央金拉姆 尼珍* 魯躍東 單增白瑪

（1.西藏自治區(qū)高原生物研究所，西藏 拉薩 850000；2.南木林鎮(zhèn)農(nóng)牧綜合服務中心，西藏 日喀則 857100）

波棱瓜（Herpetospermum peduculosum）為葫蘆科，波棱瓜屬一年生攀延草本植物。莖、枝纖細，有棱溝，初時具疏柔毛，最后變近光滑無毛。葉柄長4～8(-10)cm，具與莖枝一樣的毛被，后漸脫落；葉片膜質(zhì)，卵狀心形，長6～12cm，寬4～9cm，先端尾狀漸尖，邊緣具細圓齒，或有不規(guī)則的角，基部心形，彎缺張開，寬、深均為1～2cm，兩面粗糙，初時具黃褐色長柔毛，后漸脫落，葉脈在葉背隆起，具長柔毛；卷須2歧，近無毛。雌雄異株。雄花：通常為單生花同一總狀花序并生，單生花花梗長達10～16cm，具5～10 朵花的總狀花序，長達12～40cm，有疏柔毛；花梗長2～6cm，疏生長柔毛；花萼筒上部膨大成漏斗狀，下部管狀，長2～2.5cm，頂端直徑8～9mm，基部徑2mm，被短柔毛，裂片披針形，長8～9mm；花冠黃色，裂片橢圓形，急尖，長20～22mm，寬12～15mm；雄蕊花絲絲狀，長2～3mm，花藥長5～6mm；退化雌蕊近鉆形，長4～5mm。果梗粗壯，長1～2cm；果實闊長圓形，三棱狀，被長柔毛，成熟時3 瓣裂至近基部，里面纖維狀，長7～8cm，寬3～4cm。種子淡灰色，長圓形，基部截形，具小尖頭，頂端不明顯3 裂，長約12mm，寬5mm，厚2～3mm?；ü?～10月［1］。

波棱瓜在西藏主要分布在波密、林芝、錯那、聶拉木，吉隆、墨脫等地，經(jīng)本課題組考察，其分布地點增加了4 個縣。另據(jù)資料記載，國內(nèi)主要分布在四川西部、云南西北部、青海。國外主要分布在尼泊爾、錫金、不丹及印度北部等地。從調(diào)查情況來看，波棱瓜分布在野外的比較少，大部分生長在農(nóng)牧民家園的籬笆墻上。

隨著進一步對波棱瓜的研究，發(fā)現(xiàn)該物種具有藥用價值，波棱瓜種子含生物堿、鞣質(zhì)、甾醇、氨基酸、三萜類［2］，其種子入藥，有清熱解毒、柔肝之功效，主要用于治療黃疸型傳染性肝炎以及消化不良等，是常用藏藥材之一。主要生長在海拔1500～3500m 的溫暖、濕潤的亞熱帶路旁、山坡、灌叢、林緣,雖然分布范圍較廣，但在分布區(qū)植株密度低。隨著藏醫(yī)藥的蓬勃發(fā)展，使波棱瓜野生資源瀕臨滅絕。2005年西藏自治區(qū)藏醫(yī)藥領域的專家們共同確定波棱瓜為一級瀕危植物。在人工栽培中常用種子播種法，波棱瓜是雌雄異株植物，至今從其種子上無法辨認雌、雄株。在常規(guī)播種條件下，種子發(fā)芽率較低且雌株比例只占30%，因此，產(chǎn)量很低，造成了波棱瓜人工栽培的瓶頸，嚴重制約著規(guī)?；耘?。目前，有關波棱瓜組織培養(yǎng)方面見葉片愈傷誘導和頂芽誘導的報道，未見雌株繁殖方面的報道［3］，因此，研究波棱瓜雌株的繁殖技術具有非常重要的意義。本實驗以瀕危藏藥植物——波棱瓜雌株的莖段為外植體進行再生植株的研究，已培養(yǎng)出大量的波棱瓜雌株組培苗并進行了煉苗、移栽、采收，為提高波棱瓜產(chǎn)量開辟了一條行之有效途徑。

1 材料與方法

1.1 供試材料

采自西藏林芝地區(qū)八一鎮(zhèn)西藏藥業(yè)藥材栽培基地的波棱瓜子，千粒重為70～110g。通過溫室內(nèi)播種、移栽，待開花可識別波棱瓜雌、雄株時，剪取波棱瓜雌株上端幼嫩葉片及莖段。先用肥皂水分別進行清洗再用流水反復沖洗，再放入75%的酒精中浸5s 后，用無菌水沖洗3遍，然后用0.1%升汞分三個時間段進行消毒，最后用無菌水清洗三遍以上待用。

1.2 培養(yǎng)條件與方法

實驗以MS、N6為基礎培養(yǎng)基，附加30 g／L蔗糖，6 g／L瓊脂，0.1 g／L 肌醇，pH 5.8。

培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度為22℃±2；、每天照明12h，采用固體培養(yǎng)。

方法：準備好的材料在超凈臺用無菌濾紙吸干表面水分，將葉片剪切成5 mm×5mm 大小的方塊；莖段切成長約2cm左右，分別接入培養(yǎng)基中。

2 結果與分析

2.1 實驗材料分析

葉片、莖段分別接種到MS 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2d 后葉片開始向外卷曲.一周左右，葉片的四周均有愈傷組織生成。培養(yǎng)到20d 愈傷組織呈黃白色或黃綠色，各瓶中愈傷組織的數(shù)量和質(zhì)量有明顯差異，總的白化現(xiàn)象嚴重。到30d死亡率達到了100%.

莖段培養(yǎng)一周后，莖段有明顯的生長現(xiàn)象，且有新葉長出，培養(yǎng)到20d莖段和莖段上的新葉均出現(xiàn)白化現(xiàn)象，到30d莖段的死亡率為70%.實驗結果表明：莖段和葉片在組織培養(yǎng)過程中都會出現(xiàn)白化現(xiàn)象，但葉片的白化現(xiàn)象更為嚴重。因此選擇莖段培養(yǎng)優(yōu)于葉片培養(yǎng)。

2.2 MS、N6 培養(yǎng)基對波棱瓜雌株分化的影響

將莖段轉(zhuǎn)入N6 培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一周后，N6 培養(yǎng)基中的莖段有生長現(xiàn)象，長勢一般，培養(yǎng)到20d出現(xiàn)嚴重白化現(xiàn)象，通過調(diào)節(jié)光照、溫度等方法試圖解決，但未得到改善，30d 死亡率達到100%.而在MS 培養(yǎng)基中，莖段有明顯的生長現(xiàn)象，且有新葉長出，培養(yǎng)到20d 時，出現(xiàn)白化現(xiàn)象，30d 死亡率達到70%，明顯低于在N6 培養(yǎng)基中的莖段。由表1結果表明，MS培養(yǎng)基優(yōu)于N6培養(yǎng)基。

表1 MS、N6 培養(yǎng)基對波棱瓜雌株分化的影響

2.3 不同配比的蔗糖對波棱瓜雌株的影響

波棱瓜雌株組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的白化現(xiàn)象，是因為碳源不足引起的。植物缺鐵時影響葉綠素的合成，典型的癥狀是在葉片的葉脈間和細胞網(wǎng)狀組織中出現(xiàn)失綠現(xiàn)象，碳源不僅影響植物的生長速度、生長量，還影響其代謝水平，以及細胞的形態(tài)和發(fā)生。而蔗糖是組織培養(yǎng)中最常用的碳源。本實驗通過研究蔗糖不同配比對波棱瓜雌株白化現(xiàn)象的影響。由表2 結果表明,將莖段接種到MS 培養(yǎng)基通過增加蔗糖的含量，隨著蔗糖濃度逐步升高在一定范圍內(nèi)葉片與莖段有返青現(xiàn)象，白化現(xiàn)象得到明顯的改善。以附加40g／L 蔗糖濃度的培養(yǎng)基為宜，白化率有效降低。

表2 培養(yǎng)基中不同配比的蔗糖對波棱瓜雌株的影響

2.4 不同激素配比對波棱瓜雌株分化芽的影響

從表3 可以看出，含有6-BA 和NAA 兩種不同激素在不同濃度配比組合下，隨著6-BA 濃度逐步升高在一定范圍波棱瓜雌株分化芽有明顯增加作用，但6-BA 和NAA 總的激素濃度超過1.5mg／L時，葉片開始出現(xiàn)微微卷曲。而隨著NAA 濃度逐步升高在一定范圍波棱瓜雌株分化芽有增加作用但不明顯，且NAA和6-BA 總的激素濃度超過1.5mg／L 時，葉片生長依然正常，這表明6-BA 起著決定性的作用。分化培養(yǎng)基添加6-BA1.0 mg／L為宜，芽的增殖系數(shù)為5.0。

表3 不同激素配比對波棱瓜雌株分化芽的影響

2.5 不同激素配比對波棱瓜雌株生根的影響

切下長1.5～2cm分化芽接種于含有IBA 和IAA 兩種不同激素在不同濃度配比組合下的培養(yǎng)基中，由表4 結果表明，在添加IBA1.0mg／L、IAA1.0mg／L 濃度的1/2MS 生根培養(yǎng)基中，生根時間及整齊度為最優(yōu)。生根率可達到98%左右。

表4 不同激素配比對波棱瓜雌株生根的影響

圖1 波棱瓜雌株組織培養(yǎng)分化苗

圖2 波棱瓜雌株組織培養(yǎng)生根苗

2.6 試管苗移栽試驗

在移栽前，首先進行幼苗篩選將腐爛、發(fā)霉、有病蟲害及機械損傷的苗子除去。選擇健壯、無病蟲感染、葉表面光滑，株高10cm左右的優(yōu)質(zhì)種苗。

2.6.1 基質(zhì)選擇：基質(zhì)以田園土、紅景天渣、羊糞7：2：1配制基質(zhì)后裝盆待用。

2.6.2 煉苗：將帶有3～4 條根的組培苗從三角瓶取出洗凈后立即栽入盆中，澆足水，要保持70%的濕度，成活率可達到75%.

2.6.3 田間移栽：煉苗21d 后進行田間移栽。田間移栽時間在5月初到5月下旬進行，天氣為陰天，將苗子小心從營養(yǎng)缽中移出，注意不要抖掉土壤，放入小坑內(nèi)，移栽后及時澆透定根水，加遮陽網(wǎng)緩苗10d左右。

2.6.4 田間管理：移栽后30d進行第一次中耕除草，以后的生長期根據(jù)雜草多少隨時進行除草。當波棱瓜苗高25cm以上時，需要搭架作業(yè)，每2～3行搭架一組，搭架高度2m 以上，以人字形為主。要求搭架材料表面粗糙，易于波棱瓜莖須的攀爬。波棱瓜苗期喜陰涼潮濕的環(huán)境，生長期間要注意灌溉保濕，但灌水不可太多，防止引起根的腐爛。移栽后30d 進行第一次除草，以后的生長期根據(jù)雜草多少隨時進行除草。開花期光照要充足，株間通風要良好。

3 討論

波棱瓜雌株組織培養(yǎng)實驗材料的選取實驗表明莖段培養(yǎng)優(yōu)于葉片培養(yǎng)；基礎培養(yǎng)基的選擇以MS 為基礎培養(yǎng)基為宜；分化培養(yǎng)基以添加6-BA1.0 mg／L為宜，芽的增殖系數(shù)可達到5.0；生根培養(yǎng)基以1/2MS+1.0mg／L IBA +1.0mg／L IAA 為宜，生根率達到98%;增加蔗糖的濃度能有效地解決在組培過程中的出現(xiàn)的白化現(xiàn)象.通過組織快繁技術進行波棱瓜雌株的繁殖是提高雌株比例，解決波棱瓜人工栽培中產(chǎn)量低這一瓶頸的有效途徑之一。

通過組織快繁技術可以成功的繁殖出波棱瓜雌株苗。通過煉苗、移栽后成活率為50%、株高60cm,開花率為35%、結實率為29%。但在栽培過程中植株長勢比野生的弱，株高只有野生的1/2，開花率、結實率均不高。以波棱瓜的生長特性，應在每年的三月底四月初就要開始進行相關栽培工作，分析上述問題可能與移栽時間較晚等原因有關，有待于進一步研究論證。