孟凡艷，王 旭，吳桐忠，張星星，韓猛立，張 倩，鐘發(fā)鋼，張滿義，張乾義，胡建軍，黃 新

（1.新疆農(nóng)墾科學(xué)院 省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000；2.塔里木大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；3.新疆方牧生物科技有限公司，新疆 圖木舒克 843999；4.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081）

牛支原體（Mycoplasma bovis）是引起牛肺炎、乳房炎、關(guān)節(jié)炎、中耳炎、角結(jié)膜炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎等多種疾病的病原體，也是牛呼吸道疾病綜合征（BRDC）的主要參與者［1］。1961年，美國(guó)首次從患有乳腺炎的牛乳中分離獲得該病原［2］。1983年，陳嘉棣等［3］首次從患有乳房炎的乳樣中分離到牛支原體；2008年，辛九慶等［4］首次從患肺炎的犢牛肺臟病料中分離到該病原；2011年，姚永進(jìn)等［5］經(jīng)過(guò)分離鑒定確定新疆北疆某些奶牛場(chǎng)犢牛出現(xiàn)嚴(yán)重肺炎的病原為牛支原體。牛支原體是導(dǎo)致?tīng)倥：粑腊Y狀的一種重要病原，牛支原體病的發(fā)生和流行，造成了養(yǎng)牛場(chǎng)較高的犢牛死淘率與重大經(jīng)濟(jì)損失。

牛支原體侵染犢牛會(huì)引起犢牛支氣管肺炎、關(guān)節(jié)炎、角膜結(jié)膜炎等疾病，但引起犢牛呼吸系統(tǒng)疾病的報(bào)道較多［6-8］。研究表明，牛支原體定殖在犢牛的鼻腔不會(huì)導(dǎo)致?tīng)倥０l(fā)病，當(dāng)出現(xiàn)斷奶、運(yùn)輸、劇烈的天氣變化等應(yīng)激因素導(dǎo)致?tīng)倥Ｃ庖吡ο陆禃r(shí)，牛支原體會(huì)侵襲犢牛的呼吸系統(tǒng)，引起一系列的臨床癥狀，包括咳嗽、喘、腹式呼吸等［9-10］。為了解病原攜帶狀態(tài)的犢牛在整個(gè)牛群里所占的比例，我們特地選取了石河子地區(qū)集約化奶牛場(chǎng)無(wú)臨床癥狀犢牛的鼻拭子樣品，使用PCR技術(shù)檢測(cè)犢牛的感染狀態(tài)，并通過(guò)分離鑒定進(jìn)一步確定，為更好地預(yù)防犢牛支原體感染提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 2020年9月，石河子地區(qū)某規(guī)?；膛?chǎng)2月齡犢牛發(fā)生以呼吸道癥狀為主的疫病，發(fā)病率為30%，病死率為40%～50%。采取2頭發(fā)病犢牛的肺臟組織，并對(duì)該場(chǎng)2月齡犢牛進(jìn)行鼻拭子樣品采集，所有的樣品運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室并置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑及儀器 PCR Super Mix、DL2000 DNA Marker，北京全式金生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，天根生化科技(北京）有限公司產(chǎn)品；PPLO肉湯、PPLO瓊脂、生化鑒定試管，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；丙酮酸鈉、氨芐青霉素鈉，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱，eppendorf公司產(chǎn)品；體視顯微鏡，Leica公司產(chǎn)品；PCR儀，ABI公司產(chǎn)品；電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 檢測(cè)方法與過(guò)程

1.2.1 臨床癥狀觀察及剖檢記錄 2頭發(fā)病犢牛的肺臟組織表面出現(xiàn)大小不一的結(jié)節(jié)狀突起以及不同程度的出血和肉變；采集的鼻拭子樣品中有15.56% (7/45）的犢牛表現(xiàn)出呼吸道癥狀，包括咳嗽、膿鼻涕、呼吸音異常、發(fā)熱等。

1.2.2 樣品的PCR檢測(cè) 對(duì)所采集的樣品，根據(jù)DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取樣品基因組DNA。以樣品基因組DNA為模板，參照Pinnow等［11］使用套式PCR方法擴(kuò)增牛支原體的oppD/F基因，一 輪PCR擴(kuò) 增 引 物 序 列 為：5′-TTTTAGCTCTT TTTGAACAAAT-3′，5′-GGCTCTCATTAAGAA TGTC-3′；二輪PCR擴(kuò)增引物序列為：5′-CCAG CTCACCCTTATACATGAGCGC-3′，5′-TGACTC ACCAATTAGACCGACTATTTCAC-3′。

預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段為442 bp，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系20 μL：Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，48 ℃/55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s/30 s，進(jìn)行20個(gè)/35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，將陽(yáng)性產(chǎn)物送至安徽通用生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 病料接種培養(yǎng) 將泡過(guò)肺臟病料與鼻拭子的上清使用0.22 μm濾膜過(guò)濾，吸取300 μL濾液至分裝好的3 mL PPLO肉湯中，混勻標(biāo)記為L(zhǎng)1，將其置于5 %CO2恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)3 d。選擇液體顏色由紅色變?yōu)辄S色的培養(yǎng)液，連續(xù)傳代2次。液體傳代完成后，取適量菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋，連續(xù)稀釋3次；取200 μL稀釋的菌液滴加至PPLO固體培養(yǎng)基中央，不斷旋轉(zhuǎn)平板使菌液在瓊脂上方均勻擴(kuò)散，標(biāo)記為固體S1代，將固體S1放入CO2培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)3～5 d。待培養(yǎng)基長(zhǎng)出針尖大小的菌落時(shí)，在顯微鏡下觀察菌落的形態(tài)特征；挑取典型的“煎蛋樣”菌落接種于固體培養(yǎng)基，純化3次后，于-80 ℃甘油中保存純化完成的菌株。

1.2.4 Dienes染色 參照吳移謀等［12］的方法，先將Dienes染液用超純水稀釋10倍，然后覆蓋于支原體培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基表面上，染色1 min后，用超純水洗去染液，在顯微鏡下觀察支原體菌落中心的顏色；如果菌落中心能明顯著色且呈現(xiàn)深藍(lán)色，則為支原體菌落。

1.2.5 生化試驗(yàn) 參照陸承平［13］的方法，根據(jù)生化試管說(shuō)明書，選擇葡萄糖發(fā)酵、精氨酸水解及甘露醇發(fā)酵等試驗(yàn)進(jìn)行操作。

1.2.6 菌株的PCR鑒定 純化后的菌液使用基因組DNA提取試劑盒提取分離株的基因組DNA。以國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G45的基因序列為模板，使用軟件primer 5.0設(shè)計(jì)PCR引物，擴(kuò)增牛支原體16S rRNA基 因，引 物 序 列：5′-GCGAAGGCAGCTAACTG GGCAT-3′、5′-CTCGGGCAGTCTCCTTAGAGTGCTC-3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為429 bp，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系20 μL：Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，將陽(yáng)性產(chǎn)物送至安徽通用生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。使用MEGA 6.0軟件，構(gòu)建牛羊源支原體屬常見(jiàn)菌株16S rRNA序列的遺傳進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測(cè)結(jié)果

使用牛支原體oppD/F基因?qū)?份肺臟樣品進(jìn)行檢測(cè)，均為PCR陽(yáng)性；對(duì)45份鼻拭子樣品進(jìn)行檢測(cè)，PCR總陽(yáng)性率為51.11% (23/45）。將陽(yáng)性結(jié)果與臨床癥狀相結(jié)合發(fā)現(xiàn)，具有呼吸道癥狀的犢牛陽(yáng)性率為28.57% (2/7），無(wú)臨床表現(xiàn)的犢牛陽(yáng)性率為55.26% (21/38）（表1）。

表1 鼻拭子樣品檢測(cè)結(jié)果

2.2 分離培養(yǎng)結(jié)果

對(duì)PCR鑒定為陽(yáng)性的肺臟病料與鼻拭子樣品進(jìn)行分離培養(yǎng)，共獲得了3株病原菌，均來(lái)自鼻拭子樣品，其中1株來(lái)自出現(xiàn)呼吸道癥狀的犢牛，2株來(lái)自無(wú)癥狀的犢牛，分別命名為Mb-SHZ01、Mb-SHZ02、Mb-SHZ03；使用王展慧等［14］的改良Thiaucourt’s固體培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，在光學(xué)顯微鏡下觀察，分離物與牛支原體典型菌落形態(tài)一致，呈“煎蛋樣”（圖1）。

圖1 分離株的菌落形態(tài)（40×）

2.3 Dienes染色

分離株經(jīng)Dienes染色后，菌落中心呈深藍(lán)色，而邊緣形成淺藍(lán)色的透明圈，且30 min內(nèi)不褪色（圖2），與牛支原體特征性菌落著色相符。

圖2 分離株Dienes染色結(jié)果（63×）

2.4 生化試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，Mb-SHZ01、Mb-SHZ02、Mb-SHZ03均不發(fā)酵葡萄糖，不分解甘露醇，不能水解精氨酸，符合牛支原體的生化試驗(yàn)特征。

表2 生化鑒定結(jié)果

2.5 PCR鑒定結(jié)果

以分離株基因組DNA為模板，以牛支原體16S rRNA通用引物擴(kuò)增，出現(xiàn)429 bp左右的條帶（圖3），與預(yù)期的目的條帶大小相符。

圖3 分離株16S rRNA引物PCR擴(kuò)增結(jié)果

將牛支原體16S rRNA引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果在Gen Bank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)分離株與牛支原體國(guó)際菌株NADC59(CP042939.1）的同源性最高，同源性均高達(dá)99.25%以上。使用Mega 6.0軟件，運(yùn)用Neighbor-joining法，對(duì)分離株與牛羊源支原體屬常見(jiàn)菌株的16S rRNA序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)（圖4）。從圖4中可以看出：分離株與牛支原體聚在同一分支；精氨酸支原體、關(guān)節(jié)炎支原體、牛眼支原體、綿羊肺炎支原體、殊異支原體親緣關(guān)系較近；山羊支原體與絲狀支原體位于同一分支；進(jìn)一步證明了分離株為牛支原體。

圖4 分離株與其他支原體16S rRNA序列的遺傳進(jìn)化樹(shù)

3 討論

牛支原體病常見(jiàn)的診斷方法有血清學(xué)診斷、分子生物學(xué)診斷、分離培養(yǎng)等。選擇PCR檢測(cè)鼻拭子樣品的原因是在動(dòng)物個(gè)體水平上，PCR技術(shù)可以檢測(cè)到間接排菌的現(xiàn)象［15］。oppD/F基因是牛支原體的1種特異性基因，檢測(cè)臨床樣品中的牛支原體，敏感性可達(dá)5 CFU/mL［16］。本實(shí)驗(yàn)使用牛支原體oppD/F基因特異性套式PCR方法檢測(cè)臨床樣品，檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可靠。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室對(duì)呼吸道合胞體病、副流感三型、牛傳染性鼻氣管炎病毒等進(jìn)行了PCR檢測(cè)，均為陰性。

研究結(jié)果表明，無(wú)癥狀犢牛牛支原體感染的陽(yáng)性率高于臨床癥狀明顯的犢牛，病原攜帶狀態(tài)的犢牛在群體中占有極大的比重，因此要做好犢牛的日常管理工作。共分離到3株病原菌，其中1株來(lái)自出現(xiàn)呼吸道癥狀的犢牛，2株來(lái)自無(wú)癥狀的犢牛，2份肺臟組織未分離到牛支原體。這與國(guó)外學(xué)者近幾年的研究結(jié)果極為相似，即在沒(méi)有任何臨床異常癥狀的情況下，從犢牛鼻拭子中分離到了牛支原體，且分離率高達(dá)34.3% (12/35）［17］。這與國(guó)外早些年的研究結(jié)果相反，Gourlay等［18］表示，健康牛幾乎不向外界排菌，樣本中也很難分離到牛支原體。本實(shí)驗(yàn)室未從肺組織樣本中分離到牛支原體，可能是由于牛支原體在肺組織中的濃度過(guò)低［19］。

本試驗(yàn)共獲得3株牛支原體菌株，試驗(yàn)前期牛支原體菌落生長(zhǎng)不良，形態(tài)過(guò)小，無(wú)法挑取單個(gè)菌落；后期將培養(yǎng)基中葡萄糖和丙酮酸鈉的含量由2 g/L提高到4 g/L后，牛支原體生長(zhǎng)密度適宜且形態(tài)特征明顯?？赡茉蚴潜徕c為碳源，碳源充足方可保證牛支原體的生長(zhǎng)。因支原體細(xì)胞壁缺失，革蘭染色著色不良；使用狄氏染色后，中心呈深藍(lán)色，邊緣為顏色較淺的透明圈。生化試驗(yàn)結(jié)果符合牛支原體的特征。本研究對(duì)新疆犢牛支原體肺炎的診斷具有一定的指導(dǎo)作用，為今后開(kāi)展牛支原體疫苗制備等研究奠定了基礎(chǔ)。關(guān)于分離株的耐藥情況及疫苗制備方面還有待進(jìn)一步試驗(yàn)研究。