張 杰，陳逢佳，于文博，詹偉華，徐江城，陳 郁*

（1. 杭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310018；2. Mailman School of Public Health, Columbia University, United States, New York 10032）

麥冬為百合科植物麥冬[Ophiopogon japonicus(L. f) Ker-Gawl.]的干燥塊根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，能養(yǎng)陰生津、潤肺清心，用于治療內(nèi)熱消渴、津傷口渴等癥[1]，是治療糖尿病的傳統(tǒng)常用中藥[2]。麥冬的主要化學(xué)成分包括甾體皂苷類、高異黃酮類、氨基酸類、豆甾醇類、酚酸類和多糖類[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，麥冬具有抗心腦血管疾病、降血糖[4-8]、降血脂、改善學(xué)習(xí)記憶能力、提高免疫調(diào)節(jié)能力、止咳、抗腫瘤、延緩衰老等多種作用[9]。為進(jìn)一步明確麥冬不同部位活性組分的降血糖作用，本研究對(duì)麥冬不同部位對(duì)糖代謝關(guān)鍵酶的抑制作用及降血糖效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，以冀為開發(fā)新型降糖藥物提供思路。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Smart 2Pure UV/UF超純水系統(tǒng)（美國Thermo公司）；Sorvall ST 40R低溫離心機(jī)（美國Thermo公司）；Spectra MAX 190光吸收酶標(biāo)儀（美國美谷分子公司）；AE50電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-400DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；高速多功能中藥粉碎機(jī)（永康市鉑歐五金制品有限公司）；pH計(jì)（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

麥冬飲片購自浙江景岳堂藥業(yè)有限公司，經(jīng)浙江省杭州九洲大藥房連鎖有限公司副主任中藥師朱整明鑒定為百合科植物麥冬Ophiopogon japonicas(L. f) Ker-Gawl.的干燥塊根。α-葡萄糖苷酶（250 U/mg），α-淀粉酶（50 U/mg，上海源葉生物有限公司）；對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG），3, 5-二硝基水楊酸（DNS），可溶性淀粉，阿卡波糖及其他試劑購自上海阿拉丁試劑公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6小鼠30只，雄性，8周齡，體重20±2 g，由杭州醫(yī)學(xué)院提供，合格證號(hào)：20211108Abbb0100018943。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲食、攝水。

2 方法

2.1 麥冬不同部位提取物制備

稱取麥冬適量，50 ℃烘干后粉碎，過100目篩，取麥冬粉末約10 g，精密稱定，加入10倍量70 %乙醇溶液，回流提取2次，過濾，合并濾液，濃縮，得70 %乙醇提取物；將70 %乙醇提取物加水分散，在超聲波輔助下分別用不同溶劑等體積萃取2次，合并有機(jī)溶劑層，濃縮后凍干，得正丁醇部位、石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位；取麥冬粉末，10倍量蒸餾水浸提2次，冷凍干燥后得水提物。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取10.00 mg提取物凍干粉，用70 %乙醇溶液溶解定容，配制為2 mg/ml儲(chǔ)備液，用0.10 mol/L PBS緩沖液稀釋至0.25 μg/ml，即為供試品溶液。

2.2.2 陽性藥物溶液的制備 精密稱取5.00 mg阿卡波糖，用水溶解定容，配制為1 mg/ml儲(chǔ)備液。用0.10 mol/L PBS緩沖液稀釋至0.5 μg/ml，即為陽性藥物溶液。

2.3 麥冬提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)方法[10]，測(cè)定麥冬不同部位對(duì)α-葡萄糖苷酶酶活力的抑制作用：向酶標(biāo)板中依次加入0.10 mol/L PBS緩沖液（pH 6.8）60 μl，0.25 μg/ml供試品溶液40 μl或0.50 μg/ml陽性藥物阿卡波糖40 μl，0.06 U/ml α-葡萄糖苷酶溶液40 μl，搖勻，37 ℃孵育15 min。加入2.5 mmol/L PNPG溶液20 μl，混勻，37 ℃孵育15 min，再加入0.2 mol/L碳酸鈉終止液80 μl，405 nm波長處測(cè)定吸光度。

2.4 麥冬提取物對(duì)α-淀粉酶的抑制活性測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)方法[11]，測(cè)定麥冬不同部位對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用：在EP管中依次加入0.1 mol/L PBS緩沖液（pH 6.8）50 μl，2 U/ml α-淀粉酶溶液10 μl，0.25 μg/ml供試品溶液20 μl，混勻，37 ℃孵育15 min。加入1 %可溶性淀粉溶液20 μl，混勻，37 ℃孵育15 min，再加入DNS試劑（稱取酒石酸鈉9.10 g，溶解于500 ml水，再加入DNS 0.35 g，氫氧化鈉2.00 g，苯酚0.25 g，無水硫酸鈉0.25 g，溶解并加水定容至100 ml）100 μl，沸水浴10 min，540 nm波長處測(cè)定吸光度。

為消除供試品和底物對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，以PBS代替供試品，檢測(cè)供試品和底物的吸光度。按下式計(jì)算α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性抑制率。

式中，A1為無抑制劑時(shí)吸光度；A2為加入抑制劑時(shí)吸光度；A3為底物背景吸光度；A4為供試品背景吸光度。

2.5 糖尿病小鼠模型的建立

將小鼠禁食（不禁水）約12 h后，腹腔注射50 mg/kg鏈脲佐菌素（0.2 ml/只），5 d后禁食（不禁水）12 h，尾靜脈采血測(cè)血糖值，血糖值大于11.1 mmol/L的小鼠為實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠?？瞻捉M小鼠給予等量生理鹽水。

2.6 血糖的檢測(cè)

按血糖值均勻分組為模型組和給藥組，每組10只。給藥組小鼠灌胃給予麥冬水提物（4 g/kg·d-1），模型組和空白組給予等量生理鹽水。連續(xù)灌胃30 d，末次給藥前禁食（不禁水）12 h，尾靜脈采血測(cè)血糖值。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用Excel 2010、Graphpad prism 8.0和SPSS 22.0軟件進(jìn)行組間比較，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 麥冬提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性

麥冬各部位對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。由圖1可見，水提物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性最高，其他提取物的抑制活性依次為70 %乙醇提取物＞ 正丁醇部位＞石油醚部位＞二氯甲烷部位＞乙酸乙酯部位。水提物的抑制作用顯著高于乙酸乙酯部位（P＜0.001）和二氯甲烷部位（P＜0.05）。

圖1 麥冬提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

3.2 麥冬提取物對(duì)α-淀粉酶的抑制活性

結(jié)果見圖2。由圖2可見，麥冬各部位的抑制能力有顯著差異，抑制活性大小依次為水提物＞乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞二氯甲烷部位＞70 %乙醇提取物＞ 石油醚部位。結(jié)果表明水提物對(duì)α-淀粉酶的抑制活性最高，顯著高于70 %乙醇提取物（P＜0.01）、二氯甲烷部位（P＜0.05）和石油醚部位（P＜0.001）。

圖2 麥冬提取物對(duì)α-淀粉酶的抑制作用

3.3 麥冬提取物對(duì)糖尿病小鼠血糖的影響

結(jié)果見圖3。由圖3可見，麥冬水提物給藥4周后，能顯著降低糖尿病小鼠空腹血糖（P＜0.05）。

圖3 麥冬提取物對(duì)糖尿病小鼠血糖的影響

4 討論

目前，治療糖尿病的藥物主要為雙胍類、磺酰脲類和胰島素，但長期服用都有較大的副作用[12]，亟需研究更為安全可靠的糖尿病治療藥物和臨床治療方案。淀粉在人體內(nèi)接觸α-淀粉酶后被水解為寡糖，再經(jīng)小腸的α-葡萄糖苷酶作用分解為單糖，最終經(jīng)小腸吸收進(jìn)入血液循環(huán)[13]。因此，α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶為糖代謝關(guān)鍵酶，是控制餐后血糖的重要靶標(biāo)[14]。針對(duì)以上酶的抑制劑可有效控制糖尿病血糖。

已有研究發(fā)現(xiàn)麥冬總皂苷、水提物和總多糖能顯著降低四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病動(dòng)物模型血糖水平[15]，但對(duì)麥冬不同部位的降糖作用對(duì)比研究較少。本工作首先篩選了能抑制糖代謝關(guān)鍵酶的麥冬活性部位，再采用糖尿病動(dòng)物模型驗(yàn)證了該活性部位的降血糖作用。研究發(fā)現(xiàn)麥冬水提物對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性抑制作用均最強(qiáng)，乙酸乙酯部位α-葡萄糖苷酶抑制活性最弱，石油醚部位α-淀粉酶抑制作用最弱，可能的原因是麥冬水提物中含大量多糖類成分[16]。多糖是麥冬降血糖的主要活性成分，能抑制α-葡萄糖苷酶活性[17]，降低鏈脲佐菌素誘發(fā)糖尿病大鼠血糖[18]，進(jìn)而保護(hù)胰島β細(xì)胞功能。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了麥冬水提物對(duì)糖尿病小鼠有顯著的血糖控制作用，為麥冬的降血糖功能提供依據(jù)，同時(shí)為麥冬后續(xù)開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。