曾敏芳，包海鷹※，宋超，趙卉，畢融冰

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130112）

黑木耳是擔(dān)子菌門(mén)Basidiomycota 蘑菇綱Agaricomycetes 木耳目Auriculariales 木耳科Auriculariaceae、木耳屬Auricularia 黑木耳Auricularia heimuer F.Wu et al 的子實(shí)體，性平，味甘；歸胃、大腸經(jīng)；具有滋陰潤(rùn)肺、養(yǎng)胃潤(rùn)腸和血止血的功效，主治虛勞咳嗽、痰中帶血、胃腸燥熱、口干便秘、血瘀積聚、月經(jīng)不調(diào)和崩漏便血等[1]。黑木耳又名木耳、木蛾、木菌、樹(shù)雞、云耳、耳子、黑菜、細(xì)木耳和光木耳等，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源膠質(zhì)真菌[2,3]。

麥角甾醇（ergosterol）又稱麥角固醇，是真菌類的特征甾醇，能促進(jìn)人體對(duì)鈣、磷的吸收，是人體外源性維生素D2的良好來(lái)源之一[4]，常被用以改善嬰幼兒及高齡人群缺乏維生素D 而導(dǎo)致的佝僂病、軟骨病和骨質(zhì)疏松癥[5]。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)從蒙古口蘑中提取的麥角甾醇具有顯著的抗腫瘤活性[6]，此外麥角甾醇還具有增強(qiáng)人體免疫力、抗炎鎮(zhèn)痛[7]、抗血小板聚集[8]、降低膽固醇[9]、抗纖維化、抗氧化和延緩衰老等多種藥理作用[10,11]。目前麥角甾醇已經(jīng)成為評(píng)價(jià)食藥用菌的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)之一[12]。

黑木耳不僅是百姓餐桌上的常見(jiàn)食用菌，而且還應(yīng)用于中藥制劑如產(chǎn)復(fù)康顆粒、骨疏康顆粒、骨疏康膠囊和妙濟(jì)丸中[12]，但黑木耳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未有活性成分指標(biāo)的評(píng)價(jià)，更多的是將黑木耳視為食品對(duì)其總糖、粗蛋白和粗纖維等營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)[13]，忽視了其藥用價(jià)值。為推動(dòng)黑木耳產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，多種成分和生物活性評(píng)價(jià)黑木耳勢(shì)在必行。本研究擬將麥角甾醇作為黑木耳質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)之一，目前麥角甾醇最常用的檢測(cè)方法主要參考地方標(biāo)準(zhǔn)DB44/T1991-2017 靈芝及其相關(guān)產(chǎn)品中麥角甾醇測(cè)定的高效液相色譜法[14,15]，關(guān)于超高效液相色譜法（UPLC）測(cè)定黑木耳麥角甾醇暫未見(jiàn)相關(guān)研究，因此本研究擬建立快速分析黑木耳中麥角甾醇含量的超高效液相色譜法，同時(shí)分析黑木耳麥角甾醇含量是否與性狀特征和膨脹度相關(guān)，為該藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

從全國(guó)不同省份的市場(chǎng)隨機(jī)購(gòu)買46 批黑木耳樣品，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)包海鷹教授鑒定均為黑木耳Auricularia heimuer F.Wu et al 的子實(shí)體。黑木耳市場(chǎng)價(jià)格差額大，在78～505 元/kg 之間，本次實(shí)驗(yàn)將黑木耳價(jià)格分為8 個(gè)等級(jí)，一級(jí)在80 元/kg 以內(nèi)，此后每一級(jí)加40 元，直至大于320 元/kg 的定義為8 級(jí)。具體信息見(jiàn)表1。

表1 黑木耳來(lái)源信息Table 1 The source information of Auricularia heimuer

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

游標(biāo)卡尺[香港杭泰（國(guó)際）集團(tuán)有限公司]，膨脹度測(cè)定管，ST07B 型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（上海樹(shù)立儀器儀表有限公司），ACQUITY 型超高效液相色譜儀（沃特世公司），Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（100 mm 2.1 mm，1.7m），MS204S 型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，KS-700XDS 型超聲儀（昆山潔力美超聲儀器有限公司），HC-3018 型高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），MX-S 型渦旋混勻器[大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司]，Milli-Q Advantage 型超純水器（密理博公司）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品與試劑

麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：J03D10R104657），無(wú)水甲醇（色譜純，默克股份兩合公司，批號(hào)：I1126907-101），乙腈[色譜純，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，批號(hào)：F21LAL202]，超純水。

2 方法

2.1 黑木耳性狀觀察

采用中藥鑒定方法中的性狀鑒定方法對(duì)46 份實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行性狀觀察，并記錄黑木耳干品的外觀特征。同時(shí)每份樣品用游標(biāo)卡尺測(cè)量10 個(gè)黑木耳的長(zhǎng)度和寬度，之后再將樣品放燒杯中加清水浸泡5 h 以上直至完全泡發(fā)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量泡發(fā)后的黑木耳的長(zhǎng)度，寬度與中間的厚度，泡發(fā)前和泡發(fā)后的樣品分別拍照記錄。

2.2 黑木耳膨脹度測(cè)定

先在膨脹度測(cè)定管中加入5 mL 水，再加入0.2 g（精確至0.000 1 g）粉碎過(guò)100 目篩的黑木耳粉末，用玻璃棒攪拌將粉末與水混合均勻，少量多次地加水，使黑木耳粉末充分被水浸潤(rùn)沉于測(cè)定管底部，并除去氣泡，最后定容至25 mL 膨脹度測(cè)定管刻度線，密塞，靜置。開(kāi)始1 h 內(nèi)每30 min 用玻璃棒充分?jǐn)嚢? 次，然后靜置4 h，讀取黑木耳粉末膨脹后的體積（mL），再靜置1h，如上讀數(shù)，至連續(xù)兩次讀數(shù)的差異不超過(guò)0.1mL為止。最后一次讀取的數(shù)值按公式S=V/W 計(jì)算，準(zhǔn)確至0.1，其中S為膨脹度，V為樣品膨脹后的體積（mL），W 為黑木耳的重量（g）。

2.3 麥角甾醇含量的測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm 2.1 mm，1.7m）；柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)282 nm，流動(dòng)相：乙腈：水（98:2）；流速0.5 mL/min；進(jìn)樣量2L；運(yùn)行時(shí)間5 min。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取20 mg（精確至0.000 01 g）麥角甾醇標(biāo)品于50 mL 容量瓶中，用無(wú)水甲醇配制成0.4 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密稱取0.5 g 粉碎（精確至0.000 1 g）過(guò)100 目篩的黑木耳粉末于50 mL離心管中，按照不同料液比1:10（g/mL）、1:20（g/mL）、1:50（g/mL）添加無(wú)水甲醇，再根據(jù)不同超聲時(shí)間（30min，60 min）進(jìn)行提取，7 000 r/min 離心6 min，過(guò)濾，將上清液用無(wú)水甲醇定容至25 mL。提取液經(jīng)0.22m 微孔有機(jī)相濾膜進(jìn)行UPLC 測(cè)定。根據(jù)峰面積確定提取效率。最后根據(jù)最佳提取條件對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行提取。

2.3.4 專屬性考察實(shí)驗(yàn) 分別將麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品、供試品溶液和提取溶劑無(wú)水甲醇經(jīng)0.22m 微孔有機(jī)相濾膜過(guò)濾后按2.3.1 色譜條件進(jìn)行測(cè)定分析。

2.3.5 線性考察 將0.4 mg/mL麥角甾醇儲(chǔ)備液用無(wú)水甲醇稀釋成0.08 mg/mL、0.04 mg/mL、0.02 mg/mL、0.008 mg/mL、0.004 mg/mL 和0.001 6 mg/mL 一系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按2.3.1 色譜條件分別進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，以麥角甾醇質(zhì)量濃度（X，mg/mL）對(duì)色譜峰峰面積（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.6 精密度實(shí)驗(yàn) 取濃度為0.02 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)品溶液按2.3.1 色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定保留時(shí)間和峰面積。

2.3.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取6 份46 號(hào)樣品0.5 g（精確至0.000 1 g），按照2.3.3 最佳實(shí)驗(yàn)方法制備供試品溶液并按照2.3.1 色譜條件測(cè)定6 份樣品中麥角甾醇的含量和保留時(shí)間。

2.3.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取制備好的1 號(hào)黑木耳供試品溶液，按照2.3.1 色譜條件分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h和24 h 進(jìn)行含量測(cè)定。

2.3.9 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 加入相當(dāng)于已知1 號(hào)樣品含量80%，100%和120%的濃度為0.4 mg/mL 的麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品，制備供試品溶液，按照2.3.1 色譜條件測(cè)定麥角甾醇含量，計(jì)算回收率和RSD 值。

2.3.10 樣品含量的測(cè)定 將所有黑木耳樣品按照2.3.3 項(xiàng)下最佳實(shí)驗(yàn)方法制備供試品溶液，按2.3.1 色譜條件測(cè)定樣品麥角甾醇含量。

2.4 麥角甾醇含量與性狀特征和膨脹度相關(guān)性分析

使用SPSS 22.0 將黑木耳麥角甾醇含量與泡發(fā)后的厚度以及膨脹度進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析。

3 結(jié)果

3.1 性狀特征和膨脹度

46 份黑木耳干燥子實(shí)體呈不規(guī)則的塊片狀，長(zhǎng)13.62～35.10 mm，寬8.75～26.35 mm，多皺縮，表面平滑，正面多呈黑色，部分為紅褐色，黑褐色或黃褐色，背面大多為黃灰色，少數(shù)呈黑灰色、灰色或灰白色，質(zhì)脆易折斷。加水浸泡后則膨脹，形似耳狀或不規(guī)則形，邊緣全緣，呈黑褐色，紅褐色或棕褐色，柔潤(rùn)而微透明，長(zhǎng)26.63～72.09mm，寬22.13～58.64mm，厚0.55～1.67mm。因Y44 號(hào)樣品特殊的包裝技術(shù)，因此無(wú)法測(cè)該樣品干燥子實(shí)體的長(zhǎng)度和寬度。黑木耳的膨脹度大小在15.0～42.3 之間，具體結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2、圖3、表2和表10。

圖1 樣品Y1-Y16 性狀特征Fig.1 Characteristics of sample Y1-Y16

圖2 樣品Y17-Y32 性狀特征Fig.2 Characteristics of sample Y1-Y16

圖3 樣品Y33-Y46 性狀特征Fig.3 Characteristics of sample Y33-Y46

表2 黑木耳干燥品性狀特征Table 2 Characteristics of dried Auricularia heimuer

續(xù)表

3.2 麥角甾醇含量的測(cè)定

3.2.1 色譜條件 將本次實(shí)驗(yàn)UPLC 色譜條件和結(jié)果與地方標(biāo)準(zhǔn)DB44/T 1991-2017 進(jìn)行相關(guān)比較，見(jiàn)表3。結(jié)果表明在同樣靈敏度高，穩(wěn)定性好，準(zhǔn)確度高的條件下，UPLC 法分析更快，出峰快且效果好，運(yùn)行時(shí)間短，在樣本量大的情況下，能節(jié)省更多的時(shí)間。

表3 HPLC 與UPLC 比較結(jié)果Table 3 Comparison of HPLC and UPLC results

3.2.2 供試品溶液的制備 實(shí)驗(yàn)樣品不同提取條件結(jié)果如表4如示，結(jié)果表明最好的提取條件是精密稱取0.5 g 粉末（精確至0.000 1 g）過(guò)100 目篩的黑木耳粉末于50 mL離心管中，加25 mL無(wú)水甲醇，渦旋混勻，超聲提取1 h，7 000 r/min 離心6 min，過(guò)濾，將上清液用無(wú)水甲醇定容至25 mL。提取液經(jīng)0.22m 微孔有機(jī)相濾膜進(jìn)行UPLC 測(cè)定。

表4 不同提取條件黑木耳麥角甾醇含量提取結(jié)果Table 4 Extraction results of Auricularia heimuer ergosterol content under different extraction conditions

3.2.3 專屬性考察結(jié)果 專屬性考察結(jié)果見(jiàn)色譜圖4、圖5和圖6。結(jié)果表明麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品和供試品麥角甾醇峰的保留時(shí)間和UV光譜圖一致，且無(wú)水甲醇溶劑在相應(yīng)保留時(shí)間內(nèi)沒(méi)有峰出現(xiàn)，說(shuō)明該方法專屬性良好。

圖4 麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.4 Chromatogram of ergosterol standard

圖5 供試品色譜圖Fig.5 Chromatogram of sample

圖6 無(wú)水甲醇色譜圖Fig.6 Chromatogram of methanol

3.2.4 線性考察結(jié)果 線性考察結(jié)果見(jiàn)表5，可得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=5514333.6315x+820.384（R2=0.9999），說(shuō)明麥角甾醇在0.001 6～0.08mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表5 線性關(guān)系考察試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 5 Linear relationship examination results (n=6)

3.2.5 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6?？傻名溄晴薮嫉谋Ａ魰r(shí)間的RSD值為0.18%，峰面積的RSD 值為0.20%，說(shuō)明儀器精密度良好。

表6 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 6 Precision test results (n=6)

3.2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。結(jié)果表明6 份46 號(hào)樣品保留時(shí)間的RSD 值為0.41%，麥角甾醇含量的RSD值為0.53%，表明方法重復(fù)性良好。

表7 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 7 Repeatability test results (n=6)

3.2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8?？傻迷摌悠返钠骄溄晴薮己繛?.656 3 mg/g，RSD為0.23%，表明樣品在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

表8 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 8 Sample stability test results (n=6)

3.2.8 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表9?？傻眉訕?biāo)樣品的平均回收率為100.84%，RSD 值為0.55%，說(shuō)明方法準(zhǔn)確性良好。

表9 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 9 Spiked recovery test results (n=6)

3.2.9 麥角甾醇含量結(jié)果 46 份黑木耳麥角甾醇含量結(jié)果見(jiàn)表10。采用SPSS22.0 對(duì)測(cè)得的麥角甾醇數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，從測(cè)定結(jié)果（表10）可以看出市售46 份黑木耳麥角甾醇含量在0.1359～0.8936mg/g之間，含量差異顯著（P＜0.01），平均含量為0.6075mg/g，大于平均水平的有25 份。

表10 黑木耳的性狀特征和膨脹度及麥角甾醇的含量Table 10 Characteristics,turgidity and ergosterol content of Auricularia heimue

3.3 黑木耳麥角甾醇含量與性狀特征和膨脹度相關(guān)性分析

在日常生活中，大家普遍認(rèn)為泡發(fā)性高的，厚度大的以及泡發(fā)后狀似小碗的是好木耳，因此使用SPSS 22.0 將黑木耳麥角甾醇含量與泡發(fā)后的厚度以及膨脹度進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表11，黑木耳的麥角甾醇含量與其厚度和膨脹度分別存在極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。

表11 麥角甾醇與性狀特征和膨脹度Pearson 相關(guān)性分析Table 11 Pearson correlation Analysis of Ergosterol with traits and swelling degree

3.4 黑木耳麥角甾醇含量與價(jià)位和產(chǎn)地相關(guān)性分析

目前市場(chǎng)上黑木耳價(jià)格差異大，結(jié)合表1和表11可以看出麥角甾醇含量最高的Y20（0.893 6 mg/g），價(jià)格為87.6 元/kg，但價(jià)格最貴的Y9（509.2 元/kg），含量為0.537 3 mg/g，含量差異顯著（P＜0.01），說(shuō)明黑木耳市場(chǎng)定價(jià)存在很大的自由度；不同價(jià)位的黑木耳的麥角甾醇含量差異明顯（P＜0.01），但是不成線性關(guān)系，例如從含量來(lái)看，是Y36＜Y9＜Y16，但是從價(jià)位等級(jí)來(lái)看是Y16＜Y36＜Y9；同價(jià)位的不同產(chǎn)地黑木耳麥角甾醇含量差異顯著（P＜0.01），例如Y2，Y5，Y6，Y13 和Y31；同價(jià)位同省份同縣區(qū)的黑木耳麥角甾醇含量差異顯著（P＜0.01），例如Y16 和Y17；同時(shí)也有不同價(jià)位不同產(chǎn)地的黑木耳麥角甾醇含量無(wú)差異性，例如Y8，Y14，Y19，Y23，Y34，說(shuō)明黑木耳麥角甾醇含量與產(chǎn)地?zé)o特殊聯(lián)系。

4 結(jié)論

目前市場(chǎng)上黑木耳質(zhì)量參差不齊，麥角甾醇含量差異顯著，且麥角甾醇含量與厚度和膨脹度分別存在極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。但是黑木耳麥角甾醇含量與產(chǎn)地和價(jià)格等因素?zé)o關(guān)。同時(shí)本研究建立了黑木耳中麥角甾醇含量測(cè)定的超高效液相色譜法（UPLC），色譜條件是使用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm 2.1 mm，1.7m），柱溫35 ℃，進(jìn)樣量2L，檢測(cè)波長(zhǎng)282 nm，流動(dòng)相為乙腈：水（98:2），流速0.5 mL/min，與常用的高效液相色譜法相比，該方法檢測(cè)更快速，出峰快，運(yùn)行時(shí)間短，靈敏度高，準(zhǔn)確度高，具有很好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。本文為將黑木耳中麥角甾醇含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了參考，為進(jìn)一步研究、生產(chǎn)和應(yīng)用黑木耳作為功能性食品和治療劑提供了研究基礎(chǔ)。