仲瑞雪，季 歐，吳傳紅，段小云

（四川省骨科醫(yī)院，四川 成都 610041）

深靜脈血栓（deep venous thrombosis，DVT）是一種較常見的周圍血管疾病，好發(fā)于下肢，如治療不當，常引發(fā)患者肺部梗塞，嚴重者將危及生命[1-2]。相關(guān)研究表明，在無預(yù)防措施前提下，普通外科手術(shù)后患者發(fā)生DVT概率是10 %～40 %[3-4]。中醫(yī)學認為DVT屬于“股腫”“腫脹”“血瘀”等范疇，本病的主要病機特點是濕、熱、瘀相互影響，常見的分型有濕熱下注、氣滯血瘀等。中藥治療DVT具有臨床效果好、副作用小、適合長期服用等優(yōu)勢[5-6]。因此，本研究通過數(shù)據(jù)挖掘及網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，分析總結(jié)中藥治療DVT的用藥特點及核心藥物的潛在作用機制，為DVT的臨床用藥及新藥研發(fā)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 處方來源與篩選

檢索2015～2020年CNKI數(shù)據(jù)庫中收錄的關(guān)于“中藥”“深靜脈血栓”等關(guān)鍵詞的處方，根據(jù)《深靜脈血栓形成的診斷和治療指南》（第三版）[7]中對DVT的診斷標準，剔除不合格處方。

1.2 中藥名稱的規(guī)范

根據(jù)《中國藥典》[8]及《中藥學》[9]中規(guī)范的藥物命名，對有效處方中藥名進行梳理、規(guī)范。例如將處方中的“元胡”統(tǒng)一為“延胡索”，“將軍”統(tǒng)一為“大黃”等。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用雙人核對制度將處方錄入中醫(yī)傳承輔助平臺（V2.5）（由中國中醫(yī)科學院中藥研究所研發(fā)），建立數(shù)據(jù)庫。運用平臺“數(shù)據(jù)分析”模塊下選項，對處方進行頻次統(tǒng)計、組方規(guī)律分析、關(guān)聯(lián)規(guī)則分析及新方分析等。

1.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學研究

采用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）篩選有效成分及靶點，并與人類基因綜合分析數(shù)據(jù)庫（GeneCards）、美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫（NCBI）及在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM）中DVT的靶點相映射并取交集，作為治療DVT的潛在靶點。將上述靶點導入String數(shù)據(jù)庫中，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI），篩選出關(guān)鍵靶點，并進行基因本體論（GO）生物過程分析及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 頻次分析

本研究共納入有效處方106首，其中包含120味藥物，使用頻次≥30的有14味，排前3位的分別是當歸＞黃芪＞紅花，見表1。

表1 治療DVT藥物使用情況（頻次≥30）

2.2 歸經(jīng)分布

預(yù)防DVT常用藥味歸經(jīng)分布多數(shù)為歸肝、心、脾經(jīng)，見表2。

表2 藥物歸經(jīng)分析

2.3 組方規(guī)律

對數(shù)據(jù)預(yù)處理后，將支持度設(shè)為30，置信度設(shè)為0.70，得到常見藥對組合。前3位分別是“紅花→當歸”、“黃芪→當歸”及“川芎→當歸”，見表3、表4。通過網(wǎng)絡(luò)化展示其關(guān)聯(lián)規(guī)律。其中紅花、當歸、黃芪等居于網(wǎng)絡(luò)圖中心位置，與常用藥味組合吻合，見圖1。

表3 處方中高頻藥物組合

表4 處方中藥物組合關(guān)聯(lián)規(guī)則（置信度≥0.70）

圖1 關(guān)聯(lián)規(guī)則網(wǎng)絡(luò)化展示（支持度≥30 %，置信度≥0.70）

2.4 基于復(fù)雜系統(tǒng)熵聚類分析

設(shè)相關(guān)度=7，懲罰度=2，進行基于復(fù)雜系統(tǒng)熵的聚類分析，得到藥味的常用組合，見表5。

表5 基于復(fù)雜系統(tǒng)熵聚類分析得到的常用藥物組合

2.5 基于無監(jiān)督的熵層次聚類分析

以2.4項下常用藥味組合為研究對象，選擇“聚類”選項下“提取新方組合”，共推薦10個層次聚類核心藥物組合；再進一步選擇“聚類”選項，得到5個推薦新方，見表6、表7；并得出網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)圖，見圖2。

圖2 治療DVT的新方藥物網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)圖

表6 基于無監(jiān)督的熵層次聚類分析得到的核心藥物組合

表7 基于無監(jiān)督的熵層次聚類分析得到的新方組合

2.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學研究

2.6.1 活性成分及作用靶點的篩選 通過TCMSP檢索當歸、黃芪及紅花的化合物成分（OB≥30 %，DL≥0.18）及靶點預(yù)測，再經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)校正，去掉非人類靶點及刪重后，當歸獲得2個化合物成分，51個靶點；黃芪獲得20個化合物成分，194個靶點；紅花獲得22個化合物成分，203個靶點。

2.6.2 藥物-疾病共同靶點交集 以“Deep venous thrombosis”為關(guān)鍵詞，在GeneCards，NCBI及OMIM數(shù)據(jù)庫進行人類基因檢索。將3個數(shù)據(jù)庫的基因合并刪重，共得到1783個DVT相關(guān)基因。輸入Venny 2.1軟件制作韋恩圖，得到136個共有靶點，見圖3。

圖3 藥物-疾病交集靶點韋恩圖

2.6.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將共有靶點輸入String數(shù)據(jù)庫，生物種類設(shè)為“Homo sapiens”，得到136個節(jié)點，2808條邊，平均度值為41.3，運用Cytoscape軟件繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）圖，見圖4。將PPI網(wǎng)絡(luò)導入Cystoscape 3.8.0中，通過NetworkAnalyzer工具進行拓撲分析，通過degree排序，共篩選出個64關(guān)鍵靶點，將前20個靶點使用R4.0.3繪圖，見圖5。

圖4 關(guān)鍵靶點 PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖5 關(guān)鍵靶點信息條形圖

2.6.4 成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 以納入的成分、治療疾病及作用靶點為基礎(chǔ)，通過cytoscape 3.8.0構(gòu)建了成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6。

圖6 成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.6.5 GO富集分析 將藥物疾病共有靶點進行GO的生物過程、分子功能、細胞組分富集，引用String數(shù)據(jù)庫，以P＜0.05為篩選條件，共富集到2270條生物過程，141項分子功能相關(guān)，55項細胞組成相關(guān)，見圖7。

圖7 關(guān)鍵靶點基因生物功能注釋信息圖

2.6.6 KEGG富集分析 將藥物疾病共有靶點進行KEGG通路富集分析，引用String數(shù)據(jù)庫，以 P＜0.05為篩選條件，共富集到162條信號通路，見圖8。

圖8 關(guān)鍵靶點KEGG通路富集分析

2.6.7 成分-疾病-通路-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將成分-疾病-通路-靶點網(wǎng)絡(luò)文件導入Cytoscape 3.8.0進行通路網(wǎng)絡(luò)圖的繪制，更直觀地展示中藥活性成分在治療DVT中的多成分-多靶點的作用特點。

3 討論

本研究納入近年治療DVT的方劑106首，包括120味中藥，其中使用頻次≥30的有14味。中藥治療DVT多以活血化瘀、清熱利濕為主，輔以補血活血、補氣益氣及清熱涼血。核心藥對為“當歸-黃芪-紅花”。當歸功擅補血活血，為養(yǎng)血之要藥，黃芪甘溫補氣，使氣血充足、血行通暢，紅花有活血祛瘀之功。三者合用通中有補，溫涼并濟，攻補兼顧，具有活血祛瘀生新之功效，使營衛(wèi)恢復(fù)周流無阻，與DVT形成的基本病機相吻合。

圖9 成分-疾病-通路-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

以“當歸-黃芪-紅花”藥對作為研究對象，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學，通過TCMSP、Geencards、NCBI、OMIM、String等數(shù)據(jù)庫結(jié)合Cytoscape 軟件挖掘核心藥對配伍治療DVT的內(nèi)在機制。得到核心藥對與疾病前十位共同靶點分別是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、白蛋白（ALB）、白介素6（IL-6）、半胱氨酸肽酶（CASP3）、宿主的原癌基因（JUN）、白介素1β（IL-1β）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、誘導線粒體蛋白抗體（MYC）、缺氧誘導因子1α（HIF1A）、人表皮生長因子受體（EGFR）。研究表明，AKT1通過磷酸化底物蛋白激活下游信號級聯(lián)反應(yīng)，參與調(diào)控多個相關(guān)基因家族轉(zhuǎn)錄，影響細胞生長、存活、增殖、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成、細胞遷移運動等[10]。IL-6能激活血小板，增加其促凝活性，促進血栓的形成[11]。核心藥對治療DVT的主要活性成分為：槲皮素、木犀草素、山奈酚等。槲皮素是一種多醇羥基黃酮類化合物，有文獻報道其能抑制血小板聚集及血小板致密顆粒胞吐作用，降低血液的黏滯程度，延遲血栓的形成[12]。木犀草素是一種天然的黃酮類化合物，可通過提高凝血活性物質(zhì)的含量，促進凝血因子的基因表達量，提高凝血因子的含量，抑制纖維酶原的激活和增加血液的黏度等多方面的綜合作用維持機體血液循環(huán)功能的穩(wěn)定[13]。山奈酚是一種黃酮類化合物。山奈酚能抑制纖維蛋白聚合物的形成，減弱凝血酶刺激血小板中細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2等酶的磷酸化，延遲凝血時間[14]。這3種有效成分在成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)中作用的靶點多，度值較高，具有抗凝、抗炎、溶栓的藥理作用。GO富集分析結(jié)果顯示，核心藥對治療DVT的生物過程有氧化應(yīng)激反應(yīng)、細胞對化學應(yīng)激的反應(yīng)、細胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)等；其分子功能參與了DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶II特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合及泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等。

綜上，槲皮素、木犀草素和山奈酚等為治療DVT的重要有效成分，可通過作用于AKT1、ALB、IL-6等關(guān)鍵靶點和參與PI3K-Akt信號通路、AGERAGE 信號通路、IL-17信號通路等通路等達到治療DVT的作用。本文運用數(shù)據(jù)挖掘及網(wǎng)絡(luò)藥理學方法為臨床治療DVT提供可借鑒的中藥配伍，闡明核心藥物的作用機制，為下一步實驗研究奠定理論基礎(chǔ)。