唐玉潔，高 原

（湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院（襄陽市中心醫(yī)院），湖北 襄陽 441021）

腦心通膠囊源于清代王清任《醫(yī)林改錯(cuò)·卷下·癱痿論》的補(bǔ)陽還五湯，是以補(bǔ)陽還五湯為基礎(chǔ)加味蟲類藥和活血化瘀藥[1]，由黃芪、赤芍、丹參、當(dāng)歸、川芎、紅花等16味藥材加工制成，具有益氣活血、化瘀通絡(luò)的功效[2]，是“腦心同治”理論的代表性方藥，臨床用于治療腦梗死[3-5]、心肌梗死[6-7]、冠心病[5,8]、血管性癡呆[9]、原發(fā)性高血壓[10]、急性肺栓塞[11]、糖尿病[12]及慢性心力衰竭[13-14]等疾病?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的含量測(cè)定項(xiàng)下，采用外標(biāo)法測(cè)定芍藥苷和丹酚酸B含量，文獻(xiàn)[15-18]對(duì)腦心通膠囊中多種成分進(jìn)行檢測(cè)，含量計(jì)算也采用外標(biāo)法。外標(biāo)法是成分含量測(cè)定過程中的一種傳統(tǒng)的計(jì)算方法，在測(cè)定多種成分時(shí)需要對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為參考。

隨著更多的先進(jìn)分析手段的運(yùn)用，中藥中更多的成分被發(fā)現(xiàn)，而部分化合物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)由于制備過程復(fù)雜、價(jià)格昂貴或不穩(wěn)定等因素?zé)o法獲得，這影響到藥品中這些成分的檢測(cè)，從而導(dǎo)致藥品中部分指標(biāo)成分無法掌控的局面，給藥品的質(zhì)量評(píng)價(jià)和監(jiān)督造成不少漏洞。多種中藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)替代方法能很好地解決標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)短缺問題[19]，其中，雙標(biāo)多測(cè)法（two reference substances for determination of multiple components，TRSDMC）是采用雙標(biāo)線性校正法（linear calibration using two reference substances，LCTRS）原理，以兩個(gè)化學(xué)單體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為參照成分，對(duì)多種成分的色譜峰進(jìn)行定性后，采用校正因子法對(duì)多成分進(jìn)行含量測(cè)定的一種方法。目前，該方法在中藥成分分析領(lǐng)域運(yùn)用較為廣泛[20-22]。本研究建立腦心通膠囊中羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本內(nèi)酯5個(gè)成分的雙標(biāo)多測(cè)法測(cè)定，該方法僅需羥基紅花黃色素A、藁本內(nèi)酯兩種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)即可對(duì)其他3種成分進(jìn)行定性分析，并在此基礎(chǔ)上，使用阿魏酸作為參考，即可對(duì)其他4種成分進(jìn)行定量分析，方法經(jīng)濟(jì)實(shí)用、準(zhǔn)確可靠，可為腦心通膠囊的質(zhì)量評(píng)價(jià)和監(jiān)督提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

e2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；1260 Infinity型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Ultimate 3000型高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾公司）；AB135-S型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；DTA-27超聲波清洗器（超聲功率700 W，頻率40 kHz，湖北鼎泰高科有限公司）。

色譜柱1：資生堂CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；色譜柱2：GL Sciences Inertsil ODS-3（150 mm×4.6 mm，5 μm）；色譜柱3：迪馬 Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；色譜柱4：月旭Ultimate XB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；色譜柱5：安捷倫Zorbax C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；色譜柱6：島津VP-ODS（150 mm×4.6 mm，5 μm）；色譜柱7：島津Inertsil ODS-SP（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.2 試藥

腦心通膠囊市售6批，陜西步長制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：0.4 g/粒，批號(hào)：20200205，20200301，20200602，20210201，20210205，20210705；羥基紅花黃色素A對(duì)照品（批號(hào)：111637-201810，純度：93.1 %），芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-202044，純度：96.8 %），阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)：110773-201915，純度：99.4 %），丹酚酸B對(duì)照品（批號(hào)：111562-201917，純度：96.6 %），藁本內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)：111737-201910，純度：≥95.0 %，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇、乙腈均為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱1；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.5 %甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，5 %A→15 %A；8～20 min， 15 %A；20～36 min，15 %→40 %A；36～50 min，40 %→45 %A；50～60 min， 45 %A；60～75 min，45 %→70 %A；75～80 min，70 %A；80～85 min，70 %→8 %A）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長：403 nm（0～30 min，檢測(cè)羥基紅花黃色素A），240 nm（30～42 min，芍藥苷），280 nm（50～70 min，丹酚酸B），324 nm（42～50 min及70～85 min，阿魏酸和藁本內(nèi)酯）；進(jìn)樣量：20.00 μl；柱溫：35 ℃。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 混合對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B、藁本內(nèi)酯對(duì)照品各適量，以70 %甲醇制成每1 ml含羥基紅花黃色素A 0.043 mg、芍藥苷0.199 mg、阿魏酸0.013 mg、丹酚酸B 0.523 mg、藁本內(nèi)酯0.228 mg的混合對(duì)照品貯備溶液。精密量取對(duì)照品貯備液1 ml 至10 ml量瓶中，加70 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得混合對(duì)照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液制備 取腦心通膠囊10粒，將內(nèi)容物混合均勻，精密稱取0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70 %甲醇50 ml，稱重，超聲處理（功率：5000 W，頻率：40 kHz）30 min，取出，放冷至室溫，用70 %甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，備用。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μl，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。色譜圖中，羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本內(nèi)酯與相鄰色譜峰均分離完全（＞1.5），理論塔板數(shù)按羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本內(nèi)酯計(jì)均大于5000。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)HPLC圖譜

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密量取2.2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備溶液0.5，1.0，2.0，5.0，8.0，10.0 ml，分別置于25 ml量瓶中，加70 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到系列濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線考察溶液。采用色譜柱1，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖峰面積，以各成分質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)，各峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，繪制各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表1。結(jié)果表明：羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本內(nèi)酯的線性關(guān)系良好，符合含量測(cè)定要求。精密吸取混合對(duì)照品溶液，用70 %甲醇倍比稀釋，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以信噪比（S/N）為10:1時(shí)樣品濃度為定量限（LOQ），結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察及定量限測(cè)定結(jié)果

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液20 μl，采用色譜柱1，按2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜圖保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本內(nèi)酯保留時(shí)間基本一致，峰面積的RSD分別0.3 %，0.2 %，0.1 %，0.4 %，0.3 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批腦心通膠囊溶液（批號(hào)：20200205），采用色譜柱1，按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別于0，3，6，9，12，15，24 h測(cè)定分析，記錄色譜圖保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本內(nèi)酯保留時(shí)間基本一致，峰面積的RSD分別0.7 %，1.0 %，0.5 %，1.3 %，0.8 %（n=7），表明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批腦心通膠囊內(nèi)容物（批號(hào)：20200205），按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份，采用色譜柱1，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本內(nèi)酯保留時(shí)間基本一致，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法，以峰面積計(jì)算各成分平均含量分別為0.455，1.992，0.137，5.328，2.3188 mg/g，平均含量的RSD分別0.5 %，0.4 %，0.5 %，0.9 %，1.0 %（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的腦心通膠囊內(nèi)容物（批號(hào)：20200205），精密稱取0.25 g，共6份，置于具塞錐形瓶中，分別加入2.2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備溶液2.5 ml，按2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，采用色譜柱1，再按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖峰面積，計(jì)算各成分加樣回收率及RSD值，結(jié)果見表2。結(jié)果表明羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本內(nèi)酯加樣回收率良好，適合本試驗(yàn)要求。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.3 雙標(biāo)線性校正法定性研究[22-23]

2.3.1 色譜柱適用性考察 取2.2.2項(xiàng)下同一批腦心通膠囊（批號(hào)：20200205）供試品溶液，采用色譜柱1～6，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄各成分色譜峰保留時(shí)間，計(jì)算各峰保留時(shí)間平均值，結(jié)果見表3。以各成分在不同色譜柱上保留時(shí)間平均值即標(biāo)準(zhǔn)保留時(shí)間（standard retention time，SRT）為橫坐標(biāo)，以各成分在各色譜柱上實(shí)際保留時(shí)間為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表4。結(jié)果羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本內(nèi)酯在各色譜柱上都能分離完全，SRT分別為12.067，28.421，31.191，41.480，54.027 min，5成分在6根色譜柱上的實(shí)際保留時(shí)間與SRT呈良好線性關(guān)系。

表3 不同色譜柱上5成分的保留時(shí)間

表4 5種成分在不同色譜柱上保留時(shí)間關(guān)系

2.3.2 雙標(biāo)線性校正法定位化合物 取2.2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液及2.2.2項(xiàng)下同一批腦心通膠囊（批號(hào)：20200205）供試品溶液，采用色譜柱7，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄各成分色譜峰保留時(shí)間。設(shè)置羥基紅花黃色素A和藁本內(nèi)酯為雙標(biāo)化合物，以混合對(duì)照品溶液色譜圖中羥基紅花黃色素A（18.152 min）和藁本內(nèi)酯（81.54 min）保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，供試品色譜圖中兩成分實(shí)際保留時(shí)間（紅花黃色素A為17.789，藁本內(nèi)酯為79.902 min）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到兩點(diǎn)線性方程為y=0.9799x+0.0022，將芍藥苷，阿魏酸，丹酚酸B保留時(shí)間代入線性方程，推算出供試品色譜圖中芍藥苷（42.842 min），阿魏酸（47.070 min），丹酚酸B（62.605 min）的理論保留時(shí)間分別為41.983，46.126，61.349 min，與供試品色譜圖中芍藥苷，阿魏酸，丹酚酸B 3化合物實(shí)際保留時(shí)間比較，相對(duì)偏差均小于0.2 %，說明在色譜柱7上采用雙標(biāo)線性校正法進(jìn)行色譜峰定性分析可行。

2.3.3 雙標(biāo)線性校正法與相對(duì)保留時(shí)間法的對(duì)比 雙標(biāo)線性校正法以羥基紅花黃色素A和藁本內(nèi)酯為雙標(biāo)化合物，芍藥苷和丹酚酸B預(yù)測(cè)保留時(shí)間絕對(duì)誤差分別為0.056，0.034 min；相對(duì)保留時(shí)間法以中間峰阿魏酸為參照物，芍藥苷和丹酚酸B預(yù)測(cè)保留時(shí)間絕對(duì)誤差分別為1.032，1.089 min。結(jié)果表明，雙標(biāo)線性校正法較相對(duì)保留時(shí)間法的預(yù)測(cè)值絕對(duì)偏差低，該方法對(duì)色譜柱的適用性更強(qiáng)，對(duì)色譜峰的定性分析更加準(zhǔn)確。

2.4 校正因子法定量研究

2.4.1 相對(duì)校正因子的計(jì)算 以阿魏酸為內(nèi)參物計(jì)算羥基紅花黃色素A、芍藥苷、丹酚酸B和藁本內(nèi)酯的相對(duì)校正因子。取2.2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1，4，8，12，24，36，48 μl，采用色譜柱1，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄各成分色譜峰的峰面積，按下式計(jì)算相對(duì)校正因子平均值。結(jié)果見表5。

表5 腦心通膠囊中4種成分相對(duì)校正因子

式中S為內(nèi)參物，T為其他成分，A為峰面積，C為各成分質(zhì)量濃度。

2.4.2 相對(duì)校正因子重現(xiàn)性考察 為驗(yàn)證相對(duì)校正因子重現(xiàn)性，分別考察Waters公司e2695型高效液相色譜儀（色譜儀1），Agilent公司1260 Infinity型高效液相色譜儀（色譜儀2），賽默飛世爾公司Ultimate3000型高效液相色譜儀（色譜儀3）3臺(tái)色譜儀及3根不同品牌色譜柱（色譜柱1～3）對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果顯示不同品牌高效液相色譜儀和不同型號(hào)色譜柱對(duì)羥基紅花黃色素A、芍藥苷、丹酚酸B和藁本內(nèi)酯的相對(duì)校正因子的影響不大（RSD依次為0.34 %，0.76 %，0.50 %，0.62 %，均小于1.0 %），相對(duì)校正因子重現(xiàn)性好。結(jié)果見表6。

2.4.3 雙標(biāo)線性校正法與外標(biāo)法結(jié)果比較 采用色譜柱1，按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液和2.2.2項(xiàng)下6批供試品溶液各20 μl，記錄各成分色譜圖峰面積，分別采用雙標(biāo)線性校正法與外標(biāo)法對(duì)腦心通膠囊中羥基紅花黃色素A，芍藥苷，丹酚酸B和藁本內(nèi)酯的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表7。經(jīng)SPSS 22.0軟件對(duì)含量結(jié)果進(jìn)行成組配對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)果羥基紅花黃色素A、芍藥苷、丹酚酸B和藁本內(nèi)酯4成分含量差異P值均大于0.05，表明兩種含量測(cè)定方法無顯著差異。

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用DAD檢測(cè)器，在190～400 nm范圍內(nèi)對(duì)5種成分進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果顯示羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本內(nèi)酯5成分最大吸收位置差異較大，因此本研究采用波長切換方法進(jìn)行含量測(cè)定，即0～30 min設(shè)置波長為203 nm（檢測(cè)羥基紅花黃色素A），30～42 min設(shè)置波長為240 nm（檢測(cè)芍藥苷），50～70 min設(shè)置波長為280 nm（檢測(cè)丹酚酸B），42～50 min及70～85 min，設(shè)置波長為324 nm（檢測(cè)阿魏酸和藁本內(nèi)酯）。流動(dòng)相考察過程中，先后考察甲醇-0.1 %磷酸水溶液，乙腈-0.1 %醋酸水溶液，乙腈-0.5 %甲酸水溶液及乙腈-0.1 mol/L磷酸二氫鉀溶液等系統(tǒng)，結(jié)果顯示乙腈-0.5 %甲酸水溶液流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)供試品中各成分分離效果最佳，因此本研究采用乙腈-0.5 %甲酸水溶液流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫。

3.2 雙標(biāo)多測(cè)法含量結(jié)果分析

目前對(duì)于色譜峰定位，中國藥典中收錄的品種多采用相對(duì)保留時(shí)間法，本研究結(jié)果顯示，此方法較雙標(biāo)線性校正法誤差大，不同型號(hào)的色譜柱的耐用性也較差。由表7可見，雙標(biāo)多測(cè)法和外標(biāo)法含量測(cè)定結(jié)果差異很小，但外標(biāo)法往往需要與目標(biāo)化合物相同數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)參與試驗(yàn)，雙標(biāo)多測(cè)法只需兩種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)即可，由此可見，雙標(biāo)多側(cè)法不僅可節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本，還可減少試驗(yàn)操作步驟，減少誤差，方法簡便實(shí)用，可為客觀、多指標(biāo)評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量提供重要手段。

表7 雙標(biāo)線性校正法與外標(biāo)法測(cè)得的腦心通膠囊中5種成分含量比較（n=3，mg/g）

本研究采用雙標(biāo)線性校正法，以羥基紅花黃色素A和藁本內(nèi)酯為雙標(biāo)化合物，定位芍藥苷，阿魏酸和丹酚酸B 3種化合物，設(shè)置阿魏酸為參考物，對(duì)其他4種化合物進(jìn)行定量分析，方法簡單，實(shí)用，可為腦心通膠囊的質(zhì)量評(píng)價(jià)與監(jiān)督提供技術(shù)參考。