和糖蜜僅次于葡萄糖，從原料來(lái)源和生產(chǎn)成本考慮，建議在工業(yè)化生產(chǎn)中選這2 種作為主要碳源。

圖3 不同碳源對(duì)丁酸梭菌菌落數(shù)的影響

2.3 最佳碳源添加量的確定

微生物在生長(zhǎng)過程中對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求有一定的限量范圍，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過低或過高都會(huì)對(duì)菌體的生長(zhǎng)造成很大的影響，因此確定適當(dāng)?shù)牧?，?duì)微生物生長(zhǎng)尤為重要。本試驗(yàn)在確定最佳碳源的基礎(chǔ)上，優(yōu)化其最佳添加量，結(jié)果見圖4。從圖4 可以看出，葡萄糖添加量為3.0%的發(fā)酵液菌數(shù)最高，達(dá)到2.33×108CFU/mL，明顯高于1.0%組，與2.5%組差異不顯著，與4.0%、5.0%組差異顯著。由表1 可知，發(fā)酵結(jié)束后1.0%、2.0%組的培養(yǎng)液所含還原糖分別為0.18%和0.23%，表明糖幾乎消耗殆盡，2.5%添加量的培養(yǎng)液內(nèi)還原糖為0.48%，3.0%及以上各組培養(yǎng)液里還原糖均高于2.5%組，5.0%組還原糖值最高，達(dá)到了2.21%。隨著糖量的增加，培養(yǎng)液還原糖值越高，培養(yǎng)基內(nèi)的殘?zhí)窃蕉?，并且從發(fā)酵液的pH值可以看出，所添加的糖并沒有被利用轉(zhuǎn)化，由此確定葡萄糖的最適添加量為2.5%。

圖4 優(yōu)勢(shì)碳源不同添加量對(duì)丁酸梭菌菌落數(shù)的影響

表1 各組發(fā)酵液中還原糖及pH 的檢測(cè)結(jié)果

2.4 優(yōu)勢(shì)氮源添加量的確定

氮是構(gòu)成生命重要物質(zhì)蛋白質(zhì)和核酸等的主要元素，與碳源相同，氮源也是微生物的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，通常分為有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源。本試驗(yàn)以市場(chǎng)上常見的包含有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮的8 種氮源，以部分替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中原有氮源的方式，考查不同氮源對(duì)丁酸梭菌生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見圖5。其中，肽粉、魚粉和酵母粉3 組間菌數(shù)差異不顯著，但優(yōu)于對(duì)照組，且顯著高于其他氮源。

圖5 不同氮源對(duì)丁酸梭菌菌落數(shù)的影響

本試驗(yàn)選擇菌落數(shù)相對(duì)較高的酵母粉、魚粉和肽粉作為優(yōu)勢(shì)氮源，在一定范圍內(nèi)以確定最佳添加量，結(jié)果見圖6，酵母粉在2.5%時(shí)菌數(shù)為3.12×108CFU/mL。肽粉和魚粉分別在3%菌數(shù)最高，分別達(dá)到2.95×108、3.05×108CFU/mL。各組添加比例間菌落數(shù)沒有隨著添加量的增加而顯著提升，且各組最高菌數(shù)間差異不顯著。3 種優(yōu)勢(shì)氮源中，酵母粉不僅是微生物生長(zhǎng)的優(yōu)質(zhì)氮源，還含有多種生長(zhǎng)因子，但價(jià)格相對(duì)來(lái)說(shuō)要高出很多。在發(fā)酵生產(chǎn)中，為保證營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)多采用復(fù)合氮源的方式。因此，本試驗(yàn)確定酵母粉為0.5%與3.0%的肽粉或3.0%的魚粉組合成復(fù)合氮源。

圖6 3 種優(yōu)勢(shì)氮源不同的添加量對(duì)丁酸梭菌菌落數(shù)的影響

2.5 發(fā)酵過程中間歇調(diào)控pH 對(duì)增菌的影響

1.6 1)試驗(yàn)結(jié)果顯示，初始pH 在5.5 時(shí)菌體生長(zhǎng)緩慢，表明過低的pH 值對(duì)丁酸梭菌生長(zhǎng)會(huì)形成抑制。1.6 3)試驗(yàn)結(jié)果可知，發(fā)酵結(jié)束時(shí)培養(yǎng)液的pH 值顯示為4.7 左右，且除1.0%組外，其他各組培養(yǎng)液內(nèi)均有不等量的殘留葡萄糖，表明菌體可能是由于受到酸性代謝物的抑制，糖沒有被完全利用。為了解除酸抑制，本試驗(yàn)在培養(yǎng)至10 h 和培養(yǎng)至10、15 h 分別調(diào)節(jié)pH 至6.0，培養(yǎng)結(jié)果見圖7。由圖7 可知，在培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)pH 可以明顯提高丁酸梭菌的生物量，在10 h 和10、15 h 分別調(diào)節(jié)pH 至6.0 的試驗(yàn)組菌落數(shù)比對(duì)照組分別提高了21.02%和39.66%。檢測(cè)培養(yǎng)液內(nèi)剩余葡萄糖，由表2 可知，1次補(bǔ)堿組剩余葡萄糖為0.31%、2 次補(bǔ)堿組剩余葡萄糖為0.06%。經(jīng)2 次補(bǔ)堿后，葡萄糖基本被利用完全。表明解除酸抑制，不僅延長(zhǎng)了菌體的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，還可提高糖的利用率，同時(shí)也大幅度提高了生物量。

圖7 不同補(bǔ)堿次數(shù)對(duì)丁酸梭菌菌落數(shù)的影響

表2 間歇控酸發(fā)酵液殘?zhí)橇繖z測(cè)結(jié)果

2.6 發(fā)酵過程中補(bǔ)料對(duì)增菌的影響

從1.7 1)試驗(yàn)可知解除酸抑制后，培養(yǎng)液里的糖基本利用完全，培養(yǎng)基內(nèi)的碳量偏低，表明對(duì)數(shù)期菌體生長(zhǎng)快，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗也快，可能會(huì)造成后期發(fā)酵動(dòng)力不足。本試驗(yàn)通過培養(yǎng)至10、15 h 在2 次補(bǔ)堿的同時(shí)分別按總量為1%、2%、3%、5%補(bǔ)充初始培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)液，結(jié)果見圖8。2%的補(bǔ)料量菌數(shù)最高，但與1%組差異不顯著。3%、5%補(bǔ)料組的菌落數(shù)沒升反而有所下降，可能是因菌體生長(zhǎng)快，產(chǎn)酸量大，調(diào)節(jié)酸堿的間隔時(shí)間過長(zhǎng)，發(fā)酵液的營(yíng)養(yǎng)過于豐富，影響了轉(zhuǎn)孢率。由于本試驗(yàn)所用的檢測(cè)方法為丁酸梭菌芽孢計(jì)數(shù)法，所計(jì)菌數(shù)實(shí)際為芽孢數(shù)，使得菌數(shù)低于前2 組。試驗(yàn)結(jié)果表明，適量的補(bǔ)料可為菌體持續(xù)性的生長(zhǎng)繁殖提供充足的動(dòng)力，延長(zhǎng)對(duì)數(shù)期。

圖8 梯度補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)液對(duì)丁酸梭菌菌落數(shù)的影響

2.7 發(fā)酵過程中在線控制pH 并補(bǔ)料對(duì)增菌的影響

由圖9 和表3 可知，隨著發(fā)酵的啟動(dòng)，在發(fā)酵至10 h 測(cè)得發(fā)酵液中葡萄糖的含量為0.18%，而發(fā)酵液中的丁酸含量呈持續(xù)性增加。補(bǔ)料泵開啟后，菌數(shù)保持快速生長(zhǎng)的狀態(tài)，發(fā)酵至24 h 左右丁酸的含量增加緩慢，此時(shí)停止補(bǔ)料，此后菌落數(shù)仍然在增長(zhǎng)，表明發(fā)酵液中菌體萌發(fā)芽孢，此后芽孢大量的形成和成熟，發(fā)酵至32 h，菌落數(shù)為2.28×109CFU/mL，鏡檢發(fā)酵液芽孢率已達(dá)90%以上。

圖9 發(fā)酵罐中丁酸含量與丁酸梭菌生長(zhǎng)之間的關(guān)系

表3 補(bǔ)料前發(fā)液中葡萄糖的含量

3 討 論

本試驗(yàn)通過優(yōu)化調(diào)整培養(yǎng)基中主要碳、氮源，對(duì)常見的8 種碳源和氮源篩選比較，確定葡萄糖為最佳碳源，這與杜孟思等[11]、戚薇等[12]及耿正穎[13]的研究結(jié)果相一致。在試驗(yàn)結(jié)果中可見紅糖、糖蜜的菌落數(shù)與葡萄糖的差異不大，糖蜜為制糖下角料，相對(duì)于葡萄糖價(jià)格低廉，在規(guī)?；a(chǎn)中因量大原料成本間的差異突出顯現(xiàn)，可考慮采用糖蜜作為唯一碳源或補(bǔ)充碳源。氮源的篩選結(jié)果是酵母粉為最佳氮源，其次是魚粉和肽粉，二者差異不顯著，與夏會(huì)麗等[14]研究結(jié)果大致相同（酵母粉為最佳氮源）。與目前丁酸梭菌常用的牛肉粉和各種蛋白胨及戚薇等[15]采用水解3 h 的豆粕作為最佳氮源不同的是，本試驗(yàn)選擇魚粉和肽粉作為備選原料，主要是考慮到牛肉粉和胰蛋白胨價(jià)格昂貴，水解豆粕工藝相對(duì)復(fù)雜，對(duì)于生產(chǎn)丁酸梭菌的廠家來(lái)說(shuō)自己處理比較繁瑣，市場(chǎng)來(lái)源相對(duì)較少。且目前由于本菌發(fā)酵水平和后期處理工藝不成熟，利潤(rùn)空間有限，生產(chǎn)廠家急需相對(duì)廉價(jià)且易得的生產(chǎn)原料。本試驗(yàn)考慮到魚粉是飼料行業(yè)常用原料，不僅含優(yōu)質(zhì)蛋白還含有豐富的維生素及礦物質(zhì)元素；而肽粉是近些年來(lái)飼料行業(yè)新興原料，富含小分子物質(zhì)，宜于機(jī)體吸收利用，廣泛用于飼料及食品行業(yè)，生產(chǎn)工藝成熟，市場(chǎng)來(lái)源廣泛，易于采購(gòu)且質(zhì)量有保障。試驗(yàn)結(jié)果表明，酵母粉、魚粉、肽粉3 種優(yōu)勢(shì)氮源可完全替代常用的牛肉粉和胰蛋白胨。經(jīng)優(yōu)化，2.5%葡萄糖和復(fù)合氮源（3.0%肽粉與0.5%酵母粉或3.0%魚粉與0.5%酵母粉）、無(wú)機(jī)鹽及其他組分同初始培養(yǎng)基，為最佳營(yíng)養(yǎng)條件，初始pH 6.0，接種量3%，在此條件下三角瓶靜置培養(yǎng)芽孢數(shù)可達(dá)3.35×108CFU/mL。

在1.6 3）的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體代謝產(chǎn)生的如丁酸、乙酸、乳酸等有機(jī)酸的積累[16]，發(fā)酵液的pH 快速降低并對(duì)菌體的生長(zhǎng)形成抑制，出現(xiàn)“酸脅迫”現(xiàn)象，菌體生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期只有短短的3～5 h。1.7 1）試驗(yàn)采用在發(fā)酵過程中補(bǔ)堿來(lái)解除“酸脅迫”。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，1 次補(bǔ)堿可延長(zhǎng)生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期1～3 h，培養(yǎng)液中葡萄糖的量明顯降低，二次調(diào)節(jié)后培養(yǎng)液中所剩葡萄糖的量微乎其微。本試驗(yàn)在調(diào)節(jié)pH 時(shí)沒有采用鄒孟琳等[17]使用飽和碳酸氫鈉溶液作為中和劑，而是用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% NaOH 溶液作為中和劑，避免了在發(fā)酵過程中由于本菌產(chǎn)酸量高，需消耗的碳酸氫鈉溶液的量大，不僅稀釋了培養(yǎng)基，還使得發(fā)酵液的終體積大幅增加，影響發(fā)酵器具的初裝量。

通過1.7 1）試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在間隔2 次調(diào)pH 試驗(yàn)過程中，對(duì)數(shù)期的丁酸梭菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)需求量比較大，初始糖很快消耗殆盡，遠(yuǎn)不能滿足菌體快速生長(zhǎng)的需要，菌體生長(zhǎng)過程中出現(xiàn)“碳饑餓”。1.7 2）試驗(yàn)通過一定量的補(bǔ)料延長(zhǎng)了菌體生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，大幅度提高了生物量。

在50 L 發(fā)酵罐發(fā)酵過程中，由于可在線調(diào)控恒定發(fā)酵液的酸堿度，菌體處于持續(xù)性良好的生長(zhǎng)環(huán)境，生長(zhǎng)繁殖速度快，培養(yǎng)基內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)消耗相應(yīng)也快，在發(fā)酵10 h 左右取樣檢測(cè)培養(yǎng)基里葡萄糖的量已不到0.2%，這說(shuō)明從發(fā)酵10 h 開始，發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)已不能滿足丁酸梭菌快速生長(zhǎng)的需要，這與夏會(huì)麗等[14]研究的發(fā)酵至12 h 檢測(cè)發(fā)酵液中的糖近乎為0 的結(jié)果相近。由于丁酸梭菌存在“碳溢流”現(xiàn)象[18]，并且高濃度培養(yǎng)基的高滲透壓會(huì)給菌體細(xì)胞膜帶來(lái)壓力和損傷，為避免此類影響，發(fā)酵初始培養(yǎng)基通常只提供基本生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)。為了提高生物量，在菌體快速生長(zhǎng)時(shí)期需要增補(bǔ)充足的營(yíng)養(yǎng)。本試驗(yàn)在發(fā)酵過程中及時(shí)進(jìn)行在線連續(xù)補(bǔ)料，不僅使菌體在快速生長(zhǎng)時(shí)得到充足的營(yíng)養(yǎng)，延長(zhǎng)菌體生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，還可以避免因營(yíng)養(yǎng)不足出現(xiàn)菌體因“饑餓”而急速衰亡。培養(yǎng)至28 h，芽孢數(shù)為2.12×109CFU/mL，取樣鏡檢芽孢率達(dá)90%以上，4 h 后測(cè)得發(fā)酵液菌數(shù)達(dá)2.28×109CFU/mL，再延時(shí)培養(yǎng)至36 h，菌落數(shù)并沒有顯著增加，芽孢數(shù)趨于平穩(wěn)，由此建議在實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)酵至32 h 即可下罐。

4 結(jié) 論

通過單因素試驗(yàn)，得到優(yōu)化的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件：葡萄糖25 g/L、酵母粉5 g/L、肽粉30 g/L 或（酵母粉5 g/L、魚粉30 g/L）、K2HPO41.05 g/L、MgSO4·7H2O 1.21 g/L、NaCL 0.3 g/L、CaCO31.5 g/L、MnSO4·H2O 0.012 g/L、促生長(zhǎng)因子0.2 g/L，接種量3%，37 ℃培養(yǎng)30～36 h，發(fā)酵過程中在線恒定pH為6.0，并在發(fā)酵10 h 左右進(jìn)行培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)液總量為5.0%的連續(xù)補(bǔ)料。丁酸梭菌MY-Z 在此發(fā)酵工藝條件下，芽孢數(shù)可達(dá)2.28×109CFU/mL。