牛 樂，趙穎異，韓永光

（河南中醫(yī)藥大學 藥學院，河南 鄭州 450046）

0 引言

地黃（Rehmannia glutinos）為玄參科地黃屬植物，其塊根為常用中藥地黃，為我國四大懷藥之一［1］。地黃的主要化學成分有環(huán)烯醚萜類、紫羅蘭酮類、糖類、氨基酸及苯乙醇苷類等，現(xiàn)代藥理學及臨床研究表明，地黃具有清熱養(yǎng)血、養(yǎng)陰生津等功效［2］；以地黃為原料的常用中藥藥方有很多，如六味地黃丸，杞菊地黃丸和知柏地黃丸等［3］；在臨床治療疾病過程中有著舉足輕重的地位，也是我國中藥市場中的大宗藥材之一。但由于土壤環(huán)境、化感自毒以及根際微生物群落改變等多種因素的影響，地黃植株的連作障礙極為明顯，導致地黃產(chǎn)量降低、易染病，嚴重影響了地黃的產(chǎn)量和質(zhì)量［4］。目前已經(jīng)采取了一些措施來改善地黃種植這一狀況，但依然存在地黃抗病性、產(chǎn)量與質(zhì)量相關遺傳基因研究薄弱等問題［5］。因此，利用分子生物學等技術手段研究地黃的抗病基因，對改善地黃品質(zhì)和提升其產(chǎn)量均有十分重要的作用［6］。

在生物和非生物脅迫之下，多種植物中均已發(fā)現(xiàn)抗病基因的表達［7］。PRs是植物受病原菌侵染或物理、化學、生物等多種因素刺激后所產(chǎn)生的一類蛋白質(zhì)，與系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）密切相關，常被作為 SAR 抗性的標志［8］。PRs基于其蛋白序列的相似性、酶活性和其他生物特征共分為17個家族，其中PR1蛋白是最早被發(fā)現(xiàn)的PRs蛋白家族，最早在煙草中被發(fā)現(xiàn)［9］。PR1被多次證明具有抑制病毒擴散、抵御真菌等微生物入侵以及提高植物抗逆境脅迫等多種功能，除此之外，在植物的非防御功能方面也體現(xiàn)出PR1蛋白的相關作用［10］。

本研究基于本實驗室前期的地黃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，克隆得到RgPR1基因，對PR1基因的基因序列和編碼的蛋白序列進行了分析，并進一步研究了水楊酸和茉莉酸對該基因組織特異性表達量的影響，為深入研究PR1基因的分子機制提供幫助，同時為培育抗病的地黃優(yōu)良品種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

地黃植株種植于河南中醫(yī)藥大學藥植園，經(jīng)鑒定為地黃（Rehmannia glutinosa），經(jīng)水楊酸或茉莉酸處理后收集地黃的根、莖和葉片，經(jīng)液氮速凍后，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

植物RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自北京天根生化公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和感受態(tài)細胞購自北京全式金生物公司；DNA Taq酶、限制性核酸內(nèi)切酶、pMD19-T Vector、T4 DNA ligase購自TaKaRa公司；QuantiNova SYBR Green PCR Kit購自QIAGEN公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 按照植物RNA提取試劑盒操作說明書提取地黃各組織的總RNA，總RNA的完整性、濃度及純度分別采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測和紫外分光光度法測定。以各組織總RNA為模板，Oligo（dT）20為引物，合成獲得cDNA，具體操作方法按照cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進行。

1.2.2PR1基因克隆 利用本研究團隊前期獲取的地黃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選得到地黃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中注釋為PR1且包含完整的開放閱讀框（ORF）的unigene，利用Premier 5.0軟件設計其特異性引物。以反轉(zhuǎn)錄得到的地黃各組織cDNA為模板，擴增PR1基因的 ORF 序列，PCR 反應條件分別為98 ℃，90 s；95 ℃，10 s；58 ℃，30 s；72 ℃，1 min；30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；使用1%瓊脂糖凝膠對擴增產(chǎn)物進行檢測后，回收目的條帶，并將目的條帶連接到pMD19-T載體上，采用熱激的方法將載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞，經(jīng)含有氨芐青霉素的LB平板篩選后挑取單菌落，經(jīng)菌落PCR鑒定后，將陽性單克隆進行測序。

1.2.3PR1基因的生物信息學分析 通過ORFfinder將核酸序列轉(zhuǎn)換為氨基酸序列，利用ExPASy-ProtParam Tool在 線 軟 件（https：//web.expasy.org/protparam/）對PR1基因進行氨基酸序列分析；使用SignalP信號肽分析軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對PR1蛋白進行信號肽分析；使用TMHMM Server 2.0在線軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對PR1蛋白質(zhì)進行跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)分析；使用InterPro Scan在線軟件（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/）對蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域進行分析；使用在線網(wǎng)站TargetP 2.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）對PR1在亞細胞結(jié)構(gòu)的定位進行分析；利用SOPMA在線網(wǎng)站（http://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home）預測分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。采用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）對PR1蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)進行分析；使用NCBI的Blastp進行多序列比對，并使用軟件MEGA 7.0構(gòu)建蛋白的系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 熒光定量PCR分析 為檢測PR1基因在地黃不同組織中的表達差異，采用熒光定量PCR測定經(jīng)水楊酸或茉莉酸處理后的地黃根、莖、葉中的PR1表達量。以地黃各組織提取的cDNA為反應模板，以RgTIP41基因為內(nèi)參，具體測定過程和統(tǒng)計分析方法參照趙樂等［11］的方法進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 PR1基因的克隆

根據(jù)本實驗團隊前期獲取的地黃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息， 發(fā)現(xiàn)1個注釋為病程性相關蛋白1（PR1） 的轉(zhuǎn)錄本， 長度為748 bp， 利用NCBI ORF Finder 分析表明其具有1個比較完整的ORF。根據(jù)基因序列信息，設計特異性引物（表1）。以地黃葉cDNA為模板，采用PCR技術對該基因進行擴增，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖1所示。電泳圖中目的條帶清晰且單一，約為670 bp，電泳結(jié)果與預期結(jié)果相符。根據(jù)測序結(jié)果表明，該片段基因長為668 bp，編碼163個氨基酸。

圖1 PR1基因克隆電泳圖

表1 基因克隆和熒光定量PCR引物

2.2 RgPR1基因編碼蛋白的生物信息學分析

2.2.1 PR1蛋白的理化性質(zhì)分析 登陸ExPASy-ProtParam Tool在線軟件，輸入PR1基因編碼的氨基酸序列，對其所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列進行分析得出：PR1蛋白分子式為C807H1206N234O237S11，相對分子質(zhì)量為18330.54，該蛋白質(zhì)等電點為8.17，其中含有帶負電荷的氨基酸（Asp + Glu）共11個，含有帶正電荷的氨基酸（Arg + Lys）共 13個。該蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為42.14，因此將其歸為不穩(wěn)定蛋白。

2.2.2 保守結(jié)構(gòu)域分析 使用Inter Pro Scan在線軟件對RgPR1蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域進行分析預測，結(jié)果如圖2所示，發(fā)現(xiàn)PR1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域只有1個，即位于28～163位氨基酸的CAP結(jié)構(gòu)域。所有已發(fā)現(xiàn)的植物PR1蛋白中均具有高度保守的 CAP結(jié)構(gòu)域，PR1蛋白發(fā)揮其抗病、抗逆等生理功能也主要依靠 CAP結(jié)構(gòu)域， 因此該結(jié)構(gòu)域也是鑒別植物PR1蛋白的重要依據(jù)之一。

圖2 RgPR1蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域預測

2.2.3 信號肽、亞細胞定位及跨膜區(qū)預測 根據(jù)SignalP信號肽在線分析軟件預測，RgPR1蛋白含有信號肽，很可能為分泌蛋白，根據(jù)TargetP在線網(wǎng)站預測顯示，RgPR1蛋白最有可能定位在細胞的分泌途徑中；根據(jù)TMHMM在線軟件預測顯示，RgPR1蛋白不含跨膜區(qū)。上述預測結(jié)果顯示，PR1蛋白含有信號肽，這表明其蛋白很可能是在核糖體中合成后，被運送到細胞中的其他部位，從而保證發(fā)揮其正常的生理功能。不含跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)則表明此蛋白不屬于跨膜蛋白，不參與跨膜運轉(zhuǎn)。

2.2.4 二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預測 通過SOPMA網(wǎng)站分析PR1蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，PR1蛋白二級結(jié)構(gòu)中含有α螺旋35.58%、β折疊17.79%、β轉(zhuǎn)角4.91%以及無規(guī)則卷曲41.72%；使用在線網(wǎng)站SWISS-MODEL對RgPR1蛋白進行同源性結(jié)構(gòu)建模預測發(fā)現(xiàn)，PR1蛋白與發(fā)病相關蛋白P14A的蛋白質(zhì)模板（1cfe.1.A）有75.37%的相似性，對第27～ 163位氨基酸殘基建模，模型的覆蓋率為82%，因此以發(fā)病相關蛋白P14A的蛋白質(zhì)模板進行RgPR1蛋白的三維結(jié)構(gòu)的預測（圖3）。

圖3 RgPR1蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)預測

2.2.5 多序列比對分析 使用NCBI數(shù)據(jù)庫中的Protein BLAST將RgPR1蛋白質(zhì)序列與前9種植物PR1蛋白質(zhì)序列進行相似性比對（圖4）。RgPR1基因同其他植物相似，25～162位氨基酸序列均比較保守，尤其在40～42、80～84、121～145等多個位點具有極高的相似性，說明RgPR1蛋白序列高度保守。

圖4 地黃與其他不同物種植物的PR1蛋白的氨基酸序列對比

2.2.6 系統(tǒng)進化樹分析 利用軟件MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，除了選取Protein BLAST相似性前9種同源序列之外，還選取了野茶樹、馬鈴薯、芥菜、擬南芥等多個物種植物中的PR1蛋白質(zhì)序列（圖5），RgPR1基因與選取的多數(shù)植物親緣性關系較近，其中與唇形科一串紅 （Salvia splendens） 的PR1蛋白親緣關系最近，同源系數(shù)達90%，說明兩者在功能上較為相似，另外，RgPR1蛋白與馬鈴薯（Solanum tuberosum）的PR1蛋白在親緣關系上非常相近。

圖5 地黃與不同物種植物PR1蛋白進化樹分析

2.3 水楊酸和茉莉酸對RgPR1基因組織特異性分析

由圖6可知，經(jīng)水楊酸和茉莉酸處理之后，RgPR1基因在根、莖、葉中的表達量均高于對照組，其中在葉中的表達量最高，根中次之，莖中最低，表明在水楊酸或茉莉酸的刺激誘導下，RgPR1基因的表達存在組織差異性。另外通過分析發(fā)現(xiàn)，水楊酸的刺激誘導會導致RgPR1表達量明顯高于茉莉酸的誘導，說明水楊酸比茉莉酸更易誘導RgPR1基因的表達，為地黃的抗病研究提供一定的參考價值。

圖6 水楊酸和茉莉酸刺激誘導后PR1基因在地黃 各組織的相對表達量

3 討論

PR1蛋白是CAP超家族的重要成員， PR1蛋白是17個家族中在受到病原體入侵后的表達上調(diào)程度最高的［12］，目前已成功克隆鑒定出多種植物的PR1基因［13-15］。PR1蛋白是低分子蛋白質(zhì)，在立體結(jié)構(gòu)中具有典型的夾心結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)可能對其穩(wěn)定性與蛋白酶的不穩(wěn)定性密切相關［16］。成熟的PR1蛋白無論在脊椎動物還是植物中，都具有高度保守的GHYTQVVW序列，通常含有6個形成二硫鍵的保守半胱氨酸殘基，總長約為135個氨基酸［17］。通過對擬南芥等多種植物分析發(fā)現(xiàn)，幾乎所有PR1蛋白都含有CAP結(jié)構(gòu)域，PR1蛋白發(fā)揮其抗病、抗逆等生理功能也主要依靠CAP結(jié)構(gòu)域，因此該結(jié)構(gòu)域也是鑒別植物PR1蛋白的重要依據(jù)之一［18］。本研究對RgPR1進行克隆和生物學信息分析發(fā)現(xiàn)，該基因共編碼163個氨基酸，約為18kDa，含有1個CAP保守結(jié)構(gòu)域，空間結(jié)構(gòu)具有α-β-α結(jié)構(gòu)，這些特征均與PR1家族高度吻合。且經(jīng)過對蛋白序列的進一步分析發(fā)現(xiàn)，RgPR1含有6個保守的PR1家族標志性的半胱氨酸殘基，同源性對比發(fā)現(xiàn)其與一串紅、馬鈴薯等植物都高度同源。

在生物進化中高度保守的結(jié)構(gòu)域使得PR1蛋白發(fā)揮著一種或多種重要功能［19］。三七中PnPR1基因的轉(zhuǎn)錄水平受到MeJA等信號的調(diào)控，表現(xiàn)出對根腐病菌的防衛(wèi)作用［20］。在水稻中，稻瘟病菌的誘導使PR1蛋白在老葉中積累更快，表達更高，因此老葉對稻瘟病的抗性比嫩葉更強，且植物色素可能通過調(diào)節(jié)SA和JA依賴的防御途徑間接增加PR1的表達［21］。也有實驗證明 PR1在病灶受限的細菌疾病中抑制細胞程序性死亡（PCD） 的同時，允許細菌保持無癥狀的局部內(nèi)生締合［22］。經(jīng)SA和JA處理后，發(fā)現(xiàn)RgPR1基因在不同組織中的表達均顯著增加，且在根、莖、葉中均表現(xiàn)出組織表達差異性，其在葉中表達量最高，而地黃連作對葉際效應影響顯著［23］，因此推測RgPR1可能對地黃連作障礙具有一定的作用。

本研究成功克隆得到RgPR1基因，該基因具有PR-1家族的普遍性特征和生物學特性，外源激素SA和JA能顯著增強其表達，為進一步研究地黃抗病和育種提供參考作用。