樂倩倩，鈕徐融，謝永輝，劉全俊，詹莜國(guó)，柯昌磊，李微杰，張 倩，張心雨，張瑞玲，張 忠，王志江*

（1.云南省煙草公司 昆明市公司，云南 昆明 650051；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271016；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

美洲大蠊（Periplaneta american）和德國(guó)小蠊（Blattella germanica）屬于節(jié)肢動(dòng)物門昆蟲綱蜚蠊目，長(zhǎng)期滋生在下水道、化糞池以及居民生活區(qū)的排污管等處，擁有超強(qiáng)的繁殖能力和抗病性，甚至?xí)?duì)常用殺蟲劑產(chǎn)生耐藥［1］。昆蟲病原真菌生物制劑，作為一種安全、高效、持效期長(zhǎng)且不易產(chǎn)生抗藥性的生物防治手段，逐漸引起了人們的高度重視。但有研究表明蟑螂體內(nèi)的某些共生菌能幫助其抵抗蟲生真菌的感染。德國(guó)小蠊體內(nèi)，尤其是腸道內(nèi)有多種內(nèi)共生菌［2］，這些內(nèi)共生微生物是昆蟲正常生長(zhǎng)發(fā)育所必需的，不僅參與昆蟲維生素合成吸收、脂肪和糖類利用以及氮循環(huán)，而且在抵抗外來病原微生物的入侵、定殖以及免疫系統(tǒng)的加強(qiáng)中起著至關(guān)重要的作用［3-4］。如從德國(guó)小蠊腸道中分離的細(xì)菌菌株Bacillus subtilis［5］和Pseudomonas reactans［6］不僅能夠抑制白僵菌分生孢子的萌發(fā)，而且能夠抑制菌絲的生長(zhǎng)，具有抗白僵菌感染活性。目前，針對(duì)蟑螂腸道真菌抗常見昆蟲病原真菌感染的反應(yīng)研究未見報(bào)道。本研究從美洲大蠊和德國(guó)小蠊體內(nèi)分離獲得了16種真菌菌株，通過平板對(duì)峙法從中篩選出對(duì)常見昆蟲病原真菌——球孢白僵菌（Beauveria bassiana）和萊氏野村菌（Nomuraea rileyi）具有拮抗作用的菌株，為探討2種蜚蠊對(duì)常見昆蟲病原真菌的抗病機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源

美洲大蠊和德國(guó)小蠊種群均來自濟(jì)南市疾病預(yù)防控制中心引種，于2005年在山東第一醫(yī)科大學(xué)病媒生物與蟲媒病實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)至今，飼養(yǎng)條件為：溫度（26±1） ℃，相對(duì)濕度（60±10）%，光照12∶12 （L∶D），提供兔飼料作為食料。

1.2 供試?yán)ハx病原真菌

選擇2種常見昆蟲病原真菌作為對(duì)峙試驗(yàn)的供試病原菌，即球孢白僵菌（Beauveria bassiana）和萊氏野村菌（Nomuraea rileyi），這2種真菌均為本實(shí)驗(yàn)室自主分離的菌種。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備 取德國(guó)小蠊若蟲5個(gè)階段，成蟲1個(gè)階段，其中成蟲階段分雌蟲和雄蟲，共7種蟲態(tài)，每個(gè)階段各設(shè)置3組重復(fù)，取樣前，德國(guó)小蠊需要饑餓24 h。取樣時(shí)，第1和第2階段的若蟲置于無菌離心管內(nèi)，用75%酒精浸泡10 min后，用無菌水漂洗3次，去除表面細(xì)菌，然后再進(jìn)行研磨取樣；其余各階段的取樣，同上進(jìn)行體表消毒后，在無菌的環(huán)境下，解剖取其腸道，置于無菌離心管內(nèi)，再進(jìn)行研磨取樣。美洲大蠊取樣相同。

1.3.2 可培養(yǎng)真菌的培養(yǎng) 參照黃振東等［7］傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法分離純化德國(guó)小蠊腸道可培養(yǎng)真菌，取1.3.1中充分研磨的樣品加入200 μL的無菌水混勻，取50 μL混合液稀釋成3個(gè)不同濃度（10-4、10-6、10-8），各取50 μL均勻涂布在真菌培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)箱28 ℃下培養(yǎng)72 h。待真菌生長(zhǎng)后，分離純化得到單個(gè)菌株，去除重復(fù)菌種。美洲大蠊操作相同。

1.3.3 可培養(yǎng)真菌的鑒定 參照唐萬(wàn)達(dá)等［8］分子鑒定方法提取及鑒定真菌DNA，氯仿法提取DNA，真菌的ITS序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，送至青島睿博基因公司測(cè)序，最后將得到的測(cè)序序列在NCBI網(wǎng)站的GenBank上進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)。

1.3.4 拮抗菌種篩選 內(nèi)生真菌對(duì)病原真菌的拮抗作用采用五點(diǎn)對(duì)峙培養(yǎng)法［9］進(jìn)行測(cè)定。在直徑為9 cm的PDA平板正中央接入直徑為5 mm的昆蟲病原菌菌餅，同時(shí)在平板4個(gè)距供試菌菌餅2.5 cm處接入相同大小的內(nèi)生真菌菌餅，以只接病原真菌、不接腸道真菌的平板作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，25 ℃條件下培養(yǎng)。每24 h觀察1次，從對(duì)峙培養(yǎng)第3天起測(cè)量病原真菌菌落直徑和抑菌帶距離。抑菌帶距離（D）為內(nèi)生真菌菌落與供試菌菌落之間的無菌區(qū)域?qū)挾取Ｒ种坡剩╥nhibitory rate，IR）公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 蜚蠊腸道可培養(yǎng)真菌分子鑒定結(jié)果

在美洲大蠊腸道中分離得到8屬12株內(nèi)生真菌，德國(guó)小蠊腸道中分離得到3屬4株內(nèi)生真菌（表1）。

表1 美洲大蠊和德國(guó)小蠊腸道內(nèi)生真菌Blast對(duì)比結(jié)果

2.2 蜚蠊腸道內(nèi)生真菌對(duì)昆蟲病原真菌的抑菌效果

2種蜚蠊腸道內(nèi)生真菌對(duì)2種昆蟲病原真菌的拮抗作用分為強(qiáng)（抑制率≥75%）、較強(qiáng)（50%≤抑制率＜75%）和弱（抑制率＜50%）3個(gè)等級(jí)［10］，抑制率在75%以上視為拮抗活性顯著。本研究結(jié)果表明，2種蜚蠊腸道內(nèi)存在具有較強(qiáng)的昆蟲病原真菌拮抗活性的真菌，有5株腸道內(nèi)生真菌對(duì)球孢白僵菌具有拮抗作用，占可培養(yǎng)腸道內(nèi)生真菌菌株總數(shù)的31.25%，且這5株腸道內(nèi)生真菌對(duì)球孢白僵菌的抑制率都達(dá)到50%以上，拮抗活性較強(qiáng)。有9株腸道內(nèi)生真菌對(duì)萊氏野村菌具有拮抗作用，占可培養(yǎng)腸道內(nèi)生真菌菌株總數(shù)的56.25%。此外，16株內(nèi)生真菌中對(duì)2種病原真菌的抑制率均達(dá)50%以上的有1株，占6.25%；只對(duì)1種病原真菌的抑制率達(dá)到50%以上的有6株，占37.50%；而對(duì)2種供試菌的抑制率皆低于10%的有6株，占37.50%，這6種真菌的拮抗活性最弱或沒有活性。由此可知，美洲大蠊和德國(guó)小蠊腸道內(nèi)生真菌中廣泛存在著抑菌活性真菌，并呈現(xiàn)出對(duì)2種昆蟲病原真菌有不同程度的抑制作用，拮抗作用和強(qiáng)度存在差異（表2）。

表2 腸道內(nèi)生真菌拮抗病原真菌的抑制率及抑菌帶距離

從抑菌帶寬度來看（表2），菌株D4在拮抗萊氏野村菌的平板中抑菌帶寬度為0 mm，并不完全代表病原真菌生長(zhǎng)受到很強(qiáng)的抑制，與真菌本身生長(zhǎng)速度也有關(guān)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株D4生長(zhǎng)速度較快，在對(duì)峙培養(yǎng)的第4天后，其菌落呈覆蓋式生長(zhǎng)，具有較強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)能力，生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)強(qiáng)，能迅速占領(lǐng)生長(zhǎng)空間（圖1f），與之對(duì)峙培養(yǎng)的萊氏野村菌生長(zhǎng)較慢，導(dǎo)致其無法擴(kuò)增其菌落，直接被D4真菌菌絲全部覆蓋。

在菌株M7與球孢白僵菌的對(duì)峙培養(yǎng)中（圖1b），兩者菌落之間不僅出現(xiàn)抑菌帶，而且菌株M7菌落隨著生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，在接觸抑制處時(shí)分泌出黑紫色物質(zhì)，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)顏色逐漸加深，并且在M7菌落靠近拮抗處有黃色滲出液滲出，且慢慢轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏w粒。在菌株D4與球孢白僵菌的對(duì)峙培養(yǎng)中（圖1c），隨著菌株D4的生長(zhǎng)，球孢白僵菌的生長(zhǎng)受到抑制，與對(duì)照組（圖1a）相比，菌落邊緣菌絲淡化，貼近培養(yǎng)基且變色幾乎沒有氣生菌絲。

同樣，有些菌株的菌落雖然自身生長(zhǎng)速度緩慢，如圖1d和圖1g中的腸道內(nèi)生真菌，但抑菌能力強(qiáng)（抑制率=100%）。圖1d為菌株M8，使球孢白僵菌生長(zhǎng)受抑制，并形成較寬的抑菌帶。同樣從表2可知：菌株M8對(duì)球孢白僵菌和萊氏野村菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的拮抗活性，抑制率分別達(dá)54.28%和100.00%。

圖1 腸道內(nèi)生真菌對(duì)2種病原真菌的拮抗作用

3 討論與結(jié)論

本研究利用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法，從2種蜚蠊腸道內(nèi)分離得到16株可培養(yǎng)真菌。美洲大蠊腸道內(nèi)分離得到的內(nèi)生真菌以假絲酵母屬為主，占美洲大蠊腸道內(nèi)分離得到的可培養(yǎng)真菌總株數(shù)的25%，共3株，分別 為C. palmioleophila、C. viswanathii和C. duobushaemulonii；德國(guó)小蠊腸道內(nèi)分離得到的內(nèi)生真菌以曲霉屬為主，占德國(guó)小蠊腸道內(nèi)分離得到的可培養(yǎng)真菌總株數(shù)的50%，共2株，分別為A. candidus和A. flavus，這與馬濤等［11-12］在野外不同生境采集到的2種蜚蠊樣本腸道內(nèi)生菌的研究結(jié)果基本一致。本研究分離得到的蜚蠊腸道內(nèi)生真菌的種屬和抗菌活性分布具有多樣性，但菌株數(shù)量較其他研究有所減少，可能與本研究所用的德國(guó)小蠊由于在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)長(zhǎng)期飼養(yǎng)致其腸道菌群因食物單一而變得更為單一有關(guān)。上述研究結(jié)果表明，蜚蠊腸道內(nèi)生真菌組成與其生長(zhǎng)環(huán)境具有相關(guān)性，野外或其他生境下取樣的美洲大蠊和德國(guó)小蠊腸道內(nèi)生真菌組成較實(shí)驗(yàn)室內(nèi)長(zhǎng)期飼養(yǎng)的蜚蠊腸道內(nèi)生真菌組成更為復(fù)雜。

在2種蜚蠊腸道內(nèi)分離得到的可培養(yǎng)真菌中，對(duì)球孢白僵菌和萊氏野村菌均有拮抗作用的有10種，占2種蜚蠊腸道內(nèi)分離可培養(yǎng)真菌總株數(shù)的62.50%。且不同屬的腸道內(nèi)生真菌對(duì)同一病原真菌表現(xiàn)出不同程度的拮抗性，同種屬的菌種其抑菌活性亦存在相似性或差異性。從抑菌帶寬度來看，多數(shù)對(duì)峙結(jié)果中的抑菌帶寬度為3 mm左右。真菌拮抗機(jī)制通常包括多重作用，如重寄生、競(jìng)爭(zhēng)、分泌抑菌物質(zhì)和產(chǎn)生抑菌揮發(fā)性氣體等［13-14］。例如菌株M7在與球孢白僵菌的對(duì)峙培養(yǎng)中，兩者菌落之間不僅出現(xiàn)抑菌帶，且在接觸抑制處時(shí)分泌出黑紫色物質(zhì)。正如其他同屬菌株產(chǎn)生的醛類、烯類及醇類物質(zhì)會(huì)抑制病原真菌生長(zhǎng)［15］，結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)A. candidus隨著對(duì)峙培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，拮抗作用隨之增強(qiáng)，且會(huì)在拮抗處分泌某種拮抗物質(zhì)。

同樣，有些菌株的菌落雖然生長(zhǎng)速度慢，但這類腸道內(nèi)生真菌可能會(huì)釋放一些代謝產(chǎn)物到培養(yǎng)基中，或產(chǎn)生一些揮發(fā)性抑菌氣體，使病原真菌生長(zhǎng)受抑制［14］。在通常情況下，真菌的分生孢子生長(zhǎng)越多，成功萌發(fā)后才會(huì)穿透昆蟲體壁并侵入體腔內(nèi)，其作為微生物殺蟲劑的致病能力就越高。在平板對(duì)峙中，受拮抗的萊氏野村菌白色菌絲少見，不利于綠色分生孢子的產(chǎn)生，與致病毒力相關(guān)的菌體生理代謝產(chǎn)物草酸鈣結(jié)晶相應(yīng)地減少。說明某些腸道內(nèi)生真菌的相關(guān)活性物質(zhì)抑制了萊氏野村菌分生孢子的產(chǎn)生，降低了草酸產(chǎn)生的能力，從而降低了該真菌的侵襲力。草酸鈣結(jié)晶是病原真菌的生理代謝產(chǎn)物，且與其對(duì)寄主的侵染力有直接關(guān)系，能使寄主昆蟲血液變性，從而破壞血細(xì)胞［16］。

本研究從美洲大蠊和德國(guó)小蠊腸道內(nèi)分離篩選到對(duì)病原真菌具有拮抗作用的真菌，不僅從腸道共生體真菌的角度解釋了蜚蠊不易受昆蟲病原真菌感染、免疫力增強(qiáng)的原因，而且為開發(fā)新型生物蜚蠊防治劑提供了借鑒。在美洲大蠊腸道內(nèi)篩選出可同時(shí)抑制球孢白僵菌和萊氏野村菌生長(zhǎng)的A. candidus和K. blattae，這2種真菌顯示出較強(qiáng)的拮抗活性。A. candidus和K. blattae這2種真菌拮抗球孢白僵菌和萊氏野村菌感染的機(jī)制有待進(jìn)一步研究，以期為從其他方面提高球孢白僵菌和萊氏野村菌粉毒力、增強(qiáng)防治效果提供一定的參考意義。