方麗，葉琪明，郭方其，周勤，徐丹彬，謝昀燁，武軍，王漢榮*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 a植物保護(hù)與微生物研究所，b園藝研究所，浙江 杭州 310021；2.浙江省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江 杭州 310020)

非洲菊(GerberajamesoniiBolus)為菊科大丁草屬多年生草本植物，又稱扶郎花、太陽花、燈盞花等，其色澤艷麗，花形優(yōu)美，花色多樣，花期長不易衰敗，具有極高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是深受大眾歡迎的切花、盆栽和庭院觀賞植物[1]。非洲菊一次播種后可連續(xù)3 a采花，經(jīng)濟(jì)效益顯著。但受浙江土地少的限制，連作現(xiàn)象普遍，導(dǎo)致菌核病、灰霉病、葉斑病、白粉虱、葉螨等病蟲害頻發(fā)。菌核病作為非洲菊生產(chǎn)上的重要土傳病害，導(dǎo)致死苗缺株，長勢衰弱，每年造成的產(chǎn)量損失占10%～50%。種植抗性品種是預(yù)防非洲菊菌核病最經(jīng)濟(jì)有效的途徑。然而，目前尚未有關(guān)于非洲菊菌核病接種法和抗性評價(jià)的相關(guān)報(bào)道，為了促進(jìn)非洲菊抗病育種的發(fā)展，本文用不同方法對非洲菊品種進(jìn)行菌核病菌接種，研究適用于非洲菊的抗菌核病的鑒定方法，為非洲菊的抗病育種提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試非洲菊菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)為浙江省嘉興地區(qū)海寧種植基地的優(yōu)勢菌株，用馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)從自然發(fā)病的非洲菊樣品中分離純化獲得，致病力強(qiáng)。

供試的非洲菊品種有亮粉、白馬、美滿和理想，對菌核病的田間抗性水平由高到低依次為理想、美滿、白馬、亮粉。于2021年5月15日種植于盆缽中，在溫室大棚統(tǒng)一管理。接種時(shí)苗齡為180 d左右。接種前后1個(gè)月不使用任何殺菌劑，其他栽培管理如常。

1.2 試驗(yàn)方法

用以下4種方法接種非洲菊菌核病菌，非洲菊植株接種后用透明塑料膜保濕培養(yǎng)48 h，每天觀察并記錄植株發(fā)病情況，測量病斑長度，并計(jì)算病斑擴(kuò)展速度。

1.2.1 離體葉片接種

以20～30片葉的非洲菊植株為材料，將葉片分為3類，一類為新葉，為生長點(diǎn)周圍2～3片葉；其次為老葉，該類葉片為植株生長點(diǎn)最外圍的葉片，為3～5片葉；最后是壯葉，為處于新葉和老葉之間的葉片。分別用這3種不同類型的葉片接種菌塊，避開葉脈將菌塊置于葉肉和葉柄上。每次處理10個(gè)葉片作為重復(fù)。置于20 ℃光照培養(yǎng)箱，接種72 h后使用十字交叉法測量病斑大小。

1.2.2 牙簽接種

市售牙簽對半截?cái)嗪蠼萦谝后w馬鈴薯蔗糖(PDA)培養(yǎng)液中48 h，高壓滅菌后置于PDA固體培養(yǎng)基上，在皿中央接種菌核病菌，置于25 ℃霉菌培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)。待菌絲長滿培養(yǎng)基以及牙簽后，用牙簽扎入一個(gè)非洲菊中部壯葉葉柄基部(牙簽滯留于葉柄內(nèi))，每株非洲菊用牙簽扎一個(gè)葉柄。每個(gè)品種接種20株作為重復(fù)。

1.2.3 菌塊接種

將培養(yǎng)5 d的菌核病菌菌碟接種于新的PDA培養(yǎng)基上，置于25 ℃霉菌培養(yǎng)箱，培養(yǎng)4 d后，用無菌打孔器取直徑為5 mm的菌塊放置于非洲菊植株的葉柄底部，確保菌塊帶菌的一面緊貼葉柄表面。每株接種一個(gè)菌塊，每個(gè)品種接種10株苗，重復(fù)3次。

1.2.4 菌核接種

將菌核病菌接種于新的PDA培養(yǎng)基上，置于25 ℃霉菌培養(yǎng)箱，培養(yǎng)10 d以上，產(chǎn)生大量菌核后，收集菌核(直徑2～3 mm)，將菌核貼著非洲菊植株根基部放置，表面淺覆一層土壤或基質(zhì)。每株非洲菊植株放置一個(gè)菌核，接種20株苗。

1.3 病情分級標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)非洲菊菌核病發(fā)生及發(fā)展規(guī)律，參考油菜菌核病[2]和白菜菌核病[3]，我們采用下述植株發(fā)病情況與菌絲菌核形成情況相結(jié)合的分級標(biāo)準(zhǔn)：0級，全株無?。?級，部分葉片萎焉，≤5%葉片枯死；3級，部分葉片萎焉或有病斑，枯死的葉片占總?cè)~片數(shù)的5%～10%；5級，10%～25%葉片萎焉或枯死，或枯死葉片或花葶出現(xiàn)白色菌絲或菌絲團(tuán)；7級，25%～50%葉片萎焉或枯死，或枯死葉片或花葶出現(xiàn)白色菌絲或菌絲團(tuán)；9級，50%以上的葉片萎焉或枯死，或心葉萎焉，花葶倒伏，葉片或花葶出現(xiàn)菌絲團(tuán)或菌核。

1.4 病情調(diào)查

病情調(diào)查一般在接種后20～30 d，也可根據(jù)對照品種發(fā)病致最高病級時(shí)的時(shí)間作適當(dāng)調(diào)整。每小區(qū)在全部植株均調(diào)查，調(diào)查并記錄發(fā)病株數(shù)和發(fā)病等級。

1.5 抗性評定標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)上述病情指數(shù)，將其劃分為5個(gè)類型：免疫(I)，無??；高抗(HR)，病情指數(shù)為0～10；抗病(R)，病情指數(shù)為>10～30；中抗(MR)，病情指數(shù)為>30～50；感病(S)，病情指數(shù)為>50～70；高感(HS)，病情指數(shù)為>70～100。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉齡對菌核病菌侵染速度的影響

進(jìn)行離體葉片接種時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同品種和不同葉齡的葉片，接種菌核病菌后產(chǎn)生病斑的時(shí)間以及病斑大小存在差異(圖1)。以白馬為例，接種菌塊后新葉和老葉最先出現(xiàn)淺棕色病斑，而壯葉無病斑。至72 h，新葉和老葉病斑直徑分別為3.9 cm和2.2 cm，壯葉病斑直徑為1.6 cm。供試的其他品種美滿、亮粉與理想出現(xiàn)相同的趨勢，即新葉和老葉較壯葉更早發(fā)病，且新葉和老葉的病斑直徑明顯大于壯葉。相同葉齡葉片產(chǎn)生的病斑大小也體現(xiàn)了品種間抗性的差異，理想、美滿和白馬的病斑明顯小于亮粉(圖1)。

圖1 菌核病菌對不同葉齡的非洲菊品種離體葉片的致病性

2.2 接種部位對菌核病侵染速度的影響

對新葉進(jìn)行離體葉片接種，同時(shí)接種葉肉與葉柄，發(fā)現(xiàn)接種葉肉部位的發(fā)病速度明顯較葉柄發(fā)病快。同一葉片中，葉肉與葉柄的發(fā)病時(shí)間最短間隔為34 h左右。同時(shí)菌核病菌的侵染時(shí)間與非洲菊品種的抗性有關(guān)，侵染時(shí)間隨著品種的抗性增加而增加(表1)。

表1 菌核病菌對葉片不同部位侵染速度的差異

2.3 帶菌牙簽接種法對發(fā)病情況的影響

帶菌牙簽接種法接種活體非洲菊后，接種48 h菌絲侵染葉柄，接種處可見白色的菌絲，以放射狀向四周擴(kuò)展，侵染周圍的葉柄、嫩葉、花梗等。病斑向四周延伸擴(kuò)展，發(fā)病葉柄處呈水浸狀枯斑，葉柄腐軟倒伏。其中，理想的擴(kuò)展速度最慢。接種3 d后非洲菊品種白馬的病斑長度平均達(dá)5.2 cm，病斑擴(kuò)展的速度為3.3 cm·d-1，與美滿相當(dāng)，亮粉在6 d時(shí)病斑長度已經(jīng)達(dá)到21.7 cm左右，其擴(kuò)展速度較快，最為感病(表2)。

表2 牙簽接種方法測定非洲菊對菌核病的抗性

用帶菌牙簽接種法顯示的品種抗性順序與田間發(fā)病類似。

2.4 菌塊接種法

菌塊接種活體非洲菊后，由于葉片微環(huán)境以及品種抗性的差異，部分接種菌塊干枯或未發(fā)病，導(dǎo)致發(fā)病率下降，抗性品種理想的發(fā)病率為70%，而亮粉的發(fā)病率高達(dá)93.3%(表3)。亮粉接種4 d后可見菌絲塊侵染葉柄，隨后菌絲向四周擴(kuò)展，產(chǎn)生褚紅色液滴或水浸狀病斑。其余品種發(fā)病時(shí)間為接種后5～6 d。接種10 d后理想的病斑長度達(dá)到8.2 cm，擴(kuò)展速率最小，為2.47 cm·d-1。而白馬和美滿的病斑長度和擴(kuò)展速度相當(dāng)，為3.34和3.28 cm·d-1左右；亮粉的抗性最弱，擴(kuò)展速度最快，達(dá)到了5.38 cm·d-1。品種間的病斑擴(kuò)展速度差異與牙簽接種法相當(dāng)，同樣體現(xiàn)了不同品種非洲菊的不同抗性水平。

表3 菌塊接種法測定非洲菊對菌核病的抗性

2.5 菌核接種法

菌核埋入非洲菊植株的根基部后，菌核的萌發(fā)和侵染受環(huán)境溫濕度、根基土壤理化性質(zhì)以及品種抗性的影響。發(fā)病較牙簽和菌塊接種法更慢，菌核接種非洲菊品種亮粉后，發(fā)病的時(shí)間為15 d，而理想、美滿、白馬等非洲菊品種的發(fā)病時(shí)間更長。由于菌核具有休眠性，其侵染時(shí)間具有不穩(wěn)定性，較其他兩種接種法的發(fā)病率更低。接種1個(gè)月后，亮粉的發(fā)病率為48.5%，其余品種在10%～30%。根部侵染后造成的地上部分的發(fā)病情況也較牙簽和菌塊接種法更不易辨別，例如出現(xiàn)畸形葉，種植長勢衰弱，分蘗少，葉片枯死等情況。因此，該接種法不適合作為品種抗性鑒定的評價(jià)方法。

2.6 不同接種法的抗性評價(jià)

調(diào)查了采用帶菌牙簽和菌塊接種法接種后非洲菊的發(fā)病情況，與種植于海寧高建偉花卉種植場多年連作地的相同品種的菌核病發(fā)生情況比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，帶菌牙簽接種法的發(fā)病指數(shù)高于菌塊接種法，導(dǎo)致理想、白馬和亮粉的抗性等級與菌塊接種法鑒定結(jié)果相比更低，而菌塊接種法的評價(jià)等級與田間自然發(fā)病的評價(jià)等級更接近(表4)。

表4 不同接種法的品種抗性評價(jià)

3 小結(jié)與討論

菌核病的人工接種法在大白菜[3]、油菜[4-7]、茄子[8]及向日葵[9]等作物上有著一定的研究，包括草酸浸根(葉)法、離體葉片接種法、葉腋接種法、牙簽接種法等。其中牙簽接種法為油菜菌核病人工接種最常用的方法，用于鑒定和評價(jià)不同品種油菜對菌核病的抗性等級，這與本文的研究結(jié)果有著較大的差異。本研究比較了葉片的不同部位接種對菌核病發(fā)生的影響，及牙簽接種法與菌塊接種法對非洲菊菌核病抗性表現(xiàn)的差異，發(fā)現(xiàn)接種葉肉的侵染和擴(kuò)展速度明顯高于葉柄，而牙簽接種制造的傷口有利于病原菌的侵染和擴(kuò)展，相比于菌塊接種法，帶菌牙簽接種后導(dǎo)致的植物發(fā)病率高，病情指數(shù)較菌塊接種法更高，抗性等級更低。而菌塊接種法由于未造成傷口，植物的表面結(jié)構(gòu)抗性也得到了充分的體現(xiàn)，這可能是該方法病情指數(shù)低于牙簽接種法的原因之一。孫葉爍等[3]用菌塊接種法測定了最佳的離體苗齡、部位及溫濕度等，發(fā)現(xiàn)用菌塊接種法接種活體和離體大白菜，均能有效鑒定大白菜的菌核病抗性。楊順超等[10]在菊花菌核病抗性研究中也發(fā)現(xiàn)，菌塊接種法可用于區(qū)分品種、鑒定抗性水平，這與本研究的結(jié)果相同。通過對不同葉齡的葉片菌核病的抗性水平比較，本研究發(fā)現(xiàn)，菌核病對衰老和幼嫩非洲菊葉片的侵染和擴(kuò)展速度明顯高于壯葉。由于新葉靠近生長點(diǎn)，易導(dǎo)致植株快速死亡，無法有效地鑒別植株抗性等級，因此，接種老葉比新葉更能體現(xiàn)植株的抗性水平。在條件適宜的情況下葉肉接種更有利于病原菌的侵染，但進(jìn)行大量試驗(yàn)時(shí)也容易發(fā)生菌塊脫落、失水干涸等情況。而將菌塊接種于老葉葉柄則能夠減少因溫濕度等環(huán)境變化導(dǎo)致菌塊干涸等情況造成的接種誤差，提高測定的成功率。