李 莎，韓海燕，吳紅洋，唐韻熙，王 巍，范能全△

（1.重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，重慶 401121；2.重慶市涪陵食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 408000）

關(guān)鍵字：高效液相色譜法；膠塞；抗氧劑；硫化劑

藥用膠塞彈性和穩(wěn)定性良好，廣泛用于注射劑的密封［1］。但在藥品的貯存過程中，膠塞因與藥品長期、直接接觸，易產(chǎn)生與藥物的相容性問題，從而影響藥品質(zhì)量，甚至對人體產(chǎn)生毒副作用［2］。目前，許多醫(yī)藥類膠塞中可檢測到其生產(chǎn)所用主要硫化劑硫磺的存在［3］。硫化劑會改變繁殖周期，影響新生兒發(fā)育，還可能增強(qiáng)致癌基因的表達(dá)［4-7］。因此，有必要對硫磺等硫化劑含量進(jìn)行考察及控制，以保障用藥安全。膠塞配方中常用的抗氧劑按結(jié)構(gòu)分類主要有受阻酚類及亞磷酸酯類等，受阻酚類主要包括2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）、抗氧劑1076、抗氧劑1010、1，3，5-三甲基-2，4，6-（3，5-二叔丁基-4-羥基苯甲基）苯（抗氧劑1330）等，亞磷酸酯類主要包括抗氧劑168等［8］?？寡鮿┏鲆欢ㄏ蘖?，會損傷人體肝、脾、肺等器官［9］，且部分易降解，其降解產(chǎn)物毒性也較大［10］。近年來，已有研究涉及抗氧劑和藥品包裝材料的相容性［11-16］，高效液相色譜（HPLC）法雖可檢測抗氧劑但已有研究涉及的種類較少，液相質(zhì)譜聯(lián)用法可檢種類較多，但檢測成本較高。為此，本研究中以胰島素注射液模擬注射用液，建立了同時(shí)測定藥用膠塞中上述7種抗氧劑和硫磺含量的HPLC法，并結(jié)合每日允許暴露量（PDE）評估結(jié)果的安全性。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；XPE205型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為0.01 mg）；HH-21-8型水浴鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；VX-95型高壓滅菌器（德國Systec公司）；Milli-Q Advantage A10型超純水機(jī)（法國Merck Millipore公司）。

1.2 試藥

抗氧劑1310對照品（CAS號20170-32-5，批號為P1437031）、242對照品（CAS號96-76-4，批號為P1226121），均購自Adamas Reagent Co，Ltd，純度均大于98%；BHT對照品（阿拉丁試劑公司，CAS號128-37-0，批號為B1926023，純度＞99.7%）；硫磺對照品（Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，CAS號7704-34-9，批號為106536，純度＞99.0%）；抗氧劑1010對照品（CAS號6683-19-8，批號為007WX5）、330對照品（CAS號1709-70-2，批號為006C27）、1076對照品（CAS號2082-79-3，批號為003V02）、168對照品（CAS號31570-04-4，批號為002CTK），均為歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)品，純度均為100%；注射器用溴化丁基橡膠塞活塞（簡稱膠塞，Datwyler Pharma Packaging Belgium公司，編號為B013）；胰島素注射液（重慶宸安生物制藥有限公司，編號為A003，A004，A005，每日最大用量1 mg）；甲醇、乙酸均為色譜純，二氯甲烷為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%乙酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min時(shí)40%A→80%A，5～15 min時(shí)80%A→95%A，15～16 min時(shí)95%A→100%A，16～40 min時(shí)100%A，40～41 min時(shí)100%A→40%A，41～55 min時(shí)40%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：230 nm；柱溫：35℃，進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：分別稱取抗氧劑1310，242，1010，330，1076，168，BHT及硫磺對照品0.010 93，0.011 05，0.010 70，0.010 82，0.010 47，0.010 58，0.010 40，0.010 91 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加無水乙醇定容，制得質(zhì)量濃度約為100 μg/mL的混合對照品溶液。

供試品溶液：以0.2 g/mL的比例在膠塞中加入胰島素注射液，121℃下高壓滅菌1 h，提取膠塞，得提取液；取15 mL置分液漏斗中，加二氯甲烷15 mL振搖提取30 min，取二氯甲烷層揮干，加入無水乙醇定容至15 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

加標(biāo)供試品溶液：取前述提取液5 mL，置分液漏斗中，加混合對照品溶液1 mL，加二氯甲烷5 mL振搖提取30 min，取二氯甲烷層揮干，加入無水乙醇定容至5 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照品溶液、空白溶劑：取剪碎后的膠塞2.005 4 g，精密稱定，加二氯甲烷10 mL超聲［功率為500 W，頻率為40 kHz，溫度為（25±2）℃］處理30 min，取二氯甲烷層揮干，加入無水乙醇定容至10 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。同法（不加膠塞）制得空白溶劑。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：精密吸取2.2項(xiàng)下5種溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與混合對照品溶液色譜相應(yīng)位置有吸收峰，陰性對照無干擾。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.1310 2.242 3.BHT 4.Sulphur 5.1010 6.330 7.1076 8.168A.Mixed reference solution B.Test solution C.Spiked test solution D.Negative reference solution E.Blank solventFig.1 HPLC chromatograms

精密度試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下加標(biāo)供試品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD均小于2.0%（n=6），表明方法精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下提取液適量，按2.2項(xiàng)下方法制備加標(biāo)供試品溶液溶液，共6份，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD均小于2.0%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下加標(biāo)供試品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.4 耐用性考察

將流速從1.00 mL/min分別調(diào)至0.95 mL/min和1.05 mL/min；柱溫從35℃分別調(diào)至33℃和37℃，其他色譜條件均保持不變，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，小幅度改變色譜條件能滿足試驗(yàn)要求，耐用性良好。

2.5 樣品含量測定

取2.2項(xiàng)下陰性對照品溶液與供試品溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，外標(biāo)法計(jì)算各抗氧劑及硫磺含量。結(jié)果膠塞中檢出抗氧劑1310，1 010，1 076，168和硫磺，樣品藥物中檢出抗氧劑1010和硫磺。詳見表2。

表2 樣品及膠塞中抗氧劑和硫磺含量測定Tab.2 Content determination of antioxidant and sulphur in samples and rubber stoppers

2.6 安全性評價(jià)

計(jì)算分析表觀效應(yīng)閾值（AET）。AET=PDE/MDI，式中，PDE為關(guān)注物質(zhì)每日允許最大攝入量（μg/d），MDI為每日最大攝入量（瓶）。

對于已知有致突變性、致癌性的化學(xué)物質(zhì)，國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會（ICH）指導(dǎo)原則M7，從半數(shù)中毒劑量（TD50）線性外推的方法設(shè)立可接受攝入量。通過將TD50值除以50 000以線性外推至十萬分之一的發(fā)生率（即終生風(fēng)險(xiǎn)水平）。在化學(xué)結(jié)構(gòu)上相似的化合物，可按類別制訂可接受攝入量。

以抗氧劑1310為例，查閱毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC）得知，其對于大鼠的TD50為540 mg/（kg·d），成人平均體質(zhì)量按50 kg計(jì)，計(jì)算得到抗氧劑1310人體可接受攝入量為540 μg/d。根據(jù)各抗氧劑和硫磺的PDE值及樣品每日最大使用量計(jì)算得到最大允許含量，由此計(jì)算出提取/遷移試驗(yàn)中AET，結(jié)果見表3（ECHA為歐盟化學(xué)品管理局）。

表3 抗氧劑和硫磺非腸道給藥途徑的PDE值及來源Tab.3 PDE value and source of antioxidant and sulphur by parenteral administration route

3 討論

預(yù)試驗(yàn)中，取混合對照品溶液進(jìn)行稀釋，選擇質(zhì)量濃度低于360 μg/mL［以硫磺、抗氧劑及降解產(chǎn)物中最小的50%儀器AET計(jì)算，抗氧劑1310限度=540（μg/d）÷3（mL）×4（mg）×1（mg/d）×50%=360 μg/mL］的混合對照品溶液（100 μg/mL）進(jìn)樣，結(jié)果其信噪比（S/N）值均大于10，能滿足試驗(yàn)對檢測靈敏度的要求。并考察了胰島素注射液中抗氧劑和硫磺遷移情況及膠塞中提取抗氧劑和硫磺的檢測限，結(jié)果試驗(yàn)中8種待測成分對于遷移樣品或膠塞提取的方法檢測限均小于108.3 μg/mL，低于各自50%AET。

綜上所述，本研究中建立了同時(shí)測定胰島素注射液成品的溴化丁基膠塞及其提取物中硫磺及7種抗氧劑含量的HPLC法，該方法專屬性好、靈敏度高，重復(fù)性、精密度好，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，檢測出的膠塞中各成分含量和藥品遷移值遠(yuǎn)低于注射途徑的PDE值，遷移的抗氧劑和硫化劑基本不影響藥品安全性。