劉玉才，韓 勇

1.山東省日照市五蓮縣動物疫病預(yù)防控制中心，山東 五蓮 262300；

2.山東省日照市動物疫病預(yù)防控制中心，山東日照 276800

目前，報道對禽有致病性的支原體有28 種，其中危害最嚴重的有3 種，即雞毒支原體、雞滑液支原體和火雞支原體[1]。其中，雞毒支原體和雞滑液支原體的感染最為嚴重，直接危害我國養(yǎng)禽業(yè)。

雞毒支原體（Mycoplasma gallisepticum，MG）又稱雞敗血支原體[2]，是引起雞慢性呼吸道病的病原菌。MG 定殖雞的呼吸道后，導(dǎo)致呼吸道上皮細胞纖毛活動減弱或停滯，引起雞群繼發(fā)大腸桿菌感染或雞新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒感染，引起嚴重的并發(fā)癥，使雞群死亡率增高，給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[3]?；耗抑гw感染又稱為傳染性滑膜炎、傳染性滑液囊炎、滑液囊支原體感染[4]，是由禽滑液囊支原體（Mycoplasma synoviae，MS）引起禽類的一種急性或慢性亞臨床型疾病。MS 在雞群中普遍存在，感染后大多呈隱性經(jīng)過，但容易與禽呼腸孤病毒、禽流感病毒、新城疫病毒等病原體混合感染[5]，導(dǎo)致病雞出現(xiàn)嚴重的免疫抑制、生長發(fā)育遲緩等現(xiàn)象，造成產(chǎn)蛋量、孵化率和飼料轉(zhuǎn)化率降低，對養(yǎng)雞業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失[6]。

MG 和MS 均主要感染雞和火雞，MG 和MS 感染后都有呼吸道癥狀，且MG 有時也可導(dǎo)致雛雞關(guān)節(jié)炎而出現(xiàn)跛行，2 種病原存在混合感染[7]，給臨床確診造成困難。MG 和MS 既可以水平傳播，也可以垂直傳播，給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的危害和經(jīng)濟損失。日照市家禽種業(yè)既有日照麻雞優(yōu)良地方品種，又有白羽肉雞等引進品種。2017—2021 年選擇4個種雞場連續(xù)開展雞支原體流行病學(xué)調(diào)查，掌握種雞場支原體的流行狀況，為凈化雞支原體提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 抽檢方法

群內(nèi)采用流行病學(xué)抽樣方式，實驗室檢測考慮檢測方法的敏感性，即檢測到陽性動物，按照中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心設(shè)計Epi Sampling Calculator 軟件，以估計流行率的抽樣方法進行抽樣監(jiān)測[8]，抽樣樣本量計算公式[8]為：

其中n為抽樣個數(shù)，CL 為置信水平，D為群中的陽性動物數(shù)（等于群內(nèi)個體數(shù)與預(yù)定流行率的乘積），N為群內(nèi)個體數(shù)，Se 為檢測方法的敏感性。

原種場按照置信水平95%，預(yù)期流行率0.5%，每次采樣不少于200 份。祖代場按照置信水平95%，預(yù)期流行率2%，每次采樣不少于100 份。父母代場按照置信水平95%，預(yù)期流行率4%，每次采樣不少于60 份。樣品來源于每個種雞場不少于4 棟雞舍的雞只，種公雞、開產(chǎn)母雞和后備雞要兼顧一定比例。每只雞采集血清、鼻腔拭子、蛋清，編號一一對應(yīng)。

2017—2021 年，4 個雞場采集血清420 份、拭子420 份進行檢測，樣品采集情況見表1。

表1 日照市種雞場采樣情況

1.2 樣品采樣和處理方法

1）血清。用促凝血管采集全血2 mL，室溫靜置30 min 以上，待析出血清后，3 000 r/min 離心3～5 min，取出0.5 mL 血清置于1.5 mL 離心管內(nèi)，并做好編號。

2）棉拭子。將1.0～1.2 mL PBS 緩沖液滴入1.5 mL 離心管，將棉簽插入口腔、鼻腔內(nèi)部，來回旋轉(zhuǎn)3～4 下，將沾取黏液的棉棒放入離心管內(nèi)，棉簽頭折斷將離心管蓋上，離心管中靜置過夜，浸出液上清進行試驗，采集口腔和鼻腔雙拭子，將拭子放置1 個離心管內(nèi)，每只雞采集的棉拭子和血清一一對應(yīng)。

1.3 檢測試劑與儀器

雞毒支原體抗體ELISA 試劑盒、雞滑液囊支原體抗體ELISA 試劑盒購自荷蘭百測公司，雞支原體熒光PCR 試劑盒購自北京世紀元亨公司。生物安全柜購自新西蘭公司，超純水純化系統(tǒng)（Cascada）購自美國PALL 公司，移液器購自Eppendorf 公司，核酸提取儀購自西安天隆公司、實時熒光PCR 儀購自美國ABI 公司、酶標儀購自美國MD 公司，離心機購自Sigma 公司。

1.4 實驗室檢測方法

采集的鼻腔和口腔雙拭子提取病毒核酸，采用熒光定量PCR 方法，檢測支原體病原。采集的血清進行MG、MS 抗體ELISA 試驗，檢測MG、MS 抗體陽性率。

2 結(jié)果與分析

2.1 監(jiān)測總體情況

2017—2021 年，對4 個種雞場開展連續(xù)監(jiān)測，共檢測血清樣品420 份、拭子樣品420 份。調(diào)查結(jié)果顯示，經(jīng)過多年的監(jiān)測凈化，全市雞支原體總體感染率呈明顯下降趨勢，但部分祖代和父母代雞場陽性率仍較高，仍需繼續(xù)堅持凈化。

2.2 不同年份雞白痢檢測情況

對2017—2021 年監(jiān)測數(shù)據(jù)進行分析，2017—2021 年全市檢測場（點）20 個（次），檢測樣品2 100份/次，雞支原體個體陽性率和群體陽性率總體呈下降趨勢（表2）。

表2 2017—2021 年雞支原體個體、群體陽性率 %

2.3 日照麻雞和白羽肉雞感染情況

對全市的4 個場多年連續(xù)檢測顯示，日照市種雞場支原體感染率較高，尤其日照麻雞這一地方品種雞支原體的群體陽性率和個體陽性率均較高，日照市凈化任務(wù)依然艱巨。

3 討 論

1）目前，國內(nèi)雞群MG、MS 感染嚴重，給養(yǎng)雞場帶來嚴重的經(jīng)濟損失。朱小甫等[9]對63 份組織樣品、12 份關(guān)節(jié)樣品和260 份喉頭棉拭子樣品進行PCR 檢測，組織和喉頭棉拭子樣品MG 陽性率為7.8%。MS 在組織、關(guān)節(jié)和喉頭棉拭子樣品中均有檢出，陽性率為31.3%。MG 和MS 雙陽性率為17.0%。支原體除了可以水平傳播外，還可以垂直傳播[10-11]，其中，垂直傳播方式隨著種群繁育會造成病原擴散、危害擴大的繼代效應(yīng)。因此，從源頭種禽場開展凈化顯得尤為重要。2017—2021 年調(diào)查結(jié)果顯示，日照市1 個原種雞場經(jīng)過凈化，已經(jīng)檢測不出雞支原體。全市雞支原體總體感染率呈明顯下降趨勢，但個別祖代和父母代雞場陽性率仍較高，仍需繼續(xù)堅持凈化，凈化任務(wù)依然艱巨。

養(yǎng)雞場要從具有《種畜禽生產(chǎn)經(jīng)營許可證》的種禽場引種，國外引進種禽和種蛋應(yīng)符合相關(guān)規(guī)定，優(yōu)先從獲得農(nóng)業(yè)農(nóng)村部凈化評估認證的種禽場引種。對引進的禽要做好抽檢，由具備資質(zhì)的第三方實驗室出具檢測報告。禽場所用種蛋、后備種雞和引入種雞應(yīng)進行檢測，確認開展凈化的特定病種為陰性。對引入種雞尤其應(yīng)實行嚴格的隔離檢測，一般在獨立的隔離舍隔離40 d 以上，確保臨床健康、凈化病種感染陰性后，經(jīng)徹底消毒方可進入生產(chǎn)線。

2）為了解雞支原體感染情況，科學(xué)抽樣很關(guān)鍵。本研究采用流行病學(xué)方式進行群內(nèi)抽樣，采樣科學(xué)，一定程度上能反映支原體的感染狀況。但由于時間緊、物力緊張等原因，僅選取了4 個種雞場進行監(jiān)測，數(shù)量相對較少，所以陽性感染率需要擴大抽樣群體進行監(jiān)測。另外，由于原種場陽性率較低，僅采樣200份，數(shù)量相對較少，不能最大限度反映感染情況。

3）從本次的持續(xù)監(jiān)測來看，日照麻雞這一優(yōu)良地方品種在日照市雖然進行了很好的保種，但雞支原體防控措施不到位，導(dǎo)致日照麻雞的感染率仍較高。另外，檢測結(jié)果顯示日照市白羽肉雞支原體感染率也較高。因此，下一步要把支原體作為禽場凈化的主要病種加以重視。

2015 年以來，日照市在全市大力開展種雞場主要垂直傳播疫病凈化工作，制定適合的凈化方案，開展雞支原體、禽白血病、雞白痢等垂直傳播疫病凈化關(guān)鍵技術(shù)研究。經(jīng)過多年的監(jiān)測凈化，雞支原體等疫病的群體陽性率和個體陽性率不斷下降，凈化成效明顯。下一步要繼續(xù)加大凈化力度，推動雞支原體從源頭上得到凈化。