顏逢緣，周春妙，陳 雪，馮文榮,3，宋長(zhǎng)友,3，唐永凱,,3

（1.水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心（上海海洋大學(xué)），上海 201306 ；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無錫 214128；3.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 淡水漁業(yè)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 淡水漁業(yè)與種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214081）

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis），又稱河蟹、大閘蟹，是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖蟹類。在養(yǎng)殖過程中，為了防止青苔以及藍(lán)藻的暴發(fā)，含硫酸銅成分的藥物常會(huì)在生產(chǎn)中使用。銅離子在甲殼動(dòng)物體內(nèi)承擔(dān)著機(jī)體代謝、生長(zhǎng)發(fā)育和免疫調(diào)節(jié)的功能，對(duì)其造血、細(xì)胞繁殖以及酶的活性都有重要的影響，是甲殼動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的必需微量元素［1-2］。然而過量的銅離子不僅會(huì)引起水生生物各個(gè)器官和組織發(fā)生氧化損傷，還會(huì)引發(fā)神經(jīng)退行性疾病；但機(jī)體內(nèi)存在調(diào)節(jié)銅離子動(dòng)態(tài)平衡的機(jī)制，防止過量的銅離子對(duì)機(jī)體的毒害作用［3-4］。中華絨螯蟹對(duì)離子的吸收主要通過鰓呼吸作用、攝食吸收和體表吸附3種途徑［5-6］。自然條件下，水環(huán)境的銅離子大部分都是通過呼吸作用進(jìn)入鰓組織，再通過全身血淋巴循環(huán)和其他一系列的生理反應(yīng)運(yùn)輸?shù)缴眢w各個(gè)部位［7］。中華絨螯蟹鰓表面有一層較薄的粘液，水體中的銅離子通過呼吸作用進(jìn)入鰓組織后會(huì)被粘液吸附在鰓表皮，致使鰓中的銅離子含量較高，從而影響中華絨螯蟹鰓的離子轉(zhuǎn)運(yùn)和滲透壓平衡調(diào)節(jié)［8］。

腺苷三磷酸酶（ATPase）是中華絨螯蟹體內(nèi)重要的酶，參與細(xì)胞內(nèi)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)和滲透壓調(diào)節(jié)，廣泛存在于所有細(xì)胞中。從分子生態(tài)毒理學(xué)的角度來看，ATPase是一項(xiàng)評(píng)價(jià)環(huán)境污染壓力的重要參數(shù)［9-10］。鈉鉀ATP酶（Na+/K+-ATPase）能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈉/鉀離子的濃度；鈣ATP酶（Ca2+-ATPase）能夠維持細(xì)胞質(zhì)Ca2+處于靜息水平［11-12］。當(dāng)環(huán)境中銅離子濃度較高時(shí)，會(huì)造成水生生物中毒反應(yīng)，抑制ATPase的活性［13-14］。鑒于硫酸銅在中華絨螯蟹養(yǎng)殖中經(jīng)常被使用，本文測(cè)定了銅暴露后中華絨螯蟹鰓組織鈉鉀ATP酶和鈣ATP酶的活性，并從基因表達(dá)水平測(cè)定了鈉鉀腺苷三磷酸酶基因（NaK-ATPase）、V型腺苷三磷酸酶基因（V-ATPase）和鈉—鉀—氯共轉(zhuǎn)運(yùn)體基因（Na+/K+/2Cl--co-transporter，NKCC）的表達(dá)情況，從酶活性和基因表達(dá)這2個(gè)方面探討了銅離子對(duì)中華絨螯蟹鰓ATP酶的影響，旨在為中華絨螯蟹養(yǎng)殖中的硫酸銅應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用中華絨螯蟹來自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)中心陽澄湖蝦蟹綠色養(yǎng)殖基地。選擇個(gè)體健康的中華絨螯蟹（129.92±24.21） g，在玻璃缸中暫養(yǎng)7 d以適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境。每天18:00按體重的2%投喂一次成蟹飼料，投餌前吸凈殘餌。Na+/K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和BCA試劑盒均購(gòu)于南京建成海浩生物科技有限公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）試劑均購(gòu)于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；引物由亦欣生物科技（上海）有限公司合成。

1.2 銅離子脅迫試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)置5個(gè)銅離子濃度組，分別為0、0.17、0.69、2.77和11.08 mg/L。每個(gè)銅離子處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)試驗(yàn)8只中華絨螯蟹。水溫（21±2） ℃，pH值介于6.9～7.8，連續(xù)充氣，自然光照。當(dāng)飼養(yǎng)到第5天和第10天時(shí)，每個(gè)處理組隨機(jī)取6只中華絨螯蟹，冰浴麻醉后取鰓組織，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中，用于酶活性測(cè)定和RNA提取。

1.3 酶活性測(cè)定

取0.1 g鰓組織置于生理鹽水中漂洗，濾紙拭干，剪碎，加入9倍體積的0.9%生理鹽水，勻漿，3000 r/min離心10 min，取上清液用于酶活性測(cè)定。采用比色法測(cè)定ATP酶活性，Na+/K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和蛋白濃度測(cè)定均按照試劑盒說明進(jìn)行。ATP酶活性單位定義為：每小時(shí)每毫克組織中ATP酶產(chǎn)生1 μmol無機(jī)磷的量為1個(gè)酶活性單位。

1.4 qPCR檢測(cè)基因表達(dá)

采用Trizol提取鰓組織總RNA，用HiScriptⅡ Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qPCR反應(yīng)體系為20 μL：ddH2O 6 μL，2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，模板2 μL，10 μmol的上、下游引物各1 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；增加融解曲線步驟以驗(yàn)證引物的特異性。用2-ΔΔCt方法［15］計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。目標(biāo)基因NaK-ATPase、V-ATPase、NKCC的特異性引物如表1所示，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。

表1 試驗(yàn)所用基因的引物序列

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SE）表示，并使用SPSS軟件中的單因素方差分析（oneway ANOVA）和Duncan多重檢驗(yàn)分析各組間數(shù)據(jù)的差異性，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鰓Na+/K+-ATP酶活力

由圖1可以看出：當(dāng)中華絨螯蟹暴露5 d時(shí)，隨著水中銅離子濃度的升高，Na+/K+-ATP酶活力呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)銅離子濃度為0.69 mg/L時(shí)，Na+/K+-ATP酶的活力最高，與對(duì)照組和其他試驗(yàn)組均存在顯著差異（P＜0.05）。10 d時(shí)，Na+/K+-ATP酶的活力在銅離子濃度為0.69 mg/L時(shí)最高，對(duì)照組以及0.17、0.69 mg/L試驗(yàn)組間無顯著差異，但顯著高于2.77、11.08 mg/L試驗(yàn)組的（P＜0.05）。當(dāng)銅離子濃度為0.69 mg/L時(shí)，中華絨螯蟹暴露5和10 d的Na+/K+-ATP酶的活力存在顯著差異（P＜0.05），且5 d的Na+/K+-ATP酶活力大于10 d的。

圖1 CuSO4·5H2O暴露下中華絨螯蟹鰓 Na+/K+-ATP酶活力

2.2 鰓Ca2+-ATP酶活力

由圖2可以看出：當(dāng)中華絨螯蟹暴露5 d時(shí)，隨著銅離子濃度的升高，Ca2+-ATP酶活力呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。在銅離子濃度為0.69 mg/L時(shí)，Ca2+-ATP酶的活力最高，并且與其他試驗(yàn)組有顯著差異（P＜0.05）。10 d時(shí)，Ca2+-ATP酶活力在銅離子濃度為0.69 mg/L時(shí)最高，與其他試驗(yàn)組有顯著差異（P＜0.05）。濃度為0.17、2.77和11.08 mg/L的試驗(yàn)組與對(duì)照無顯著差異。不同濃度的試驗(yàn)組，Ca2+-ATP酶活力在5和10 d無顯著差異（P＞0.05）。

圖2 CuSO4·5H2O暴露下中華絨螯蟹鰓 Ca2+-ATP酶活力

2.3 鰓NaK-ATPase基因表達(dá)情況

由圖3可以看出：當(dāng)中華絨螯蟹暴露5 d時(shí)，隨著銅離子濃度的升高，NaK-ATPase基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，并且在銅離子濃度為0.69 mg/L時(shí)表達(dá)量最高。NaK-ATPase基因的表達(dá)量在銅離子濃度為0.17、0.69、2.77和11.08 mg/L時(shí)，試驗(yàn)組的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組的（P＜0.05）。10 d時(shí)，NaK-ATPase基因的表達(dá)量也呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)銅離子濃度為0.17、0.69 mg/L時(shí)，顯著高于其他組的（P＜0.05）。4個(gè)不同濃度的試驗(yàn)組，中華絨螯蟹暴露5和10 d的NaKATPase基因的表達(dá)量差異性顯著（P＜0.05），且5 d的NaK-ATPase基因表達(dá)量大于10 d的。

圖3 CuSO4·5H2O暴露下中華絨螯蟹鰓 NaK-ATPase基因的表達(dá)量

2.4 鰓V-ATPase基因的表達(dá)情況

由圖4可以看出：當(dāng)中華絨螯蟹暴露5 d時(shí)，V-ATPase基因的表達(dá)量在濃度為0.17 mg/L時(shí)最高、0.69 mg/L次之，且顯著高于對(duì)照組；當(dāng)濃度為2.77和11.08 mg/L時(shí)，試驗(yàn)組的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組的（P＜0.05）。10 d時(shí)，V-ATPase基因的表達(dá)量在濃度為0.17和0.67mg/L時(shí)較高，與其他試驗(yàn)組存在顯著差異（P＜0.05）；當(dāng)濃度為2.77 mg/L時(shí)，表達(dá)量與對(duì)照組無顯著差異（P＞0.05）；當(dāng)濃度為11.08 mg/L時(shí)，表達(dá)量低于對(duì)照組的（P＜0.05）。中華絨螯蟹暴露5和10 d的V-ATPase基因表達(dá)量均呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)。在4個(gè)不同濃度的試驗(yàn)組中，當(dāng)濃度為0.17和0.69mg/L時(shí)，中華絨螯蟹暴露5和10 d的V-ATPase基因表達(dá)量差異性顯著（P＜0.05），且5 d的V-ATPase基因表達(dá)量大于10 d的。

圖4 CuSO4·5H2O暴露下中華絨螯蟹鰓 V-ATPase基因的表達(dá)量

2.5 鰓NKCC基因的表達(dá)情況

由圖5可以看出：當(dāng)中華絨螯蟹暴露5 d時(shí)，銅離子暴露組的NKCC基因表達(dá)量升高，且隨著銅離子濃度的升高，NKCC基因的表達(dá)量基本上呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。在濃度為0.69、2.77、11.08 mg/L時(shí)，試驗(yàn)組的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組的（P＜0.05）。10 d時(shí)，濃度為0.17、0.69、2.77mg/L時(shí)，試驗(yàn)組的基因表達(dá)量低于對(duì)照組的，且差異顯著（P＜0.05）。

圖5 CuSO4·5H2O暴露下中華絨螯蟹鰓 NKCC基因的表達(dá)量

3 討論

3.1 銅對(duì)中華絨螯蟹鰓ATP酶活性的影響

Na+/K+-ATP酶鑲嵌于脂質(zhì)磷脂雙分子層，不僅可以催化生物體內(nèi)的ATP水解，還可以為Na+和K+的主動(dòng)運(yùn)輸提供能量，維持細(xì)胞內(nèi)高K+低Na+和細(xì)胞外高Na+低K+的狀態(tài)［16］。中華絨螯蟹鰓組織中Na+/K+-ATP酶位于鰓表皮離子轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，其活性被抑制會(huì)影響鰓的滲透壓和離子轉(zhuǎn)運(yùn)的功能，破壞中華絨螯蟹體內(nèi)滲透壓的平衡［17］。Morgan等［18］研究發(fā)現(xiàn)，虹鱒暴露于含銀的溶液8 h，Na+和K+的流入被100%抑制，鰓的滲透調(diào)節(jié)作用被嚴(yán)重干擾。本研究結(jié)果表明，當(dāng)銅離子暴露5和10 d時(shí)，隨著暴露濃度的增加，Na+/K+-ATP酶活性呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)CuSO4·5H2O濃度為0.69 mg/L時(shí)，Na+/K+-ATP酶活性最大；當(dāng)濃度為2.77、11.08mg/L時(shí)，Na+/K+-ATP酶活力下降。這表明銅濃度≤0.69 mg/L可以提高中華絨螯蟹鰓組織中的Na+/K+-ATP酶活性，高濃度的銅離子抑制Na+/K+-ATP酶活性。高春生等［19］研究發(fā)現(xiàn)，低濃度Cu2+（離子濃度＜0.30 mg/L）暴露，對(duì)黃河鯉組織Na+/K+-ATP酶活性具有促進(jìn)作用，高濃度Cu2+（離子濃度＞0.30 mg/L）對(duì)黃河鯉Na+/K+-ATP酶活性具有抑制作用。高濃度銅離子能夠抑制Na+/K+-ATP酶活性，可能是由于細(xì)胞內(nèi)積累了一定劑量的銅離子，造成細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，同時(shí)，銅離子與膜上蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)作用引起蛋白質(zhì)空間構(gòu)象發(fā)生變化，阻止了底物與蛋白質(zhì)的結(jié)合，從而抑制了ATP酶的活性，導(dǎo)致Na+/K+-ATP酶活性下降［20-22］。

Ca2+在信號(hào)傳導(dǎo)中有重要作用，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的各種生理功能。Ca2+-ATP酶位于細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜上，利用ATP提供能量，將細(xì)胞質(zhì)Ca2+主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外或細(xì)胞器內(nèi)，減輕過量Ca2+對(duì)細(xì)胞的毒害。吳婷婷等［24-25］研究發(fā)現(xiàn)，鉛離子、鎘離子能引起胞內(nèi)Ca2+濃度的增加，進(jìn)而引起Ca2+-ATP酶活性的增加。當(dāng)生物體處在缺氧、毒物的環(huán)境因素作用下，程度嚴(yán)重時(shí)，細(xì)胞膜會(huì)受到損傷進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的ATP缺乏，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+平衡遭到破壞，引起細(xì)胞凋亡、損傷甚至死亡［23］。本研究發(fā)現(xiàn)：試驗(yàn)暴露5 d時(shí)，銅離子濃度為0.17 mg/L的試驗(yàn)組Ca2+-ATP酶活力變化不明顯；當(dāng)濃度升高至0.69 mg/L時(shí)，Ca2+-ATP酶活性最高，胞漿內(nèi)離子濃度升高。說明銅離子的刺激，可能導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+含量的增加，刺激Ca2+-ATP酶活性升高，將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+泵出細(xì)胞或泵入細(xì)胞器，是維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)的一種補(bǔ)償機(jī)制［23］。當(dāng)銅離子濃度為2.77和11.08 mg/L時(shí)，其鰓組織Ca2+-ATP酶活性出現(xiàn)了明顯的下降。高濃度銅離子可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷，進(jìn)而導(dǎo)致Ca2+-ATP酶活性被抑制。試驗(yàn)暴露5和10 d時(shí)，Ca2+-ATP酶活性無顯著性差異，表明銅離子暴露時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)中華絨螯蟹鰓組織Ca2+-ATP酶活性的影響不大。

3.2 中華絨螯蟹鰓離子轉(zhuǎn)運(yùn)酶相關(guān)基因的表達(dá)量

本研究結(jié)果顯示，當(dāng)銅離子暴露5和10 d時(shí)，編碼Na+/K+-ATP酶的基因NaK-ATPase表達(dá)量隨著銅離子濃度的增加表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在濃度為0.69 mg/L時(shí)達(dá)到最大值，與ATP酶的活性一致，這表明銅離子脅迫使水體中離子濃度增大，為了維持機(jī)體離子平衡，Na+/K+-ATP酶活性增強(qiáng)，NaK-ATPase基因的表達(dá)量隨之增多。銅離子濃度升高會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，導(dǎo)致不能維持機(jī)體的滲透壓平衡，離子轉(zhuǎn)運(yùn)受阻，抑制了Na+/K+-ATP酶活性以及NaK-ATPase基因的表達(dá)量。4個(gè)不同濃度的試驗(yàn)組脅迫5 d時(shí)，Na+/K+-ATP酶活性比脅迫10 d的高，NaK-ATPase基因的表達(dá)量也呈現(xiàn)相似現(xiàn)象，這表明中華絨螯蟹鰓Na+/K+-ATP酶活性還受銅離子脅迫時(shí)間的影響，脅迫時(shí)間越長(zhǎng)，Na+/K+-ATP酶活性受抑制的程度越大，進(jìn)而說明銅離子對(duì)中華絨螯蟹Na+/K+-ATP酶活的影響具有時(shí)間效應(yīng)。同時(shí)，其他重金屬離子如Cd2+、Zn2+等對(duì)甲殼類動(dòng)物Na+/K+-ATP酶活性的抑制也具有劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)［27-28］。

V-ATP酶是一種多亞基的質(zhì)子泵，通過泵出H+產(chǎn)生膜內(nèi)外電勢(shì)差，使Na+通過Na+/H+交換器進(jìn)入膜內(nèi)［29］。當(dāng)銅處理濃度為0.17、0.69mg/L時(shí)，V-ATPase基因的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組的，說明此濃度的銅離子能夠激活該基因的表達(dá)；當(dāng)銅離子濃度為2.77、11.08mg/L時(shí)，V-ATPase基因的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組的，說明高濃度銅離子會(huì)抑制該基因的表達(dá)。銅脅迫10 d時(shí)，V-ATPase基因的表達(dá)量比5 d的有所降低。研究表明，縊蟶的V-ATPase在低鹽和高鹽度環(huán)境下參與滲透調(diào)節(jié)和離子轉(zhuǎn)運(yùn)過程［30］。本研究中，銅離子對(duì)V-ATPase基因表達(dá)的影響具有劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)。

NKCC能以1Na+∶1K+∶2Cl-的比例對(duì)組織中的離子進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，在細(xì)胞滲透壓調(diào)節(jié)、維持離子平衡、調(diào)節(jié)細(xì)胞體積等方面發(fā)揮了重要作用［31］。廖雅麗等［32］研究表明，魚體處于高滲環(huán)境下，機(jī)體NKCC被激活，向體外分泌離子，維持滲透壓平衡。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)暴露5 d時(shí)，NKCC基因的表達(dá)量先上升后下降，在銅離子濃度為0.69 mg/L時(shí)達(dá)到最高。銅離子脅迫剛開始時(shí)，中華絨螯蟹外界水環(huán)境中的銅離子濃度升高，細(xì)胞滲透壓增高，中華絨螯蟹啟動(dòng)機(jī)體的滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制，NKCC基因的表達(dá)量上升。隨著銅離子濃度的增大，NKCC基因的表達(dá)受到了抑制。試驗(yàn)暴露10 d時(shí)，銅離子濃度為0.17、0.69和2.77mg/L時(shí)，NKCC基因的表達(dá)量均比對(duì)照組的低，說明長(zhǎng)時(shí)間的銅離子脅迫抑制了NKCC基因的表達(dá)。

綜上，銅離子暴露影響了中華絨螯蟹鰓一系列離子轉(zhuǎn)運(yùn)酶的活性和基因表達(dá)水平，并且具有劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)。低濃度銅離子能夠提高中華絨螯蟹鰓ATP酶活性和基因表達(dá)水平，高濃度銅離子可抑制中華絨螯蟹鰓ATP酶活性和基因表達(dá)水平，并且隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活性和基因表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)。