張 毅，周洪旭，孟大利，侯立新*

（1. 重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 400000；2. 沈陽藥科大學 中藥學院，遼寧 沈陽 110016）

中藥的質(zhì)量控制對中藥的安全性和有效性具有重要意義。標準物質(zhì)是中藥定性和定量分析的重要依據(jù)。隨著中藥質(zhì)量控制的發(fā)展，對標準物質(zhì)的需求越來越大，而中藥對照品由于其提取分離困難、成本高昂、不穩(wěn)定等諸多因素，極大地影響了中藥質(zhì)量標準的建立和發(fā)展[1]。因此，建立中藥標準物質(zhì)替代測定法是解決以上問題的有效途徑之一。目前已開發(fā)的標準物質(zhì)替代測定法包括校正因子法[2]、一測多評法（quantitative analysis of multicomponents by single marker，QAMS）[3-4]、替代對照品法[5]、雙標線性校正法（linear calibration using two reference substances，LCTRS）[6-10]等。雙標線性校正法是用兩個對照品進行色譜峰定位，顯著提高了定位的準確度和色譜柱的適用性。

川黃芩為唇形科植物滇黃芩Scutellaria amoena C. H. Wright、連翹葉黃芩Scutellaria hypericifolia Levl.或韌黃芩展毛變種Scutellaria tenax W. W.Smith Var. patentipilosa (Hand. Mazz.) C. Y. Wu的干燥根。性味苦寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效[11]?，F(xiàn)代植物化學研究發(fā)現(xiàn)，川黃芩中主要成分為黃酮及黃酮苷類化合物、二氫黃酮及二氫黃酮醇類化合物、木質(zhì)素、酚苷、醇苷類化合物等[12-13]。已報道黃酮類成分主要包括黃芩苷、漢黃芩苷、千層紙素A、漢黃芩素、黃芩素等。黃芩苷為川黃芩主要化學成分，現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷具有抗氧化及清除自由基[14]、抗病毒[15-16]、抗腫瘤[17]、對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護[18]、保肝[19]、調(diào)節(jié)脂代謝[20]等藥理作用。

川黃芩現(xiàn)有質(zhì)量標準（2015年版四川省中藥飲片炮制規(guī)范）中還未有定性鑒別內(nèi)容，因此本研究采用雙標線性校正法對川黃芩中5個成分進行定性鑒別，填補了川黃芩質(zhì)量標準研究的空白。與相對保留時間法比較，雙標線性校正法的預測精度更高，適用的色譜柱范圍更廣，明顯優(yōu)于相對保留時間法。雙標線性校正法的建立可為后續(xù)川黃芩的質(zhì)量標準研究提供參考和依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260 Infinity II高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；Waters e2695-2998 PAD高效液相色譜儀（沃特世科技有限公司），3臺儀器依次稱為LC1～LC3。KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DP-02無油真空泵（天津市富城達科技有限公司）；ME204T/02萬分之一天平（梅特勒-托利多公司）；Mill-Q Synergy型超純水儀器（默克密理博公司）；HWS-26型恒溫水浴鍋（上海精密儀器有限公司）。色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）信息見表1。

表1 色譜柱信息

1.2 藥品與試劑

黃芩苷對照品（批號：110715-201720，含量：93.5 %，中國食品藥品檢定研究院）；黃芩素對照品（批號：111595-200905，含量：98.5 %，中國食品藥品檢定研究院）；漢黃芩苷（批號：111595-200905，含量：98.5 %，中國食品藥品檢定研究院）；千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（批號：F306-PS011092，含量：98.0 %，成都普思生物科技股份有限公司）；乙腈（色譜純，安徽時聯(lián)特種溶劑股份有限公司）；甲醇（色譜純，安徽時聯(lián)特種溶劑股份有限公司）；去離子水為經(jīng)Millipore超純水制備系統(tǒng)自制；三氟乙酸（分析純，Sigma-Aldrich）；甲醇（分析純，重慶川東化工集團有限公司）。3批川黃芩藥材采集于四川、云南等地，經(jīng)重慶市食品藥品檢驗檢測研究院中藥室張毅副研究員鑒定為唇形科植物滇黃芩Scutellaria amoena C.H. Wright的干燥根。取干燥根適量，烘干至恒重，粉碎過篩，備用。

1.3 軟件

數(shù)字化標準物質(zhì)大數(shù)據(jù)平臺（DRS Origin軟件）V1.0（中國食品藥品檢定研究院）。

2 方法

2.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：以甲醇為流動相A，以0.1 %三氟乙酸溶液為流動相B，進行梯度洗脫（0～20 min，37 %A→39 %A；20～35 min，39 %A→45 %A；35～42 min，45 %A；42～50 min，45 %A→58 %A；50～58 min，58 %A；58～68 min，58 %A→80 %A；68～68.1 min，80 %A→90 %A；68.1～70 min，90 %A）；檢測波長：280 nm；流速：1.0 ml/min；進樣量：10 μl；柱溫：30 ℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 取黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、黃芩素對照品適量，精密稱定，置于100 ml量瓶中，加甲醇制成黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、黃芩素含量分別為106.2，117.5，25.2，49.7 μg/ml的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品，干燥粉碎，過4號篩，稱取粉末約0.3 g，精密稱定，加70 %乙醇40 ml，加熱回流3 h，放冷，濾過，濾液置100 ml量瓶中，用少量70 %乙醇分次洗滌容器和殘渣，洗液濾入同一量瓶中，加70 %乙醇至刻度，搖勻。精密量取5 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度搖勻，過濾即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 精密吸取2.2.1項下混合對照品溶液10 μl，連續(xù)進樣6針，對4個對照品色譜峰的保留時間和峰面積進行統(tǒng)計，結(jié)果表明各對照品的保留時間和峰面積積分值的RSD均小于2.0 %，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取樣品，按2.2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，精密吸取10 μl，注入液相色譜儀，測定。對4個成分色譜峰的保留時間和相對含量進行統(tǒng)計，試驗結(jié)果表明各成分的保留時間和含量的RSD均小于2.0 %，表明重復性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取樣品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液10 μl，注入液相色譜儀，測定。對4個成分色譜峰的保留時間和峰面積進行統(tǒng)計，共考察24 h，以觀察供試品溶液在檢測過程中待測成分的穩(wěn)定性。結(jié)果表明各成分的保留時間和含量的RSD均小于2.0 %，表明待測成分穩(wěn)定性良好。

2.4 色譜柱耐用性試驗

分別在20根色譜柱上進行耐用性考察，其中在Col 10上出現(xiàn)缺峰現(xiàn)象（缺少黃芩苷峰前的未知峰），其余19根色譜柱上各成分分離度良好，異常結(jié)果見圖1。

圖1 正常色譜圖與異常色譜圖

2.5 雙標線性校正法定性研究

將采集的色譜數(shù)據(jù)導入DRS Origin軟件，通過關(guān)聯(lián)對照品，設(shè)定雙標化合物，進行雙標線性校正法分析，得到保留時間回歸偏差、保留時間預測正確率和色譜柱符合率。同時，與相對保留時間法進行優(yōu)劣比較。

3 結(jié)果與討論

在不同的C18色譜柱上，各個物質(zhì)的保留時間具有線性關(guān)系[8-9]。通過采用對照品的保留時間進行色譜峰定位得到樣品實際保留時間，以19根色譜柱得到的實際保留時間的算數(shù)平均值作為預測標準保留時間（standard retention time, SRT）。以5種成分的SRT為橫坐標（X），分別為黃芩苷（32.08 min）、峰2（42.88 min）、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（45.81 min）、漢黃芩苷（47.54 min）、黃芩素（55.09 min）；以實際保留時間為縱坐標，得到在各色譜柱上SRT與實際保留時間的擬合結(jié)果，各色譜柱的線性方程和相關(guān)系數(shù)見表2。由表2可見，上述5個成分在19根色譜柱上，SRT與實際保留時間線性關(guān)系良好（r＞0.99）。

表2 不同色譜柱保留時間的線性方程及相關(guān)系數(shù)

3.1 雙標選擇與優(yōu)化

以DRS Origin軟件為平臺，得到保留時間的雙標線性校正結(jié)果，通過軟件內(nèi)部的數(shù)據(jù)分析篩選出了10種雙標選擇方案，其中峰1和峰5組合預測正確率和色譜柱符合率均為100 %。按雙標化合物選擇盡量分布在保留時間區(qū)域兩端的原則[9-10]，選擇峰1（黃芩苷）和峰5（黃芩素）為雙標化合物，雙標線性校正法示意圖見圖2。

圖2 雙標線性校正法示意圖

以雙標化合物（黃芩苷和黃芩素）的SRT為橫坐標，實際保留時間（以Col 7為例，黃芩苷27.91 min，黃芩素52.91 min）為縱坐標，得到線性擬合方程：Y=1.1144X-12.1613，然后將其余3個成分的SRT值代入方程，得到峰2、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷的保留時間偏差的絕對值依次為0.202，0.422，0.296 min，滿足定性條件下SRT與實測保留時間的誤差應不超過1 min的要求，說明該雙標化合物的選擇在Col 7上預測效果良好。

3.2 雙標線性校正法與相對保留時間法的對比

對雙標線性校正法與相對保留時間法在川黃芩液相色譜中定性的優(yōu)劣進行比較。雙標線性校正法以黃芩苷和黃芩素為雙標化合物，相對保留時間法以千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷為參照物，兩種方法對保留時間的預測結(jié)果見表3。由表3可見，雙標線性校正法的保留時間預測值的絕對偏差波動范圍較小，且絕對偏差較低，明顯優(yōu)于相對保留時間法。

表3 雙標線性校正法與相對保留時間法保留時間絕對偏差比較

3.3 樣品分析

按2.2.2項下方法，取3批川黃芩藥材制備供試品溶液，用2根新的色譜柱（Col 21，Col22）進行檢測，將數(shù)據(jù)格式文件導入DRS Origin軟件中，加載已建立的方法體系，提取雙標保留時間，并利用軟件功能對目標物進行保留時間預測。同時也用相對保留時間法處理數(shù)據(jù)。對雙標線性校正法預測結(jié)果和相對保留時間法結(jié)果進行比較分析，結(jié)果3批樣品的雙標線性校正法檢測結(jié)果均滿足要求（ΔtR＜1 min），說明該體系可進行實際應用。見表4。

表4 雙標線性校正法和相對保留時間法在新色譜柱上保留時間絕對偏差比較

4 結(jié)論

本研究采用雙標線性校正法建立川黃芩的多組分定性鑒別方法，能快速、準確地定位川黃芩中5個成分。與相對保留時間法進行比較，雙標線性校正法的預測精度更高，適用的色譜柱數(shù)量更多，明顯優(yōu)于相對保留時間法。本研究采用的雙標組合，綜合考慮了色譜柱適用率和預測準確度等因素，最終選擇了黃芩苷和黃芩素兩個位于色譜峰兩端的色譜峰作為雙標參照物，同時也滿足廉價易得等優(yōu)勢。但目前，由于整個研究還處在試驗階段，下一步的應用和推廣還有很多亟待解決的問題。