佟延南， 肖 蕊， 郭忠寶， 李志鴻， 韓麗娜， 趙光軍， 朱 海， 李忠琴

(1.海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院，海南?？?570203； 2.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建廈門 361021； 3.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西南寧 530021)

羅非魚原產(chǎn)于非洲，是世界上最重要的淡水養(yǎng)殖品種，養(yǎng)殖范圍已涉及全世界100多個國家和地區(qū)，并被評為未來動物蛋白質(zhì)的主要提供品種之一[1]，經(jīng)過數(shù)十年發(fā)展，我國已成為世界羅非魚第一生產(chǎn)國和出口國，每年羅非魚產(chǎn)量以8.38%速度遞增[2-3]。近年，羅非魚爆發(fā)性疾病不斷發(fā)生，尤其是羅非魚鏈球菌病，該病發(fā)病率達(dá)20%～80%，死亡率達(dá)90%以上，直接經(jīng)濟(jì)損失20億元[4-5]。感染鏈球菌可導(dǎo)致羅非魚出現(xiàn)腸道癥狀，如腸道內(nèi)出現(xiàn)黃色黏液、腸胃空透易破裂，進(jìn)而影響胃腸道的消化功能，導(dǎo)致羅非魚生長緩慢，嚴(yán)重的還會導(dǎo)致死亡[6-7]。目前，防控羅非魚鏈球菌病的藥物仍以抗生素藥物為主，然而該類藥物存在藥物殘留、病原耐藥性和環(huán)境污染等問題，對羅非魚產(chǎn)品質(zhì)量安全和人類健康造成危害[8]。因此，研究中草藥等天然藥物、開發(fā)安全高效綠色新藥是必然趨勢，也是提高羅非魚的免疫力、促進(jìn)生長的重要環(huán)節(jié)。

本試驗選取的中草藥——板藍(lán)根具有清熱解毒、抗癌和提高免疫力等功能[9]，比對投喂板藍(lán)根復(fù)方藥的羅非魚與不投藥羅非魚生長指標(biāo)，腸道中淀粉酶、脂肪酶數(shù)據(jù)，血清與肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶與谷丙轉(zhuǎn)氨酶的數(shù)據(jù)，分析板藍(lán)根復(fù)方藥添加在飼料中對羅非魚的安全性，為防治無乳鏈球菌引起的羅非魚鏈球菌病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用板藍(lán)根復(fù)方(15 g/袋)由廣西萬壽堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號國藥準(zhǔn)字Z45022145?；A(chǔ)餌料采購于百洋集團(tuán)羅非魚402號顆粒飼料，該飼料含30.0%粗蛋白、3.0%粗脂肪、10.0%粗纖維、13.0%粗灰分、12.0%水分、1.4%賴氨酸、0.5%～2.5%鈣、0.6%～2.0%總磷和0.3%～1.5%氯化鈉；試驗組基礎(chǔ)餌料中分別添加了5%、10%、15%、30%的水提板藍(lán)根復(fù)方，噴灑均勻，備用。本試驗選用平均體質(zhì)量100 g的羅非魚，購自廈門蠻宗魚苗場，為吉富羅非魚。

淀粉酶(AMS)測試盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT/GPT)測試盒、糜蛋白酶測試盒、脂肪酶(LPS)測試盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST/GOT)測試盒、Bradford蛋白濃度測定試劑盒，均在南京建成生物工程研究所購買。主要儀器設(shè)備包括全自動樣品快速研磨儀、小型高速離心機(jī)、電熱恒溫水浴鍋、生化培養(yǎng)箱、全波長酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性試驗 試驗開始前15 d將試驗魚養(yǎng)殖在水產(chǎn)學(xué)院養(yǎng)殖基地塑料桶(體積為1 m3)中，自來水經(jīng)曝氣后作為養(yǎng)殖水養(yǎng)殖試驗魚。由表1可知，篩選規(guī)格一致的羅非魚100 尾，分為對照組、5%試驗組、10%試驗組、15%試驗組和30%試驗組，每組20尾魚，對照組試驗魚投喂未處理的基礎(chǔ)飼料。試驗期間，每天投喂2次，早、晚各1次，每天按試驗魚魚體質(zhì)量的2%進(jìn)行投喂。同時，根據(jù)每天攝食情況進(jìn)行適當(dāng)增減，避免殘餌污染養(yǎng)殖水體；水溫控制在(28±2) ℃，24 h曝氣增氧，每天換水1次并清除糞便和殘餌，每天對試驗魚臨床癥狀進(jìn)行觀察，及時記錄死亡情況。試驗持續(xù)7 d，7 d后測定羅非魚質(zhì)量增加率和特定生長率。

表1 急性毒性試驗分組

1.2.2 羅非魚28 d喂養(yǎng)試驗 選擇5%劑量濃度的板藍(lán)根復(fù)方為試驗組，不添加中草藥復(fù)方為對照組，每組飼喂46尾羅非魚，暫養(yǎng)7 d后開始試驗，投喂2次/d，投喂的飼料量是魚體質(zhì)量的2%，連續(xù)喂養(yǎng)28 d，每7 d采樣1次，每次采集6尾，兩兩混樣，分析養(yǎng)殖羅非魚的生長情況、血液生化指標(biāo)、肝臟指標(biāo)及腸道各消化酶生化指標(biāo)，進(jìn)而判斷板藍(lán)根復(fù)方中草藥對羅非魚養(yǎng)殖的影響。

1.2.3 樣品采集 試驗結(jié)束采樣前24 h停喂試驗魚，各組進(jìn)行稱量計數(shù)、計算質(zhì)量增加率。每組隨機(jī)抽取6尾魚，測量體質(zhì)量、體長后用于抽血，檢測脂肪酶、淀粉酶等各項指標(biāo)。另外剪取試驗魚(6尾)的前腸1.0 cm，去除腸容物，兩兩混樣，用于消化酶的測定。解剖并摘取0.5 cm3肝臟，兩兩混樣，用于肝臟轉(zhuǎn)氨酶測定。

尾靜脈取血，每尾取1 mL，兩兩混樣，置于4 ℃冰箱靜釋4 h后，使用離心機(jī)離心，轉(zhuǎn)速為 3 500 r/min，時間10 min，分離出血清后在-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，作為血清生化指?biāo)和各種酶的測定。

1.2.4 生長性能指標(biāo)的測定 參照文獻(xiàn)[10]的方法對吉富羅非魚生長性能進(jìn)行測定。

質(zhì)量增加率=(終末體質(zhì)量 - 初始體質(zhì)量)/初始體質(zhì)量×100%；

特定生長率=(ln試驗魚末質(zhì)量-ln試驗魚初質(zhì)量)/養(yǎng)殖天數(shù)×100%；

餌料系數(shù)=總投餌量/魚總增質(zhì)量。

1.2.5 血清與肝臟轉(zhuǎn)氨酶的測定 主要對血清與肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行含量測定，根據(jù)購買的相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.2.6 腸道生化指標(biāo)的測定 進(jìn)行腸道糜蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性檢測，根據(jù)購買的相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.3 試驗時間、地點

試驗于2019年在集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性試驗結(jié)果

首先，選取濃度為5%、10%、15%、30% 4個梯度的板藍(lán)根濃度進(jìn)行預(yù)試驗，觀察進(jìn)食情況。由表2可知，高濃度的板藍(lán)根復(fù)方因氣味濃郁等原因，影響羅非魚的進(jìn)食。選取5%、10%、15% 這3個濃度梯度的板藍(lán)根濃度繼續(xù)進(jìn)行急性毒性試驗。

表2 添加不同濃度板藍(lán)根復(fù)方飼料羅非魚進(jìn)食情況

由表3可知，5%組和10%組隨添加濃度的提高，質(zhì)量增加率、特定生長率均有所提高，其中，5%試驗組的特定生長率和質(zhì)量增加率顯著高于對照組、10%試驗組和對照組的組間特定生長率和質(zhì)量增加率差異不顯著、15%試驗組的特定生長率和質(zhì)量增加率顯著低于其他各組(P<0.05)。其中，5%試驗組飼料系數(shù)極顯著低于對照組、10%試驗組和15%試驗組(P<0.01)，但對照組和10%試驗組組間飼料系數(shù)差異不顯著。同時，急性毒性試驗后，羅非魚成活率5%組的最高，成活率可達(dá)82.71%，10%組成活率次之，可達(dá)77.18%，其次分別是15%組和對照組，成活率分別為57.12%和42.86%。

2.2 板藍(lán)根復(fù)方飼喂28 d對羅非魚生長代謝的影響

表3 不同濃度板藍(lán)根復(fù)方飼料對羅非魚質(zhì)量增加率、特定生長率及餌料系數(shù)的影響

知，投喂板藍(lán)根復(fù)方的試驗組質(zhì)量增加率和特定生長率均高于對照組，但在14 d前，與對照組無明顯差異；21 d質(zhì)量增加率和特定生長率達(dá)最大值，與對照組差異顯著(P<0.05)；28 d較21 d時質(zhì)量增加率和特定生長率均有所下降，但與對照組仍差異顯著(P<0.05)，說明在投喂板藍(lán)根復(fù)方時，應(yīng)注意投喂期限，根據(jù)試驗結(jié)果建議每次連續(xù)投喂21 d后，停止投喂。由圖3可知，試驗組的餌料系數(shù)隨喂養(yǎng)時間逐漸下降，21 d時下降效果最明顯，28 d時餌料系數(shù)又有所升高，表明5%濃度的板藍(lán)根復(fù)方在養(yǎng)殖21 d增質(zhì)量最多且飼料轉(zhuǎn)化率最大，效果最佳；28 d后效果開始下降。

2.2.2 對羅非魚腸道消化酶的影響 由圖4可知，試驗組羅非魚腸道的脂肪酶相比對照組，試驗組在14 d有顯著差異(P<0.05)，從21 d開始試驗組與對照組無明顯差別，說明在飼料中添加5%板藍(lán)根復(fù)方可在喂養(yǎng)14 d內(nèi)提高羅非魚腸道脂肪酶的活力。由圖5可知，在養(yǎng)殖28 d內(nèi)，羅非魚腸道淀粉酶活力在試驗組與對照組間差異顯著，其中，7 d板藍(lán)根復(fù)方試驗組的淀粉酶活性略高于對照組，而14～28 d板藍(lán)根復(fù)方試驗組對比對照組淀粉酶活力略有減少，板藍(lán)根試驗組淀粉酶活力整體上隨飼養(yǎng)時間增加而降低。說明飼料中添5%板藍(lán)根復(fù)方在短期內(nèi)對于提高羅非魚腸道淀粉酶活力良好。

2.2.3 對羅非魚血清轉(zhuǎn)氨酶活力的影響 由圖6可知，試驗組羅非魚血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量從14 d開始，比對照組均有下降，且在14、21 d時效果顯著(P<0.05)，說明5%濃度的板藍(lán)根復(fù)方具保護(hù)肝臟的能力在14 d開始發(fā)揮，并在21 d有更顯著提高(P<0.05)。由圖7可知，試驗28 d內(nèi)羅非魚血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶含量變化均有顯著差異(P<0.05)，板藍(lán)根試驗組谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量在14 d與21 d有顯著下降(P<0.05)，但在28 d時又顯著升高(P<0.05)。

2.2.4 對羅非魚肝臟指標(biāo)的影響 由圖8、圖9和表4可知，相比對照組，試驗組羅非魚肝臟中谷丙轉(zhuǎn)氨酶與谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量整體均降低，且28 d表現(xiàn)差異顯著(P<0.05)，表明5%濃度板藍(lán)根具有高效保護(hù)肝臟的功能。隨飼養(yǎng)時間推移，羅非魚的肝質(zhì)量比數(shù)值在增高，試驗組與對照組均有升高趨勢，但試驗組與對照組間差異不顯著。

3 討論

羅非魚自引進(jìn)我國后，經(jīng)過遺傳選育，現(xiàn)已擁有品質(zhì)優(yōu)良、餌料系數(shù)低、生長快的品系[11]。羅非魚2015年的產(chǎn)量已達(dá)我國水產(chǎn)品總產(chǎn)量的1/10以上，出口量已達(dá)到我國水產(chǎn)品出口量的1/5，在我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中地位十分重要。隨著羅非魚養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，降低餌料系數(shù)、增強(qiáng)免疫力的研究日趨熱門[12]。

中草藥作為純天然藥物，是含有抗病毒、抗菌、抗應(yīng)激、增強(qiáng)食欲和增強(qiáng)免疫等多重功效的活性化合物，具有價格低、殘留少、毒副作用小、易于代謝消除等特點， 這些均是化學(xué)藥品無法比擬的。且中草藥既可以直接作用于動物體補(bǔ)給營養(yǎng)，促進(jìn)機(jī)體新陳代謝；又可以補(bǔ)充營養(yǎng)成分添加到飼料中[13-15]。中草藥在現(xiàn)代水產(chǎn)病害防控中具有廣泛發(fā)展前景，有研究結(jié)果顯示，發(fā)酵中草藥在現(xiàn)代水產(chǎn)中具有明顯應(yīng)用優(yōu)勢[16]，中草藥作為添加劑可提高水產(chǎn)品生長性能，減少水質(zhì)的化學(xué)污染[17-18]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，大黃、穿心蓮、板藍(lán)根和金銀花常用于魚病防治[19]；在羅非魚人工配合飼料中添加金銀花、黃芩等多種中草藥，可提高幼魚的生長性能[20]；牙鲆使用以金銀花為主要成分的復(fù)方中草藥后血清中溶菌酶的活力得到提高，顯著增強(qiáng)了免疫效果[21]?？傊?，中草藥具有來源豐富、對水質(zhì)污染小等優(yōu)點，且連翹、黃連、黃芪對于動物體質(zhì)的增強(qiáng)作用早已有論證[22]。

表4 不同飼養(yǎng)天數(shù)羅非魚肝臟質(zhì)量和體質(zhì)量的比值

中藥復(fù)方作為飼料添加劑，具有改善生長性能、提高肉質(zhì)及食品安全性等優(yōu)點，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用已較為廣泛。單味中藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的研究，主要集中在生長免疫相關(guān)領(lǐng)域。生長性能、飼料利用率是評價水產(chǎn)養(yǎng)殖效果的重要標(biāo)準(zhǔn)，對養(yǎng)殖規(guī)模及經(jīng)濟(jì)效益有直接影響。已有大量研究結(jié)果表明，在基礎(chǔ)飼料中添加天然藥物制劑可促進(jìn)動物生長發(fā)育[23]，同時可提高機(jī)體提高抗病能力[24]。然而，將板藍(lán)根復(fù)方應(yīng)用于魚類飼料的研究報道尚未出現(xiàn)。

單味中藥在用于提高牙鲆、吉富羅非魚的生長率、免疫功能的研究很多，黃芪、連翹、板藍(lán)根等在水產(chǎn)飼料添加劑領(lǐng)域的研究已有不少成果[25]。將板藍(lán)根復(fù)方應(yīng)用于飼料添加劑的研究成果已有不少，吳志新等的研究結(jié)果顯示，板藍(lán)根、大黃和金銀花的復(fù)方制劑對銀鯽的免疫功能有促進(jìn)作用[26]。有研究結(jié)果表明，以甘草、板藍(lán)根等為主要成分的復(fù)方中草藥，對牙鲆的非特異免疫有增強(qiáng)作用，其中，4%飼料添加濃度效果最為顯著[27]。大量研究結(jié)果表明，板藍(lán)根在飼料添加及水產(chǎn)養(yǎng)殖方面的研究非常廣泛，但關(guān)于板藍(lán)根作為飼料添加劑對吉富羅非魚的免疫功能和生長性能的研究鮮有報道。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)是指示肝細(xì)胞是否受損的最可靠指標(biāo)，一般用以評價藥物的毒副作用。有研究結(jié)果表明，在飼料中分別添加蒲公英、金銀花等中草藥復(fù)方對鯉魚血清ALT、AST活性的影響并不顯著，提示中草藥的對試驗魚無毒副作用[27]。本研究在羅非魚飼料中添加板藍(lán)根復(fù)方，結(jié)果表明板藍(lán)根不會使ALT、AST水平顯著上調(diào)，這與前人研究結(jié)果一致。腸道是魚類攝食后進(jìn)行營養(yǎng)吸收的主要場所，保持魚類腸道的微生態(tài)平衡對魚類生長發(fā)育有重要影響。目前，還沒有關(guān)于板藍(lán)根復(fù)方對魚類腸道消化功能影響的報道，不過其他動物的相關(guān)研究已有不少。張鵬等在飼料中添加發(fā)酵板藍(lán)根，結(jié)果顯示可顯著提高仔豬質(zhì)量增加率、提高飼料利用率及改善仔豬腹瀉情況[28]。張婷婷等研究板藍(lán)根多糖對斷奶仔鼠小腸發(fā)育的影響，證明斷奶仔鼠使用板藍(lán)根多糖后吸收功能和形態(tài)發(fā)育得到促進(jìn)[29]。吉紅等用含中草藥飼料投喂泥鰍，泥鰍腸道淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的活性均顯著升高，加快消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而泥鰍生長性能提高[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，5%濃度的板藍(lán)根添加日糧，在喂養(yǎng)14 d內(nèi)提高羅非魚腸道脂肪酶的活力(P<0.05)，這與相關(guān)研究結(jié)果保持一致。本研究發(fā)現(xiàn)，板藍(lán)根作為飼料添加劑能有效提高羅非魚的特定生長率、質(zhì)量增加率和降低餌料系數(shù)。其主要原因可能是板藍(lán)根復(fù)方提高了試驗魚腸道消化酶的活性，優(yōu)化腸道微生態(tài)環(huán)境并改善消化功能，進(jìn)而促進(jìn)其生長發(fā)育。

4 結(jié)論

在羅非魚基礎(chǔ)飼料中添加板藍(lán)根復(fù)方，有效促進(jìn)羅非魚生長、改善消化功能。板藍(lán)根復(fù)方對試驗魚的生長性能、腸道消化酶、血清及肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶等指標(biāo)改善作用較明顯，能夠促進(jìn)試驗魚的生長、提高免疫力。