譚政委， 魯?shù)さぃ?李 磊， 余永亮， 許蘭杰， 董 薇， 楊紅旗， 楊 青， 李春明， 安素妨， 梁慧珍

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心，河南鄭州 450002)

金銀花為大宗中藥材，來源于忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的花蕾或待初開的花。金銀花中含有豐富的揮發(fā)油、黃酮類、有機(jī)酸類、三萜類和環(huán)烯醚萜類等化學(xué)成分，因其具有抗菌消炎、抗病毒、抗腫瘤、抗衰老等功效，具有重要的臨床藥用價值[1]。此外，金銀花屬于中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會公布的110種藥食同源名錄品種之一，其提取物已被廣泛應(yīng)用于香料、化妝品、食品飲料等領(lǐng)域[2]。

紅白忍冬[LonicerajaponicaThunb. var.chinensis(Wats.) Bak.]是一個忍冬自然變異的自變種，其幼枝呈紫黑色，幼葉帶紫紅色，花冠外面呈紫紅色，里面呈白色。與忍冬相比，紅白忍冬中綠原酸、花色苷(anthocycanins)含量較高且揮發(fā)油種類更多[3]，香味更加濃郁，并且具有更強(qiáng)的抗寒性、耐旱性，花期長且開花時間比忍冬早，四季長青，因此也具有較高的觀賞價值和茶飲價值。

花色苷是一類天然水溶性色素，廣泛存在于植物的花、根、莖、葉及果實(shí)等多種組織中，使這些組織呈現(xiàn)紅色、藍(lán)色或粉色?；ㄉ赵谥参锏纳L發(fā)育和抗逆反應(yīng)中都起著重要作用，主要包括抗氧化、抗紫外脅迫及吸引昆蟲與食草動物前來傳播花粉和種子等[4]。此外，花色苷還具有抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂等生物活性[5-6]，因此可見，作為一種天然存在的色素，花色苷在應(yīng)用到食品添加劑方面具有良好的前景[7]。花青素的生物合成涉及許多類黃酮生物合成的必需結(jié)構(gòu)基因，包括苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase，PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(cinnamate-4-hydroxylase，C4H)、4-香豆酸：輔酶A連接酶(4-coumarate：coenzyme A ligase，4CL)、查爾酮合酶(chalcone synthase，CHS)、查爾酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase，CHI)、黃烷酮-3-羥化酶(flavanone-3-hydroxylase，F(xiàn)3H)、二氫黃酮醇4-還原酶(dihydroflavonol 4-reductase，DFR)、花青素合成酶[(anthocyanin synthase(ANS)，又稱leucoanthocyanidin dioxygenase(LDOX)]及UDP類黃酮葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP flavonoid glucosyltransferase，UFGT)[8]。

ANS作為花色苷合成途徑中重要的關(guān)鍵酶之一，已從擬南芥[9]、草莓[10]、紅薯[11]、可可樹[12]、百脈根[13]等多種植物中得到克隆，ANS的功能特性及表達(dá)量影響了植物花色苷的種類和含量，如龍膽花中ANS基因突變可導(dǎo)致花色變白[14]，金鐘連翹中ANS的表達(dá)量決定了花青素含量[15]。Yuan等研究發(fā)現(xiàn)，紅白忍冬中的花色苷以矢車菊素-3，5-二葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷為主，并且DFR基因結(jié)構(gòu)變異是導(dǎo)致忍冬中花色苷含量較低的重要因素之一[3]，但是目前關(guān)于ANS基因表達(dá)量是否與紅白忍冬花色苷含量有關(guān)的研究未見報道。為了探究ANS基因在紅白忍冬花色苷合成中的作用，本研究以紅白忍冬為材料，通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析、RT-PCR 方法等，從紅白忍冬中克隆得到rLjANS1基因cDNA序列全長，隨后對該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，用qRT-PCR對其表達(dá)模式進(jìn)行分析，并對其表達(dá)量與花色苷含量進(jìn)行相關(guān)性分析，以期為紅白忍冬花色苷生物合成和rLjANS1基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用紅白忍冬于2017年種植于河南農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地，經(jīng)河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心梁慧珍研究員鑒定為忍冬的變種紅白忍冬，在自然條件下生長。于2021年4—5月在河南農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地采取其根、莖、葉和不同發(fā)育時期的花，紅白忍冬花發(fā)育時期參照忍冬花期劃分標(biāo)準(zhǔn)，分為幼蕾期、三青期、二白期、大白期、銀花期、金花期。每份樣品設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)分成2份，分別用于基因、花色苷的定量分析，先將樣品在液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

總RNA提取所用Quick RNA Isolation Kit試劑盒購自北京華越洋生物科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)、pMD19-T和熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa TB Green?Premix ExTaqTMⅡ)均購自寶生物工程(大連)有限公司，KOD FX購自東洋紡(上海)生物科技有限公司，DNA凝膠回收試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心保存，引物合成和基因測序委托河南尚亞生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 總RNA的提取及cDNA第1鏈的合成 按照北京華越洋生物科技有限公司的試劑盒說明書提取樣品的總RNA，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳對提取的總RNA的質(zhì)量和完整性進(jìn)行檢測，用NanoDrop 2000分光光度計對總RNA進(jìn)行定量，參照試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄為第1鏈cDNA。

1.3.2rLjANS1基因cDNA全長序列的克隆 根據(jù)筆者所在研究室構(gòu)建的紅白忍冬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫注釋信息，篩選注釋為“l(fā)eucoanthocyanidin dioxygenase/anthocyanidin synthase”并有完整讀碼框的轉(zhuǎn)錄本，提取轉(zhuǎn)錄本的核酸序列，用Primer Premier 5軟件目的基因引物，上游引物序列為5′-A T G G T G A C C A C G A T G T C C T C A A G-3′，下游引物序列為5′-T C A T T T C T T C T C A A G A G C T T C T T-3′。以提取得到的不同花期的cDNA為模板，用KOD酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到基因全長cDNA序列，PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，68 ℃ 60 s，30 個循環(huán)；68 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳并切取目的片段，回收后與pMD19-T載體連接，并用連接后的載體轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過PCR篩選陽性克隆，將菌液送往河南尚亞生物技術(shù)公司測序。

1.3.3 rLjANS1蛋白的生物信息學(xué)分析 rLjANS1蛋白的氨基酸組成、分子量、理論等電點(diǎn)及穩(wěn)定性參數(shù)的分析通過在線軟件ProtParam (https：//web.expasy.org/protparam/)完成；通過美國國家生物信息中心(NCBI)在線查找軟件ORF finder查找rLjANS1的開放閱讀框(ORF)；通過NCBI的CD-Search(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對rLjANS1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測分析；使用在線工具SOPMA (https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html)對rLjANS1蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析；通過SWISSMODLE (https：//swissmodel.expasy.org/interactive)完成rLjANS1蛋白的三級結(jié)構(gòu)分析；分別用SignalP-5.0在線軟件 (https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0)和PSORT (https：//www.genscript.com/psort.html)完成信號肽的預(yù)測和亞細(xì)胞定位分析；用DNAMAN 6.0軟件對rLjANS1蛋白及其同源蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多重比對；通過MEGA 7.0軟件中的Neighbor-Joining構(gòu)建rLjANS1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹，并通過Bootstrap方法對進(jìn)化樹進(jìn)行檢測，Bootstrap值設(shè)置為100。

1.3.4rLjANS1基因的表達(dá)模式分析 通過熒光定量PCR技術(shù)檢測rLjANS1基因在不同組織部位及不同發(fā)育時期花中的表達(dá)量，用Premier5設(shè)計rLjANS1基因的熒光定量PCR引物，上游引物序列為5′-C C C T C A A C T G C C A A C A A T-3′，下游引物序列為5′-A T C A C C C C C C A C T C C A T-3′；內(nèi)標(biāo)參比基因?yàn)镃t60S基因，上游引物序列為5′-C A T C C A T T A T C C A A C A A T C-3′，下游引物序列為5′-A A G A G T A A T C A G T C T C C A-3′。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)。通過熔解曲線分析目的基因PCR擴(kuò)增的特異性，反應(yīng)程序：從55 ℃到 94 ℃，升溫速度為0.1 ℃/s。每個熒光定量PCR反應(yīng)重復(fù)3次，采用2-ΔΔCT相對定量法對基因進(jìn)行表達(dá)水平的分析。

1.3.5 花色苷含量的測定及相關(guān)性分析 用Wrolstad等的pH示差法對花色苷含量進(jìn)行定量分析[16]，稱取0.5 g用液氮研磨的樣品，加入5 mL提取液，混勻后于4 ℃避光保存過夜，4 ℃ 8 000 r/min離心10 min，取上清液，分別檢測樣品在pH值為1.0、4.5時520、700 nm處的吸光度，用如下公式計算花色苷含量：花色苷含量(μg/g)=(D/εL)×Mm×DF×V/m×1 000。式中：D=(D520 nm-D700 nm)pH1.0-(D520 nm-D700 nm)pH4.5；ε為矢車菊-3-葡萄糖苷消光系數(shù)(26 900)；L為比色皿光程(1 cm)；Mm為矢車菊-3-葡萄糖苷分子量(449.2)；DF為稀釋因子；V為最終體積(mL)；m為樣品鮮質(zhì)量(mg)。用Excel對rLjANS1基因的表達(dá)量與其對應(yīng)樣本花色苷含量進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 rLjANS1基因的克隆

筆者所在課題組前期構(gòu)建了忍冬、紅白忍冬S4期的轉(zhuǎn)錄組，通過關(guān)鍵詞“l(fā)eucoanthocyanidin dioxygenase/anthocyanidin synthase”和KEGG編號“K05277”對轉(zhuǎn)錄組注釋文件進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)有1條序列Cluster-20471.73376注釋為anthocyanidin synthase，并且紅白忍冬中FPKM值(354.02±136.65)顯著高于忍冬(0.91±0.59)。為了對該基因進(jìn)行深入研究，筆者根據(jù)該注釋基因序列設(shè)計引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測。結(jié)果如圖1所示，目的基因片段長度約 1 100 bp，與預(yù)測大小一致。測序結(jié)果表明，該基因cDNA序列長1 068 bp，并且測序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，具有完整的讀碼框，編碼355個氨基酸(圖2)。通過NCBI保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白具有ANS蛋白典型的保守結(jié)構(gòu)域2OG-FeⅡ_Oxy氧化酶結(jié)構(gòu)域(圖3)，因此將該基因命名為rLjANS1。

2.2 rLjANS1生物信息學(xué)分析

2.2.1 蛋白的理化性狀、亞型胞定位、跨膜區(qū)域預(yù)測 通過Prot Param對rLjANS1蛋白進(jìn)行分析，其分子式為C1807H2863N475O541S15，包含5 701個原子，相對分子量為40.38 ku，理論等電點(diǎn)為5.47。氨基酸組成及比例的分析結(jié)果表明，該蛋白中Glu數(shù)量最多，占11.8%，Trp數(shù)量最少，占1.4%。帶正電荷氨基酸殘基、帶負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)分別是45、56個，脂肪系數(shù)為88.17，親水性指數(shù)為-0.420，不穩(wěn)定指數(shù)為54.85，半衰期為30 h，對以上數(shù)據(jù)的初步分析發(fā)現(xiàn)，rLjANS1蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白。通過PSORT對rLjANS1蛋白的亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中，用SignalP 5.0對其信號肽進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，rLjANS1蛋白無信號肽，為非分泌蛋白；用TMHMM 2.0預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白無跨膜區(qū)域，屬于非膜蛋白。

2.2.2 rLjANS1蛋白的空間結(jié)構(gòu)分析 用SOPMA對rLjANS1的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線預(yù)測，統(tǒng)計結(jié)果顯示，rLjANS1蛋白的4種主要二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈和β-折疊組成，其中無規(guī)則卷曲在4種二級結(jié)構(gòu)中所占比例最高，為40.85%，α-螺旋次之，占比為35.21%，延伸鏈、β-折疊的占比分別為17.75%、6.20%(圖4)。用SWISS-MODEL對rLjANS1蛋白進(jìn)行同源建模，得到rLjANS1蛋白的三維空間模型(圖5)。通過ExPAsy structure assessment程序評測推導(dǎo)可知，rLjANS1蛋白模型得分為0.93，可信度較高，與擬南芥中的ANS(PDB：1GP4)的相似度為79.60%。

2.3 rLjANS1蛋白序列比對和進(jìn)化樹分析

通過DNAMAN 7.0軟件對rLjANS1蛋白與其他物種的ANS蛋白進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明，該蛋白與藍(lán)果忍冬(Loniceracaerulea，ALU09330.1)、榴蓮(Duriozibethinus，XP_022732774.1)、雷公藤(Tripterygiumwilfordii，XP_038687022.1)、三七(Panaxnotoginseng，QKV26469.1)等植物中同源ANS具有較高的同源性，同源性分別為98.31%、86.36%、86.24%、83.94%，并具有植物ANS典型的2OG-FeⅡ_Oxy氧化酶結(jié)構(gòu)域，包含由第236位的組氨酸(His，H)、第238位的天冬氨酸(Asp，D)和第290位的組氨酸組成的亞鐵離子結(jié)合位點(diǎn)(HxDxnH)及由第300位的精氨酸(Arg，R)、第302位的絲氨酸(Ser，S)構(gòu)成的2-酮戊二酸特異性結(jié)合位點(diǎn)(RxS)(圖6)。

將擬南芥、榴蓮、草莓、金蕎麥、藍(lán)果忍冬、蘋果、水稻、垂穗商陸、紫蘇、三七、菠菜、藍(lán)豬耳、雷公藤、葡萄、玫瑰、小麥和苜蓿等17種不同物種的ANS蛋白序列與rLjANS1蛋白序列進(jìn)行比對后構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果表明，rLjANS1與同為忍冬科的藍(lán)果忍冬聚為一支，親緣關(guān)系最近，與三七、雷公藤、榴蓮、葡萄聚為一個大分支，親緣關(guān)系也較近(圖7)，推測這些物種中的ANS可能具有相似功能。

2.4 rLjANS1基因表達(dá)模式的分析

用qRT-PCR對紅白忍冬根、莖、葉及不同發(fā)育時期花組織(S1～S6)中rLjANS基因的表達(dá)情況進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明，rLjANS1基因除了不在根中表達(dá)外，在其他所測組織中都有表達(dá)，在葉中的相對表達(dá)量最高；另外，在不同花發(fā)育時期，rLjANS1基因的相對表達(dá)量都呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，其中在S4期的相對表達(dá)量最高(圖8)。

2.5 rLjANS1基因表達(dá)與花色苷含量的相關(guān)性分析

紅白忍冬不同組織部位及不同花發(fā)育時期的花色苷含量如圖9所示。從檢測結(jié)果看，在紅白忍冬根中幾乎檢測不到花色苷，紅白忍冬地上部分組織中都有花色苷積累，其中葉中的花色苷含量最高。隨著花發(fā)育進(jìn)程的推進(jìn)，花色苷含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，其中S4期的含量最高。

對rLjANS1基因的相對表達(dá)量與其對應(yīng)樣本花色苷含量進(jìn)行線性回歸分析，得出相關(guān)系數(shù)為0.97(P<0.05)，其相關(guān)方程為y=0.008 6x+0.115 8，說明rLjANS基因的表達(dá)水平與其對應(yīng)的花色苷含量呈正相關(guān)關(guān)系。

3 討論與結(jié)論

花青素合成酶是一個植物花青素生物合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶，是一個依賴亞鐵離子、 2-酮戊二酸的雙加氧酶，屬于2-氧戊二酸依賴性雙加氧酶(2-OGD)超家族，可催化無色花青素(leucoanthocyanidin)轉(zhuǎn)化為有色花色苷元，在植物色澤形成中起著重要作用[14]。ANS最早是從玉米突變體A2中克隆得到的，目前已從金鐘連翹(Forsythiaintermedia)、裂葉牽牛(Ipomoeahederacea)、草莓(Fragaria×ananassa)等植物中得到克隆，研究者已對其在色澤形成中的作用進(jìn)行了相關(guān)研究[15，17]。

本研究通過挖掘轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從紅白忍冬中篩選并克隆得到1個ANS基因rLjANS1，編碼355個氨基酸，結(jié)構(gòu)域分析表明，rLjANS1蛋白具有ANS蛋白典型的保守結(jié)構(gòu)域2OG-FeⅡ_Oxy氧化酶結(jié)構(gòu)域，屬于2-OGD蛋白超家族。生物信息學(xué)分析顯示，rLjANS1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，為水溶性蛋白，這與擬南芥、葡萄等物種已報道的ANS一致，也與花青素主要在細(xì)胞質(zhì)中合成的結(jié)論[9，18]一致。對rLjANS1進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，α-螺旋主要集中在蛋白的前中部和C-末端，與草莓、葡萄的二級結(jié)構(gòu)類似[17-18]。多種序列比對結(jié)果顯示，rLjANS1與其他已知的ANS蛋白具有較高的同源性，并且從蛋白三級結(jié)構(gòu)的模擬結(jié)果看出，rLjANS1與已知結(jié)構(gòu)功能的擬南芥AtANS空間結(jié)構(gòu)非常相似，提示rLjANS1的功能與AtANS具有一定的相似性，這為進(jìn)一步研究紅白忍冬花色形成機(jī)制與rLjANS1催化功能提供了很好的借鑒。

黃酮類化合物與其他次生代謝物一樣，其積累大多具有組織特性，參與這些代謝物合成的關(guān)鍵基因也具有組織表達(dá)特異性，這種特性已被廣泛應(yīng)用于基因組復(fù)雜或非模式植物的次生代謝產(chǎn)物合成途徑關(guān)鍵基因的分離鑒定中[19-20]。大量研究發(fā)現(xiàn)，ANS的表達(dá)量與花色苷含量具有一定的相關(guān)性。Aharoni等發(fā)現(xiàn)，通過RNAi降低草莓ANS基因的表達(dá)量，會導(dǎo)致花青素含量降低，花冠也由粉紅色變?yōu)榘咨玔21]，Nakamura等抑制植物藍(lán)豬耳中ANS基因的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)植株中花青素含量顯著降低[22]。在本研究中，rLjANS1基因在紅白忍冬根、莖、葉和不同發(fā)育期花組織中的表達(dá)量與花青素含量呈明顯的正相關(guān)，這與百脈根、紫娟茶葉等ANS的研究結(jié)果[13，23]一致，表明這些組織中rLjANS1基因的表達(dá)可能與紅白忍冬花色苷合成和積累密切相關(guān)。

目前ANS基因在園藝作物中的研究相對較多，但在紅白忍冬中關(guān)于該基因表達(dá)量與花色苷積累關(guān)系的研究較少。本研究在分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，克隆并對該基因的表達(dá)量和花色苷含量相關(guān)性進(jìn)行研究，初步證明了rLjANS1基因表達(dá)與花色苷的正相關(guān)性，為rLjANS基因在紅白忍冬中花色苷生物合成積累及遺傳改良等方面的相關(guān)研究提供了參考。