李 英，韓 勇

1.山東省日照市五蓮縣叩官畜牧獸醫(yī)站，山東 日照 262300；2.山東省日照市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山東 日照 276800

牛結(jié)核?。╞ovine tuberculosis）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium bovis）引起的一種人畜共患病，在世界各國(guó)均有發(fā)生。在世界動(dòng)物衛(wèi)生組織的疫病名錄中，牛結(jié)核病被列為B 類動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病。牛結(jié)核病的流行對(duì)養(yǎng)殖業(yè)及民眾健康都會(huì)造成嚴(yán)重的危害[1]，威脅到畜產(chǎn)品質(zhì)量安全和公共衛(wèi)生安全。

2021 年8 月2 日，山東畜牧獸醫(yī)局印發(fā)《山東省重點(diǎn)動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)凈化工作方案（2021 版）》，要求推進(jìn)全省重點(diǎn)動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)凈化，提高規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)管理水平和疫病防控能力，推動(dòng)動(dòng)物疫病防控從穩(wěn)定控制到凈化消滅轉(zhuǎn)變。2021 年10 月7 日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部下發(fā)《關(guān)于推進(jìn)動(dòng)物疫病凈化的意見(jiàn)》，要求推進(jìn)動(dòng)物疫病凈化工作，力爭(zhēng)通過(guò)5 年時(shí)間，在全國(guó)建立一批高水平的凈化場(chǎng)。2022 年3 月，山東省印發(fā)《山東省動(dòng)物疫病凈化場(chǎng)評(píng)估技術(shù)規(guī)范》，要求推進(jìn)牛結(jié)核病等疫病凈化工作。

為做好牛結(jié)核病監(jiān)測(cè)凈化工作，2015 年以來(lái)，日照市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心開(kāi)展牛結(jié)核病凈化關(guān)鍵技術(shù)研究，對(duì)牛結(jié)核檢測(cè)方法進(jìn)行研究。目前，牛場(chǎng)結(jié)核病的監(jiān)測(cè)凈化主要采用皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)，該方法雖然經(jīng)典，但操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，結(jié)果判定受人為因素影響較大。目前，體外γ-干擾素的檢測(cè)方法已被澳大利亞、新西蘭和歐美等國(guó)家批準(zhǔn)為正式試驗(yàn)方法，并且為OIE 推薦的方法[2]。本試驗(yàn)采用γ-干擾素ELISA 方法，對(duì)全市26 個(gè)牛場(chǎng)780 份樣品進(jìn)行檢測(cè)，了解日照市牛場(chǎng)結(jié)核病的流行狀況，旨在為凈化牛結(jié)核病提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品及抽檢方法

依托膠東半島口蹄疫無(wú)疫區(qū)和山東省無(wú)疫省建設(shè)，在全市的牛場(chǎng)進(jìn)行摸底調(diào)查，對(duì)全市的牛場(chǎng)建立抽樣框。根據(jù)建立的抽樣框，在抽樣框中隨機(jī)抽樣。采用流行病學(xué)抽樣方式，由于采用實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)要考慮檢測(cè)方法的敏感性，即檢測(cè)到陽(yáng)性動(dòng)物，按照中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心設(shè)計(jì)Epi Sampling Calculator 軟件，以估計(jì)流行率的抽樣方法進(jìn)行抽樣監(jiān)測(cè)，抽樣樣本量計(jì)算公式[3]為：

其中n為抽樣個(gè)數(shù)，CL 為置信水平，D為群中的陽(yáng)性動(dòng)物數(shù)（等于群內(nèi)個(gè)體數(shù)與預(yù)定流行率的乘積），N為群內(nèi)個(gè)體數(shù)，Se 為檢測(cè)方法的敏感性。

按照置信水平95%，預(yù)期流行率10%，每場(chǎng)每次采樣不少于30 份。2019—2021 年，在日照市4 個(gè)區(qū)（縣）分別采集26 個(gè)牛場(chǎng)樣品進(jìn)行試驗(yàn)。樣品采集情況見(jiàn)表1。

表1 日照市牛場(chǎng)采樣情況

1.2 檢測(cè)試劑與儀器

牛結(jié)核γ-干擾素ELISA 試劑盒購(gòu)自科前生物公司，生物安全柜購(gòu)自新西蘭公司，超純水純化系統(tǒng)（Cascada）由美國(guó)PALL 生產(chǎn)，移液器由Eppendorf 生產(chǎn)，5430R 冷凍高速離心機(jī)由 Eppendorf 公司生產(chǎn)，GO 酶標(biāo)儀由Thermo 公司生產(chǎn)。

1.3 樣品前處理

1）采血。無(wú)菌采集牛全血5 mL，肝素鈉抗凝，室溫條件下24 h 內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行刺激培養(yǎng)。培養(yǎng)試驗(yàn)開(kāi)始前準(zhǔn)備無(wú)菌清潔的2 mL 平底離心管和無(wú)菌PBS。

2）血液分裝。分裝前應(yīng)將裝有抗凝血的采血管上下輕輕顛倒5～10 次，充分混勻血液樣本。將每份抗凝血加入3 個(gè)2 mL 離心管中，1 mL/管。

3）結(jié)核菌素工作液配制。按每個(gè)樣本所需100 μL結(jié)核菌素工作液（臨用前按無(wú)菌操作配制），將刺激抗原對(duì)照按無(wú)菌操作各取100 μL 依次加入3 支離心管中。蓋嚴(yán)，輕輕搖動(dòng)離心管，使血液與刺激抗原或PBS 充分混合，置37 ℃培養(yǎng)16～20 h，獲得2 種抗原刺激的血液培養(yǎng)上清和PBS 血液培養(yǎng)上清，如果上清不足100 μL，可2 000 r/min 離心5 min。

4）樣本貯存。如果不立即檢測(cè)上述血液培養(yǎng)上清，可收集后低溫保存，檢測(cè)時(shí)先將樣本恢復(fù)至室溫。上清在2～8 ℃可保存7 d，在-20 ℃以下可保存3 個(gè)月。

1.4 檢測(cè)方法

1）取出牛結(jié)核試劑盒抗原包被板，平衡至室溫（根據(jù)樣本多少，可拆開(kāi)分次使用），按樣本布局表加入刺激后的血液培養(yǎng)上清樣本，100 μL/孔；同時(shí)，設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照各2 孔（陰陽(yáng)性對(duì)照不稀釋），100 μL/孔，置37 ℃溫育45 min。

2）甩掉板孔中的液體，每孔加入稀釋好的洗滌液300 μL，無(wú)需靜置，甩掉板孔中的洗滌液，重復(fù)洗滌共計(jì)3 次，最后1 次在吸水材料上拍干。

3）每孔加入兔抗牛r-干擾素多克隆抗體100 μL，置37 ℃溫育30 min。

4）洗板3 次，每孔加入酶標(biāo)記物 100 μL，置37 ℃溫育30 min。

5）洗板5 次，每孔先加入底物液A 50 μL，再加入底物液B 50 μL，混勻，置室溫（20～25 ℃）避光顯色10 min。

6）每孔加入終止液50 μL，10 min 內(nèi)在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔D630nm值。

7）陽(yáng)性對(duì)照D630nm平均值≥1.0，陰性對(duì)照D630nm平均值＜0.3 試驗(yàn)成立。判定標(biāo)PD 血液培養(yǎng)上清孔D630nm值記作DbpD，PPD 血液培養(yǎng)上清孔D630nm值記作ODapp，PBS 血液培養(yǎng)上清孔D630nm值記作ODpbs，計(jì)算ODbppD、ODappd 及ODpbs 之間的差值。ODpp-ODpbs20.2 且ODbpD-ODappd≥0.2 判為牛結(jié)核病陽(yáng)性，其他情形均判為牛結(jié)核病陰性。

2 結(jié)果與分析

2019-2021 年，對(duì)全市26 個(gè)牛場(chǎng)點(diǎn)開(kāi)展監(jiān)測(cè)，共檢測(cè)樣品780 份。其中，2019 年和2020 年抽檢牛場(chǎng)各8 個(gè)，2021 年抽檢牛場(chǎng)10 個(gè)，均未檢測(cè)出陽(yáng)性場(chǎng)和樣品（表2）。

表2 2019—2021 年全市規(guī)模牛場(chǎng)結(jié)核檢測(cè)情況

3 討 論

1）采用流行病學(xué)調(diào)查抽樣軟件進(jìn)行抽樣，在抽樣框中先對(duì)場(chǎng)群隨機(jī)進(jìn)行抽樣，群體確定后再根據(jù)流行病學(xué)方式進(jìn)行群內(nèi)采樣。由于采樣科學(xué)，一定程度上能反映日照市牛結(jié)核的感染狀況。

本試驗(yàn)應(yīng)用流行病學(xué)調(diào)查抽樣軟件進(jìn)行抽樣，按照置信水平95%，預(yù)期流行率10%，每場(chǎng)每次采樣不少于30 份，檢測(cè)結(jié)果顯示樣品均為陰性，未發(fā)現(xiàn)日照市規(guī)模牛場(chǎng)結(jié)核病感染情況。對(duì)場(chǎng)群采樣由于時(shí)間、物力等原因，采集場(chǎng)數(shù)量較少，僅采集了26個(gè)，不能最大限度地反映感染情況。另外，由于牛結(jié)核病陽(yáng)性率較低，僅采樣30 份，數(shù)量相對(duì)較少，下一步監(jiān)測(cè)可加大采樣數(shù)量，盡可能最大限度地反映牛群感染情況。

2）本試驗(yàn)采用γ-干擾素ELISA，要嚴(yán)格按照要求，采集牛全血，對(duì)于樣品的前處理嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書，采樣后要在24 h 內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室對(duì)收集后當(dāng)天進(jìn)行檢測(cè)的標(biāo)本，儲(chǔ)存在4 ℃?zhèn)溆茫缬刑厥庠蛐枰芷谑占瘶?biāo)本，將標(biāo)本及時(shí)分裝后放在-20 ℃或-70 ℃條件下保存，避免反復(fù)凍融。標(biāo)本2～8 ℃可保存48 h，部分標(biāo)本需添加抑肽酶。

3）準(zhǔn)確診斷感染牛結(jié)核分枝桿菌的動(dòng)物對(duì)牛結(jié)核病的控制和進(jìn)化起至關(guān)重要的作用[4]。國(guó)內(nèi)外牛結(jié)核病的檢疫方法很多，目前臨床上應(yīng)用最廣的是牛結(jié)核變態(tài)反應(yīng)。然而很多學(xué)者認(rèn)為反復(fù)檢疫、重癥結(jié)核病牛、體質(zhì)低下等原因，均使變態(tài)反應(yīng)不能檢出結(jié)核病牛，而ELISA 方法能克服這一缺點(diǎn)[5-6]。γ-干擾素ELISA 檢測(cè)方法比其他檢測(cè)方法有更高的靈敏度和更快速的重復(fù)檢測(cè)能力，研究表明，γ-干擾素ELISA 檢測(cè)的敏感性范圍為73%～100%，特異性范圍為85.0%～99.6%[7]。本試驗(yàn)采用γ-干擾素ELISA檢測(cè)方法，對(duì)全市26 個(gè)牛場(chǎng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，凈化效果顯著，說(shuō)明該方法可靠，可進(jìn)一步進(jìn)行推廣。

4）牛結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種重要的人畜共患病，威脅畜牧業(yè)的發(fā)展和人類的健康[8]。規(guī)模牛場(chǎng)是疫病凈化的實(shí)施主體和實(shí)際受益者，應(yīng)主動(dòng)開(kāi)展牛結(jié)核病等人畜共患病監(jiān)測(cè)凈化。規(guī)模牛場(chǎng)要按照國(guó)家制定的凈化政策要求，加強(qiáng)防疫軟硬件建設(shè)，加強(qiáng)生物安全防護(hù)水平，配齊相應(yīng)的人力、物力、財(cái)力。結(jié)合本場(chǎng)實(shí)際，制定自場(chǎng)的凈化方案，開(kāi)展凈化工作。要按照基線調(diào)查、監(jiān)測(cè)凈化的路線，采取檢測(cè)、陽(yáng)性奶牛淘汰清群、無(wú)害化處理等措施。要健全生物安全防護(hù)設(shè)施設(shè)備、加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、嚴(yán)格消毒、規(guī)范無(wú)害化處理。養(yǎng)牛場(chǎng)優(yōu)先從有《種畜禽生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)許可證》的牛場(chǎng)引種，國(guó)外引進(jìn)種牛和胚胎應(yīng)符合相關(guān)規(guī)定，優(yōu)先從獲得農(nóng)業(yè)農(nóng)村部?jī)艋u(píng)估認(rèn)證的牛場(chǎng)引種。對(duì)引進(jìn)的牛只要做好抽檢，由具備資質(zhì)的第三方實(shí)驗(yàn)室出具檢測(cè)報(bào)告。牛場(chǎng)所用精液和胚胎應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，確認(rèn)開(kāi)展凈化的特定病種為陰性。對(duì)引入牛只尤其應(yīng)實(shí)行嚴(yán)格的隔離檢測(cè)，一般在獨(dú)立的隔離舍隔離40 d 以上，確保臨床健康、凈化病種感染陰性后，經(jīng)徹底消毒方可進(jìn)入生產(chǎn)區(qū)。

2015 年起，日照市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心在全市大力開(kāi)展規(guī)模牛場(chǎng)“兩病”凈化工作，制定適合的凈化方案，對(duì)凈化關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行研究。經(jīng)過(guò)多年的監(jiān)測(cè)凈化，全市多年未檢測(cè)出牛結(jié)核陽(yáng)性牛，防控成效顯著。目前，全市已有2 家奶牛場(chǎng)通過(guò)省級(jí)結(jié)核凈化場(chǎng)。下一步要繼續(xù)加大監(jiān)測(cè)凈化力度，做好牛結(jié)核監(jiān)測(cè)凈化工作。