唐玉潔，高 原

（湖北文理學院附屬醫(yī)院（襄陽市中心醫(yī)院），湖北 襄陽 441021）

腦心通膠囊源于清代王清任《醫(yī)林改錯·卷下·癱痿論》的補陽還五湯，是以補陽還五湯為基礎加味蟲類藥和活血化瘀藥[1]，由黃芪、赤芍、丹參、當歸、川芎、紅花等16味藥材加工制成，具有益氣活血、化瘀通絡的功效[2]，是“腦心同治”理論的代表性方藥，臨床用于治療腦梗死[3-5]、心肌梗死[6-7]、冠心病[5,8]、血管性癡呆[9]、原發(fā)性高血壓[10]、急性肺栓塞[11]、糖尿病[12]及慢性心力衰竭[13-14]等疾病。現(xiàn)行質量標準的含量測定項下，采用外標法測定芍藥苷和丹酚酸B含量，文獻[15-18]對腦心通膠囊中多種成分進行檢測，含量計算也采用外標法。外標法是成分含量測定過程中的一種傳統(tǒng)的計算方法，在測定多種成分時需要對應的標準物質為參考。

隨著更多的先進分析手段的運用，中藥中更多的成分被發(fā)現(xiàn)，而部分化合物的標準物質由于制備過程復雜、價格昂貴或不穩(wěn)定等因素無法獲得，這影響到藥品中這些成分的檢測，從而導致藥品中部分指標成分無法掌控的局面，給藥品的質量評價和監(jiān)督造成不少漏洞。多種中藥標準物質替代方法能很好地解決標準物質短缺問題[19]，其中，雙標多測法（two reference substances for determination of multiple components，TRSDMC）是采用雙標線性校正法（linear calibration using two reference substances，LCTRS）原理，以兩個化學單體標準物質作為參照成分，對多種成分的色譜峰進行定性后，采用校正因子法對多成分進行含量測定的一種方法。目前，該方法在中藥成分分析領域運用較為廣泛[20-22]。本研究建立腦心通膠囊中羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本內酯5個成分的雙標多測法測定，該方法僅需羥基紅花黃色素A、藁本內酯兩種標準物質即可對其他3種成分進行定性分析，并在此基礎上，使用阿魏酸作為參考，即可對其他4種成分進行定量分析，方法經濟實用、準確可靠，可為腦心通膠囊的質量評價和監(jiān)督提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

e2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；1260 Infinity型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Ultimate 3000型高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾公司）；AB135-S型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；DTA-27超聲波清洗器（超聲功率700 W，頻率40 kHz，湖北鼎泰高科有限公司）。

色譜柱1：資生堂CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；色譜柱2：GL Sciences Inertsil ODS-3（150 mm×4.6 mm，5 μm）；色譜柱3：迪馬 Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；色譜柱4：月旭Ultimate XB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；色譜柱5：安捷倫Zorbax C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；色譜柱6：島津VP-ODS（150 mm×4.6 mm，5 μm）；色譜柱7：島津Inertsil ODS-SP（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.2 試藥

腦心通膠囊市售6批，陜西步長制藥有限公司生產，規(guī)格：0.4 g/粒，批號：20200205，20200301，20200602，20210201，20210205，20210705；羥基紅花黃色素A對照品（批號：111637-201810，純度：93.1 %），芍藥苷對照品（批號：110736-202044，純度：96.8 %），阿魏酸對照品（批號：110773-201915，純度：99.4 %），丹酚酸B對照品（批號：111562-201917，純度：96.6 %），藁本內酯對照品（批號：111737-201910，純度：≥95.0 %，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇、乙腈均為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱1；流動相：乙腈（A）-0.5 %甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，5 %A→15 %A；8～20 min， 15 %A；20～36 min，15 %→40 %A；36～50 min，40 %→45 %A；50～60 min， 45 %A；60～75 min，45 %→70 %A；75～80 min，70 %A；80～85 min，70 %→8 %A）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：403 nm（0～30 min，檢測羥基紅花黃色素A），240 nm（30～42 min，芍藥苷），280 nm（50～70 min，丹酚酸B），324 nm（42～50 min及70～85 min，阿魏酸和藁本內酯）；進樣量：20.00 μl；柱溫：35 ℃。

2.2 方法學考察

2.2.1 混合對照品溶液制備 分別精密稱取羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B、藁本內酯對照品各適量，以70 %甲醇制成每1 ml含羥基紅花黃色素A 0.043 mg、芍藥苷0.199 mg、阿魏酸0.013 mg、丹酚酸B 0.523 mg、藁本內酯0.228 mg的混合對照品貯備溶液。精密量取對照品貯備液1 ml 至10 ml量瓶中，加70 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得混合對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液制備 取腦心通膠囊10粒，將內容物混合均勻，精密稱取0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70 %甲醇50 ml，稱重，超聲處理（功率：5000 W，頻率：40 kHz）30 min，取出，放冷至室溫，用70 %甲醇補足減失的重量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，備用。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗 精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液各20 μl，按2.1項色譜條件進樣測定，結果見圖1。色譜圖中，羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本內酯與相鄰色譜峰均分離完全（＞1.5），理論塔板數(shù)按羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本內酯計均大于5000。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗HPLC圖譜

2.2.4 線性關系考察 精密量取2.2.1項下混合對照品貯備溶液0.5，1.0，2.0，5.0，8.0，10.0 ml，分別置于25 ml量瓶中，加70 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到系列濃度標準曲線考察溶液。采用色譜柱1，按2.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖峰面積，以各成分質量濃度（x，μg/ml）為橫坐標，各峰面積（y）為縱坐標，進行線性回歸，繪制各成分標準曲線，計算其線性回歸方程和相關系數(shù)，結果見表1。結果表明：羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本內酯的線性關系良好，符合含量測定要求。精密吸取混合對照品溶液，用70 %甲醇倍比稀釋，按2.1項下色譜條件測定，以信噪比（S/N）為10:1時樣品濃度為定量限（LOQ），結果見表1。

表1 線性關系考察及定量限測定結果

2.2.5 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液20 μl，采用色譜柱1，按2.1項下色譜條件，連續(xù)進樣6針，記錄色譜圖保留時間和峰面積。結果羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本內酯保留時間基本一致，峰面積的RSD分別0.3 %，0.2 %，0.1 %，0.4 %，0.3 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一批腦心通膠囊溶液（批號：20200205），采用色譜柱1，按2.1項下色譜條件，分別于0，3，6，9，12，15，24 h測定分析，記錄色譜圖保留時間和峰面積。結果羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本內酯保留時間基本一致，峰面積的RSD分別0.7 %，1.0 %，0.5 %，1.3 %，0.8 %（n=7），表明24 h內供試品溶液穩(wěn)定。

2.2.7 重復性試驗 取同一批腦心通膠囊內容物（批號：20200205），按2.2.2項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，采用色譜柱1，按2.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖保留時間和峰面積。結果羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本內酯保留時間基本一致，按標準曲線法，以峰面積計算各成分平均含量分別為0.455，1.992，0.137，5.328，2.3188 mg/g，平均含量的RSD分別0.5 %，0.4 %，0.5 %，0.9 %，1.0 %（n=6），表明方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收試驗 取已知含量的腦心通膠囊內容物（批號：20200205），精密稱取0.25 g，共6份，置于具塞錐形瓶中，分別加入2.2.2項下混合對照品貯備溶液2.5 ml，按2.2.1項下方法制備供試品溶液，采用色譜柱1，再按2.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖峰面積，計算各成分加樣回收率及RSD值，結果見表2。結果表明羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本內酯加樣回收率良好，適合本試驗要求。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）

2.3 雙標線性校正法定性研究[22-23]

2.3.1 色譜柱適用性考察 取2.2.2項下同一批腦心通膠囊（批號：20200205）供試品溶液，采用色譜柱1～6，按2.1項下色譜條件測定，記錄各成分色譜峰保留時間，計算各峰保留時間平均值，結果見表3。以各成分在不同色譜柱上保留時間平均值即標準保留時間（standard retention time，SRT）為橫坐標，以各成分在各色譜柱上實際保留時間為縱坐標進行線性回歸，繪制標準曲線，計算其線性回歸方程和相關系數(shù)，結果見表4。結果羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本內酯在各色譜柱上都能分離完全，SRT分別為12.067，28.421，31.191，41.480，54.027 min，5成分在6根色譜柱上的實際保留時間與SRT呈良好線性關系。

表3 不同色譜柱上5成分的保留時間

表4 5種成分在不同色譜柱上保留時間關系

2.3.2 雙標線性校正法定位化合物 取2.2.1項下混合對照品溶液及2.2.2項下同一批腦心通膠囊（批號：20200205）供試品溶液，采用色譜柱7，按2.1項下色譜條件測定，記錄各成分色譜峰保留時間。設置羥基紅花黃色素A和藁本內酯為雙標化合物，以混合對照品溶液色譜圖中羥基紅花黃色素A（18.152 min）和藁本內酯（81.54 min）保留時間為橫坐標，供試品色譜圖中兩成分實際保留時間（紅花黃色素A為17.789，藁本內酯為79.902 min）為縱坐標，進行線性回歸，得到兩點線性方程為y=0.9799x+0.0022，將芍藥苷，阿魏酸，丹酚酸B保留時間代入線性方程，推算出供試品色譜圖中芍藥苷（42.842 min），阿魏酸（47.070 min），丹酚酸B（62.605 min）的理論保留時間分別為41.983，46.126，61.349 min，與供試品色譜圖中芍藥苷，阿魏酸，丹酚酸B 3化合物實際保留時間比較，相對偏差均小于0.2 %，說明在色譜柱7上采用雙標線性校正法進行色譜峰定性分析可行。

2.3.3 雙標線性校正法與相對保留時間法的對比 雙標線性校正法以羥基紅花黃色素A和藁本內酯為雙標化合物，芍藥苷和丹酚酸B預測保留時間絕對誤差分別為0.056，0.034 min；相對保留時間法以中間峰阿魏酸為參照物，芍藥苷和丹酚酸B預測保留時間絕對誤差分別為1.032，1.089 min。結果表明，雙標線性校正法較相對保留時間法的預測值絕對偏差低，該方法對色譜柱的適用性更強，對色譜峰的定性分析更加準確。

2.4 校正因子法定量研究

2.4.1 相對校正因子的計算 以阿魏酸為內參物計算羥基紅花黃色素A、芍藥苷、丹酚酸B和藁本內酯的相對校正因子。取2.2.1項下混合對照品溶液1，4，8，12，24，36，48 μl，采用色譜柱1，按2.1項下色譜條件測定，記錄各成分色譜峰的峰面積，按下式計算相對校正因子平均值。結果見表5。

表5 腦心通膠囊中4種成分相對校正因子

式中S為內參物，T為其他成分，A為峰面積，C為各成分質量濃度。

2.4.2 相對校正因子重現(xiàn)性考察 為驗證相對校正因子重現(xiàn)性，分別考察Waters公司e2695型高效液相色譜儀（色譜儀1），Agilent公司1260 Infinity型高效液相色譜儀（色譜儀2），賽默飛世爾公司Ultimate3000型高效液相色譜儀（色譜儀3）3臺色譜儀及3根不同品牌色譜柱（色譜柱1～3）對相對校正因子的影響，結果顯示不同品牌高效液相色譜儀和不同型號色譜柱對羥基紅花黃色素A、芍藥苷、丹酚酸B和藁本內酯的相對校正因子的影響不大（RSD依次為0.34 %，0.76 %，0.50 %，0.62 %，均小于1.0 %），相對校正因子重現(xiàn)性好。結果見表6。

2.4.3 雙標線性校正法與外標法結果比較 采用色譜柱1，按2.1項下色譜條件，分別精密吸取2.2.1項下混合對照品溶液和2.2.2項下6批供試品溶液各20 μl，記錄各成分色譜圖峰面積，分別采用雙標線性校正法與外標法對腦心通膠囊中羥基紅花黃色素A，芍藥苷，丹酚酸B和藁本內酯的含量進行測定，結果見表7。經SPSS 22.0軟件對含量結果進行成組配對t檢驗，結果羥基紅花黃色素A、芍藥苷、丹酚酸B和藁本內酯4成分含量差異P值均大于0.05，表明兩種含量測定方法無顯著差異。

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

本實驗采用DAD檢測器，在190～400 nm范圍內對5種成分進行光譜掃描，結果顯示羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本內酯5成分最大吸收位置差異較大，因此本研究采用波長切換方法進行含量測定，即0～30 min設置波長為203 nm（檢測羥基紅花黃色素A），30～42 min設置波長為240 nm（檢測芍藥苷），50～70 min設置波長為280 nm（檢測丹酚酸B），42～50 min及70～85 min，設置波長為324 nm（檢測阿魏酸和藁本內酯）。流動相考察過程中，先后考察甲醇-0.1 %磷酸水溶液，乙腈-0.1 %醋酸水溶液，乙腈-0.5 %甲酸水溶液及乙腈-0.1 mol/L磷酸二氫鉀溶液等系統(tǒng)，結果顯示乙腈-0.5 %甲酸水溶液流動相系統(tǒng)對供試品中各成分分離效果最佳，因此本研究采用乙腈-0.5 %甲酸水溶液流動相系統(tǒng)進行梯度洗脫。

3.2 雙標多測法含量結果分析

目前對于色譜峰定位，中國藥典中收錄的品種多采用相對保留時間法，本研究結果顯示，此方法較雙標線性校正法誤差大，不同型號的色譜柱的耐用性也較差。由表7可見，雙標多測法和外標法含量測定結果差異很小，但外標法往往需要與目標化合物相同數(shù)量的標準物質參與試驗，雙標多測法只需兩種標準物質即可，由此可見，雙標多側法不僅可節(jié)省實驗成本，還可減少試驗操作步驟，減少誤差，方法簡便實用，可為客觀、多指標評價中藥質量提供重要手段。

表7 雙標線性校正法與外標法測得的腦心通膠囊中5種成分含量比較（n=3，mg/g）

本研究采用雙標線性校正法，以羥基紅花黃色素A和藁本內酯為雙標化合物，定位芍藥苷，阿魏酸和丹酚酸B 3種化合物，設置阿魏酸為參考物，對其他4種化合物進行定量分析，方法簡單，實用，可為腦心通膠囊的質量評價與監(jiān)督提供技術參考。