牛振東，路銀環(huán)，劉文杰，陳 卓，井良義

（北京市藥品檢驗(yàn)研究院·中藥成分分析與生物評價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品安全監(jiān)管司/藥品認(rèn)證管理中心《藥品生產(chǎn)驗(yàn)證指南》要求，藥品生產(chǎn)過程中使用的滅菌設(shè)備安裝、調(diào)試結(jié)束后，在正式投入使用前和使用一定時(shí)間后必須確認(rèn)性能，可進(jìn)行期間核查，應(yīng)采用經(jīng)過驗(yàn)證的滅菌工藝、操作規(guī)程和檢測方法進(jìn)行操作。高壓滅菌器應(yīng)經(jīng)過生物指示劑挑戰(zhàn)試驗(yàn)和B-D試驗(yàn)測試滅菌效果，合格后方可使用。生物指示劑挑戰(zhàn)試驗(yàn)是驗(yàn)證滅菌器滅菌效果的重要手段，2020年版《中國藥典（四部）》中將生物指示劑（BI）定義為一種對特定滅菌程序有確定及穩(wěn)定耐受性的特殊活微生物制成品［1］。脈動(dòng)真空滅菌器采用濕熱滅菌法滅菌，即利用飽和蒸汽使微生物菌體中的蛋白質(zhì)、核酸發(fā)生變性從而殺滅微生物。蒸汽穿透力強(qiáng)，滅菌效果可靠，使用方便，廣泛應(yīng)用于病原微生物實(shí)驗(yàn)室，尤其是對器械、培養(yǎng)基、感染性廢棄物等的消毒滅菌［2］。滅菌程序的建立、確定、驗(yàn)證和日常監(jiān)控中，實(shí)驗(yàn)室需合理選擇和使用BI，全面了解滅菌產(chǎn)品，確保滅菌參數(shù)能達(dá)到所需無菌保障水平。BI的耐受性及標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用等問題是決定滅菌工藝驗(yàn)證效果是否合理的關(guān)鍵，而合理有效的滅菌工藝直接關(guān)系醫(yī)藥產(chǎn)品的安全［3］。本研究中通過生物指標(biāo)劑挑戰(zhàn)試驗(yàn)及B-D試驗(yàn)分析脈動(dòng)真定滅菌器的滅菌效果?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器：1300 Series A2型生物安全柜（美國Thermo Fisher公司）；BIOBASE型生化培養(yǎng)箱（山東博科科學(xué)儀器有限公司）；BIST-A-D型電熱脈動(dòng)真空滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司，含1號(hào)鍋和2號(hào)鍋，其裝載車分上下兩層）。

試劑：壓力蒸汽滅菌生物指示劑，包括嗜熱脂肪地芽孢桿菌Geobacillus stearothermophilusATCC 7953［芽孢數(shù)為（1～5）×106cfu/片，D值為1.3～1.9 min］，以及培養(yǎng)基（上海福澤醫(yī)藥器材有限公司，批號(hào)為210720）；B-D試驗(yàn)包（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司，批號(hào)為21H02）。

1.2 方法

生物指示劑挑戰(zhàn)試驗(yàn)：該試驗(yàn)?zāi)苤苯臃从硿缇髟跍缇^程中的滅菌能力和效果，是滅菌器滅菌過程中最重要的監(jiān)測手段［4］。試驗(yàn)分為試驗(yàn)組、陽性對照組、陰性對照組。脈動(dòng)真空滅菌器裝載車分為上下兩層（1，2號(hào)鍋），分別對上下兩側(cè)布點(diǎn)進(jìn)行生物指示劑測試，每層布置9個(gè)監(jiān)測點(diǎn)，分別進(jìn)行空載和滿載測試。試驗(yàn)組BI經(jīng)121.0℃滅菌15 min，置換6 min后釋放芽孢桿菌，于56℃培養(yǎng)48 h；陽性對照組芽孢桿菌于56℃培養(yǎng)48 h；陰性對照組僅有培養(yǎng)基，于56℃培養(yǎng)48 h。布點(diǎn)見表1，裝載方式見圖1。

圖1 滅菌鍋不同裝載方式試驗(yàn)結(jié)果A1，B1.No.1 pot A2，B2.No.2 potA.No-load B.Full-loadFig.1 Test results of different loading modes of sterilizer pots

表1 生物指示劑挑戰(zhàn)試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of the biological indicator challenge test

B-D測試法：將試驗(yàn)包置滅菌器室內(nèi)排氣口處關(guān)閉柜門［5］，134℃滅菌3.5 min，脈動(dòng)3次，完畢，取出測試圖，觀察測試結(jié)果（試驗(yàn)試紙由黃色轉(zhuǎn)為黑色，表明滅菌有效）。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)滅菌器使用的年限和頻率等因素制訂相應(yīng)的B-D監(jiān)測規(guī)范。

指示膠帶的使用：應(yīng)在每次滅菌過程中使用，主要用于區(qū)分是否進(jìn)行過滅菌處理。但不能據(jù)此結(jié)果判定滅菌是否合格［6］，只有結(jié)合其他手段綜合評估才能判斷滅菌效果。

2 結(jié)果

生物指示劑挑戰(zhàn)試驗(yàn)結(jié)果見表1（試驗(yàn)組及陰性對照組滅菌前后均呈紫紅色、澄清狀）和圖1。B-D測試結(jié)果顯示，試驗(yàn)試紙由黃色轉(zhuǎn)為黑色。

3 討論

2020年初新型冠狀病毒肺炎疫情（簡稱新冠疫情）的暴發(fā)，加深了人們對生物安全的認(rèn)識(shí)，實(shí)驗(yàn)室生物安全也愈加凸顯。我國出臺(tái)《生物安全法》并于2021年4月15日起實(shí)施，該法細(xì)致詳細(xì)，為生物安全領(lǐng)域首次立法，凸顯國家對生物安全的重視。對此，病原微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立質(zhì)量與生物安全管理體系、人員管理、菌（毒）種和陽性樣本的管理、環(huán)境與設(shè)備管理、廢棄物安全、個(gè)人防護(hù)和應(yīng)急預(yù)案等。加強(qiáng)滅菌器性能驗(yàn)證及其規(guī)范操作對微生物實(shí)驗(yàn)室至關(guān)重要。

第40版《美國藥典》及第8版《歐洲藥典》均指出，BI是一種對特定滅菌程序有確定及穩(wěn)定耐受性的特殊活微生物制成品，其常用于確認(rèn)滅菌設(shè)備性能，及特定物品的滅菌工藝研發(fā)、建立和驗(yàn)證等。BI主要分菌片式和自含式，菌片式BI需要未滅菌的菌片和無菌培養(yǎng)基，本試驗(yàn)中所用的為自含式BI，本身含有菌種和培養(yǎng)基，可有效避免外界雜菌的污染。Bowie等發(fā)明的驗(yàn)證預(yù)真空滅菌器的真空系統(tǒng)是否功能正常的方法即B-D測試法［7］，適用于預(yù)真空壓力蒸汽滅菌器空氣排除效果的檢測，及日常滅菌中空氣排除效果監(jiān)測、設(shè)計(jì)滅菌操作規(guī)程時(shí)的核查、滅菌器研制中及維修后性能的測定、新滅菌器安裝調(diào)試后效果的測定等。醫(yī)用消毒滅菌指示膠帶是滅菌過程指示產(chǎn)品，通過膠帶上的指示油墨在經(jīng)消毒滅菌作用后顏色發(fā)生變化，從而判定物品是否經(jīng)消毒處理，直觀簡潔地反映物品滅菌狀態(tài)。

隨著生物安全要求越來越受到重視，有效的滅菌效果監(jiān)測和滅菌器工藝開發(fā)顯得尤為重要，和歐美國家相比，我國滅菌工藝相關(guān)的法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)范和指導(dǎo)原則相對不健全。近年來，國家藥品改革不斷深入，對于藥品無菌工藝保障要求越來越多，無菌工藝也是藥品安全性保障的重要指標(biāo)，對相應(yīng)指導(dǎo)原則或標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范的需求就更迫切，為此，2020年版《中國藥典（四部）》通則在以往版本的基礎(chǔ)上對滅菌法進(jìn)行了重大修訂，增加了與滅菌工藝相關(guān)的2個(gè)BI的指導(dǎo)原則，即通則9207（滅菌用生物指示劑指導(dǎo)原則）和通則9208（生物指示劑耐受性檢查法指導(dǎo)原則）。2020年12月31日，國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心（CDE）正式發(fā)布《化學(xué)藥品注射劑滅菌和無菌工藝研究及驗(yàn)證指導(dǎo)原則（試行）》并試行。上述指導(dǎo)原則的發(fā)布，為BI的質(zhì)量控制提供了參考，為檢測實(shí)驗(yàn)室和藥品生產(chǎn)企業(yè)在滅菌工藝研究、滅菌效果驗(yàn)證和日常滅菌監(jiān)控中正確選用BI提供了技術(shù)指導(dǎo)，同時(shí)，良好的滅菌工藝能減少藥品污染，降低實(shí)驗(yàn)室感染性材料滅菌不徹底的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，本研究中確立了適用于本實(shí)驗(yàn)室的脈動(dòng)真空滅菌器的滅菌程序、裝載方式及其日常監(jiān)測的方法。初步確定的滅菌程序（121℃滅菌15 min），能殺滅孢子菌而達(dá)到預(yù)期滅菌效果，保障培養(yǎng)基和試劑的滅菌質(zhì)量。在日常微生物檢驗(yàn)過程中，用該滅菌程序能徹底殺滅包括孢子菌在內(nèi)的所有微生物，而不會(huì)因?yàn)闅⒕粡氐?，檢驗(yàn)用物品引入微生物造成假陽性風(fēng)險(xiǎn)。蒸汽滅菌器可滿足日常檢驗(yàn)時(shí)的滅菌使用要求。需注意在每次滅菌時(shí)應(yīng)使用指示膠帶，根據(jù)滅菌器的使用年限和使用頻率定期進(jìn)行B-D試驗(yàn)和生物指示劑挑戰(zhàn)試驗(yàn)。