侯秋苑,馮白茹,殷 蕾,申 茹
(惠州衛(wèi)生職業(yè)技術學院,廣東 惠州 516025)
菟絲子顆粒為菟絲子的單方顆粒劑。菟絲子味甘、辛,性平,是常用的補益中藥,具有補益肝腎,明目,固精縮尿,安胎及止瀉等功效[1-3]。現(xiàn)代藥理學研究表明,菟絲子提取物具有補腎、護肝、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗疲勞、安胎、改善卵巢早衰及生殖保護等作用,并提示其有效成分為黃酮類物質(zhì)[4-10]。為保證藥品質(zhì)量,保障人體用藥安全,本文對菟絲子顆粒的制備工藝和質(zhì)量標準進行了研究。
JA3003電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司);ZF-7型暗箱三用紫外分析儀(上海和勤分析儀器有限公司);Agilent 1260高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司);PS-40A超聲波清潔機(深圳市科潔超聲科技有限公司);SHZD(III)型循環(huán)水真空泵(廣州市星爍儀器有限公司);RE-3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海越眾儀器設備有限公司);YK-60小型顆粒機(吉首市中誠制藥機械有限公司);BPG-9240A鼓風干燥箱(上海百典儀器設備有限公司)。
金絲桃苷對照品(含量≥98 %,批號:160201,北京世紀奧科生物技術有限公司);菟絲子顆粒(自制,批號:170701,170702,170703,170704,170705);聚酰胺薄膜(浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠);甲醇(色譜純,批號:20161020,天津市科密歐化學試劑有限公司);乙腈(色譜純,批號:160918,天津市科密歐化學試劑有限公司);其他試劑均為分析純。
采用高效液相色譜法(HPLC)測定[1,11-12]。色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動相:乙腈-0.1 %磷酸溶液(15:85);檢測波長:360 nm;柱溫:25 ℃;流速:1.0 ml/min;進樣量:10 μl。理論塔板數(shù)按金絲桃苷峰計算應不低于5000[1,11]。
2.2.1 提取工藝 取菟絲子,粉碎成中粉,加75 %乙醇浸泡50 min,加熱回流提取3次,每次1 h[13],合并提取液,濾過。
2.2.2 濃縮工藝研究 取菟絲子提取液50 ml,分別在減壓70 ℃、80 ℃、90 ℃,常壓90 ℃、100 ℃條件下濃縮至10 ml,過濾,濾液按2.1項下色譜條件進樣測定,結(jié)果見表1。結(jié)果顯示,不同濃縮條件下濃縮液中金絲桃苷含量變化不大,考慮到濃縮效率及成本,最終選擇在減壓80 ℃環(huán)境下對提取液進行濃縮。
表1 濃縮條件考察結(jié)果
取菟絲子提取液,減壓80 ℃濃縮,在濃縮過程中認真觀察菟絲子濃縮液狀態(tài),濃縮至濃縮液黏稠且掛壁后及時從燒瓶內(nèi)轉(zhuǎn)移適量至100 ml量筒中,垂直放進密度計測定該菟絲子稠膏的相對密度為1.15。
綜上,確定菟絲子提取液的濃縮工藝為減壓80 ℃濃縮,濃縮至濃縮液呈黏稠狀且掛壁后測定其相對密度,測得相對密度在1.15(80 ℃)以上即可。
2.2.3 制劑成型工藝研究 取菟絲子提取濃縮液5.0 g,共6份,分別以常用輔料淀粉、乳糖、微晶纖維素、糊精、蔗糖、可溶性淀粉和糖粉制備顆粒,以顆粒流動性、引濕性及成型率[14]為主要考察指標,結(jié)果見表2。
表2 輔料種類考察結(jié)果
由表2可見,只有乳糖與糖粉的成型性符合制粒要求,但用量大且流動性不佳,其余4種輔料制得的顆粒細粉多或不成粒,均未達到制粒要求,綜合考慮下選用淀粉、乳糖、微晶纖維素和糊精這4種輔料進行后續(xù)的復合配比研究,結(jié)果見表3。
由表3可見,微晶纖維素:乳糖為1:5時所得顆粒硬度適中,成型率高,流動性及引濕性好,最終確定菟絲子顆粒輔料為微晶纖維素、乳糖,微晶纖維素:乳糖=1:5,經(jīng)驗證,菟絲子濃縮液與混合輔料的比例確定為1:2.5。
表3 輔料配比考察結(jié)果
2.2.4 制備工藝 取菟絲子,粉碎成中粉,加75 %乙醇浸泡50 min,加熱回流提取3次,每次1 h,合并提取液,濾過,濾液80 ℃下減壓濃縮,得相對密對1.15的稠膏,加入輔料(微晶纖維素:乳糖=1:5),混合均勻,制成顆粒,干燥,即得。
2.3.1 薄層色譜(TLC)鑒別[1,11]
2.3.1.1 對照品溶液的制備 取金絲桃苷對照品2 mg,精密稱定,置入100 ml量瓶,加甲醇制成濃度為0.02 mg/ml的溶液,作為對照品溶液。
2.3.1.2 供試品溶液的制備 取本品0.5 g,加甲醇40 ml,加熱回流30 min,濾過,濾液蒸干,殘渣加甲醇5 ml使溶解,作為供試品溶液。
2.3.1.3 陰性樣品溶液的制備 取不含菟絲子稠膏的空白輔料顆粒0.5 g,按2.3.1.2項下方法制成菟絲子顆粒陰性樣品溶液。
2.3.1.4 TLC條件及結(jié)果 分別吸取供試品溶液、對照品溶液和陰性樣品溶液各1~2 μl,分別點于同一聚酰胺薄膜上,以甲醇-冰醋酸-水(9:0.5:0.5)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以三氯化鋁試液,置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中,在與對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的熒光斑點,陰性樣品在相應位置上不顯示熒光斑點(見圖1),表明輔料對TLC鑒別無干擾。
圖1 菟絲子顆粒TLC圖譜
2.3.2 含量測定
2.3.2.1 色譜條件[1,11-12]同2.1項下色譜條件。
2.3.2.2 對照品溶液的制備 取金絲桃苷對照品5 mg,精密稱定,置入100 ml量瓶,加甲醇制成每1 ml含50 μg的溶液,即得。
2.3.2.3 供試品溶液的制備 取菟絲子顆粒適量,研細,取約1 g,精密稱定,置于50 ml量瓶中,加入75 %乙醇40 ml,超聲處理(功率240 W,頻率40 kHz)15 min,放冷,加75 %乙醇至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液。
2.3.2.4 陰性樣品溶液的制備 取不含菟絲子稠膏的空白輔料顆粒適量,研細,取約0.5 g,精密稱定,置于50 ml量瓶中,加入75 %乙醇40 ml,超聲處理(功率240 W,頻率40 kHz)15 min,放冷,加75 %乙醇至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液作為菟絲子顆粒的陰性樣品溶液。
2.3.2.5 專屬性試驗 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μl,按2.1項下色譜條件進樣測定,記錄色譜圖,結(jié)果見圖2。供試品溶液的色譜圖中,在與對照品溶液的色譜圖相應的位置上,有相同保留時間的色譜峰,而陰性樣品溶液在此保留時間處無色譜峰,表明輔料對金絲桃苷的HPLC檢測無干擾。
圖2 菟絲子顆粒中金絲桃苷含量測定的HPLC圖譜
2.3.2.6 標準曲線繪制 精密稱取金絲桃苷對照品10.00 mg,置10 ml量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對照品儲備溶液。精密量取對照品儲備溶液0.10,0.20,0.50,1.00,5.00 ml,分別置入10 ml量瓶,加甲醇稀釋至刻度,配制成濃度為0.01,0.02,0.05,0.10,0.50 mg/ml的金絲桃苷對照品溶液。分別精密吸取上述溶液各10 μl,按2.1項下色譜條件進樣測定,以金絲桃苷對照品的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標,峰面積(Y)為縱坐標,繪制標準曲線,得到回歸方程:Y=19 817X-14.351,r=1.0000。結(jié)果表明金絲桃苷進樣濃度在0.01~0.50 mg/ml的范圍內(nèi),線性關系良好。
2.3.2.7 精密度試驗 精密吸取供試品(批號:170703)溶液10 μl,按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次,測得金絲桃苷峰面積的RSD為0.26 %(n=6),說明儀器精密度良好。
2.3.2.8 重復性試驗 取同一批供試品(批號:170703)的細粉6份,各約1.0 g,精密稱定,按2.3.2.3項下方法制成供試品溶液,按2.1項下色譜條件測定,測得金絲桃苷的平均含量為3.54 mg/g,RSD為0.91 %(n=6),說明方法重復性良好。
2.3.2.9 穩(wěn)定性試驗 精密吸取2.3.2.3 項下供試品(批號:20170703)溶液10 μl,按2.1項下色譜條件,分別于0,2,4,6,8,10,12 h進樣測定,測得金絲桃苷峰面積的RSD為0.34 %(n=7),說明供試品溶液12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.3.2.10 加樣回收試驗 取已知含量的同一顆粒樣品(批號:170703)的細粉9份,每份約0.2 g,精密稱定,置于10 ml量瓶中,按表4準確加入金絲桃苷對照品溶液(1.03 mg/ml)后,加入75 %乙醇40 ml,超聲處理(功率240 W,頻率40 kHz)15 min,放冷,加75 %乙醇至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液。按2.1項下色譜條件測定金絲桃苷含量并計算加樣回收率,結(jié)果見表4。
表4 加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)
2.3.2.11 樣品含量測定 取批號為170701,170702,170703,170704,170705的菟絲子顆粒各1袋,按2.3.2.3項下方法制得供試品溶液,按2.1項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積,按回歸方程計算金絲桃苷的含量,結(jié)果見表5。
表5 供試品含量測定結(jié)果(n=2)
研究發(fā)現(xiàn),以淀粉為輔料制備的顆粒細粉多,以糊精為輔料制備的顆粒黏性強;以糖粉為輔料,制得的顆粒符合要求,但輔料用量大。采用微晶纖維素與乳糖(1:5)為輔料,用量符合要求,制得的顆粒成型且硬度適中,流動性較好,幾乎沒有引濕性,成型率最高,最終選擇微晶纖維素與乳糖的復合輔料作為菟絲子顆粒的輔料。
首先采用2020年版《中國藥典》一部菟絲子鑒別項下規(guī)定的展開系統(tǒng)甲醇-冰醋酸-水(4:1:5)對顆粒進行TLC鑒別,結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品主斑點拖尾情況嚴重,考慮可能是樣品的點樣量過大,減少樣品點樣量后采用同樣的展開系統(tǒng)展開,發(fā)現(xiàn)除了斑點的熒光顏色變淡外,拖尾情況無改善,經(jīng)分析可能是展開系統(tǒng)的極性偏大。調(diào)整展開劑比例,對以下展開系統(tǒng)進行篩選:甲醇-冰醋酸-水(5:1:4)、甲醇-冰醋酸-水(6:1:3)、甲醇-冰醋酸-水(7:1:2)、甲醇-冰醋酸-水(9:0.5:0.5)、甲醇-冰醋酸(9:1)、乙醇-水(3:1)及甲醇,最后發(fā)現(xiàn)甲醇-冰醋酸-水(9:0.5:0.5)的展開效果最佳。
首先參考2020年版《中國藥典》一部菟絲子含量測定項下的色譜條件進行測定,結(jié)果金絲桃苷的分離度不符合要求,考慮可能是流動相極性因素影響,調(diào)整流動相比例為乙腈:0.1 %磷酸=15:85,此條件下金絲桃苷的分離度大于1.5。
對供試品溶液的提取溶劑(75 %乙醇,80 %乙醇,甲醇)和提取時間(超聲處理15,30,45,60 min)進行考察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)75 %乙醇的提取效果明顯優(yōu)于甲醇和80 %乙醇,超聲15 min金絲桃苷的提取率可達95 %以上,故確定提取條件為75 %乙醇超聲時間15 min。
根據(jù)5批菟絲子顆粒的含量測定結(jié)果,平均每克顆粒含金絲桃苷3.40 mg。結(jié)合現(xiàn)行版《中國藥典》中菟絲子藥材中金絲桃苷的含量不得少于0.10 %,以及考慮制劑生產(chǎn)和貯存等因素,暫定菟絲子顆粒中每克含金絲桃苷不得少于1.0 mg。