周美玲，曾 軍*，張志勇，蔡建榮，江 巍，張文斌

（1.龍巖市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建 龍巖 364000；2.龍巖市新羅區(qū)良種繁育場，福建 龍巖 364000）

0 引言

百香果，學(xué)名西番蓮，系西番蓮科（Passifloraceae）西番蓮屬（Passiflora）的一種攀緣木質(zhì)藤本植物，原產(chǎn)于南美洲巴西等地，在我國主要分布于廣東、福建、廣西、云南、浙江等地［1-3］。近年來，隨著國內(nèi)百香果的種植面積逐年增大，市場對種苗的需求量也越來越大。然而，目前以扦插、嫁接、實生苗繁殖為主的百香果種苗普遍存在質(zhì)量參差不齊、苗木帶病毒等問題，制約了百香果產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)危害侵染百香果的病毒共有26種［4］，田間癥狀主要表現(xiàn)為葉片花葉、環(huán)斑、皺縮、壞死、黃葉、畸形、死頂、果實畸形、木質(zhì)化等，植株發(fā)病率一般在30%～40%，嚴重的達90%以上。因此亟須開展百香果無病毒優(yōu)質(zhì)種苗的繁育技術(shù)研究，從源頭上控制病毒病的發(fā)生危害，確保百香果產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。

目前，培育無病毒植物苗木的方法通常是莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)。莖尖培養(yǎng)可以從植物組織中脫除病毒，形成無病毒植株。莖尖大小對成活率和脫毒率具有很大的影響，莖尖越大，分化率和成活率越大，但脫毒率越低；莖尖越小，雖然脫毒率提高，但分化率和成活率又大大降低，易造成外植體死亡，導(dǎo)致組織培養(yǎng)脫毒失?。?］。因分生組織中不存在病毒，可采用成熟組織作為外植體，誘導(dǎo)其產(chǎn)生愈傷組織，通過提取其中的部分分生組織，培育出由分生組織分化的脫毒苗木。該方法在脫除植物病毒方面具有明顯優(yōu)勢：（1）操作極為方便，無須借助體視顯微鏡。（2）分化率和成活率更高。傳統(tǒng)莖尖培養(yǎng)的脫毒苗，由于外植體太小，外植體分化為組培苗的難度較大，接種后的外植體易死亡，導(dǎo)致成苗率較低。采用成熟組織作為外植體，分化率和成活率相對更高。（3）采用成熟組織作為外植體，即使生成的脫毒苗較少，也可以通過組織培養(yǎng)技術(shù)進行快速繁殖，不影響脫毒培養(yǎng)［6］。

近年來，國內(nèi)在百香果離體再生體系研究方面取得了一定的進展，主要以子葉、下胚軸、莖段、胚乳、子房、根、腋芽、卷須等作為外植體建立的離體再生體系，品種多以紫果百香果為主［7-8］，而利用百香果成熟組織為外植體建立再生體系并獲得脫毒組培苗的研究鮮見報道。本研究以福建百香果3號（黃果百香果）的成熟莖段為材料，將其滅菌處理后，進行愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽誘導(dǎo)分化成苗，經(jīng)病毒檢測后，挑選病毒陰性的繼代苗擴大繁殖，直至長出良好的根系后馴化、移栽，以期為今后工廠化繁育無毒健壯優(yōu)質(zhì)的百香果種苗提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

在龍巖市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所大棚內(nèi)選取長勢良好的福建百香果3號新抽10～20 cm的枝條作為外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的滅菌 將取回的嫩枝剪除葉片，用自來水沖洗干凈，置于1%洗衣粉溶液中浸泡5 min，再用流水沖洗干凈。將沖洗好的材料放入滅菌玻璃瓶中并置于超凈工作臺上，用75%酒精消毒10 s，無菌水沖洗3次，再用0.1%的HgCl2溶液浸泡10 min。在滅菌過程中需輕搖晃滅菌瓶，以保證滅菌劑全面浸泡外植體。滅菌完后再用無菌水沖洗4～5次，每次間隔3～5 min，最后用無菌濾紙吸干外植體表面的水分，備用。

1.2.2 莖段愈傷組織的誘導(dǎo) 試驗設(shè)5個處理以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/L）的6-BA至MS培養(yǎng)基，每個處理各5瓶。將滅菌過的枝條剪成長度為0.8～1.2cm的無芽莖段，接種于培養(yǎng)基中，每瓶接種3個莖段（用鑷子將莖段直立插入培養(yǎng)基中），2次重復(fù)，于接種后第30天統(tǒng)計愈傷組織的出愈率及生長情況，探討不同激素組合對百香果莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響。出愈率［9］的計算公式為：

1.2.3 愈傷組織不定芽的誘導(dǎo)分化 將誘導(dǎo)出的愈傷組織切割為0.5 cm2左右的小塊，接種到MS培養(yǎng)基，添加不同濃度6-BA、NAA、土豆泥至培養(yǎng)基中。分別以6-BA添加量、NAA添加量、土豆泥用量為試驗因素，每個因素設(shè)定3個水平（表1），利用L9（34）正交試驗，以芽誘導(dǎo)率為指標，確定最佳的組合。每個處理接種15瓶，2次重復(fù)。于第30天統(tǒng)計愈傷組織不定芽的分化率及生長情況，探討不同處理組合對百香果愈傷組織不定芽誘導(dǎo)分化的影響。芽誘導(dǎo)率［10］的計算公式為：

表1 正交試驗的因素水平

1.2.4 不定芽誘導(dǎo)成苗培養(yǎng) 將誘導(dǎo)分化培養(yǎng)所得的不定芽分成單株，接種到MS培養(yǎng)基，添加不同濃度和組合的NAA、IBA的不定芽誘導(dǎo)生根成苗培養(yǎng)基中，設(shè)置3個處理，每個處理接種5瓶，每瓶接種1個芽，3次重復(fù)。于第30天統(tǒng)計生根率及根系生長情況，探討不同激素濃度組合對百香果不定芽誘導(dǎo)生根成苗的影響。生根率［11］的計算公式為：

1.2.5 病毒檢測 待增殖培養(yǎng)的苗木數(shù)量達到較大時，挑選出生長最健壯的20瓶，分別對其進行編號，每個樣品取50～100mg葉片提取總核酸，采用酶聯(lián)免疫吸附法RT-PCR進行鑒定。對百香果斑駁病毒（PaMV），夜來香花葉病毒（TeMV）、東亞西番蓮病毒（EAPV）、西番蓮潛隱病毒（PLV）、黃瓜花葉病毒（CMV）等5種病毒分別采用各自病毒的特異引物進行檢測；20 μL反轉(zhuǎn)體系中，RNA加入量為1μL；PCR循環(huán)數(shù)為31個循環(huán)。

1.2.6 脫毒苗擴繁培養(yǎng) 對經(jīng)檢測已脫毒的脫毒苗株系進行擴繁培養(yǎng)基篩選。以MS為培養(yǎng)基，添加6-BA（0.5 mg/L）、不同濃度的IBA（0.1、0.2、0.3mg/L）及蔗糖（20、30 g/L）共配置6種培養(yǎng)基，將選取組培苗單節(jié)（帶芽）莖段扦插在培養(yǎng)基上，每個處理接種10瓶，每瓶接2個莖段，生長30 d后，調(diào)查株高、莖粗、鮮重以確定不同配比培養(yǎng)基對脫毒組培莖段成苗的影響。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本試驗數(shù)據(jù)采用DPS軟件包建立數(shù)據(jù)庫，完成正交試驗設(shè)計及統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對百香果莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響

外植體接進培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，莖切面的切口處開始膨大，10～12 d后在切口處開始形成淺綠色的愈傷組織點，再經(jīng)過一段時間培養(yǎng)后，愈傷組織上形成嫩綠色的芽點，后續(xù)生長出不定芽。從30 d后的統(tǒng)計結(jié)果（表2）可以看出，不同濃度激素對百香果莖段愈傷組織的誘導(dǎo)具有較大的差異，其中處理3的出愈率最高，為83.33%，愈傷組織為綠色，顆粒狀較密實，有部分芽點和不定芽分化（圖1）。在低濃度時，隨著6-BA濃度的升高，愈傷組織的出愈率逐漸增加，當6-BA濃度為1.5 mg/L時，愈傷組織的出愈率達到最高；隨著6-BA濃度的繼續(xù)增加，愈傷組織的出愈率開始下降。通過比較得出，百香果莖段愈傷組織誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖 20 g/L+瓊脂 7 g/L。

表2 不同濃度激素處理對莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響

圖1 愈傷組織的誘導(dǎo)

2.2 不同處理對百香果愈傷組織不定芽誘導(dǎo)分化的影響

在莖切面愈傷組織誘導(dǎo)分化成苗的試驗過程中發(fā)現(xiàn)，愈傷組織的分化較愈傷組織的誘導(dǎo)難度更高，愈傷組織誘導(dǎo)分化不定芽是本研究的最難點。根據(jù)正交試驗極差分析和方差分析可知，6-BA添加量、NAA添加量、土豆泥用量3種因素對芽誘導(dǎo)率的影響達到極顯著水平（表3、表4）。影響芽誘導(dǎo)率高低的因素主次順序為：6-BA添加量＞NAA添加量＞土豆泥用量。理論最優(yōu)組合為A2B1C3，即以MS培養(yǎng)基+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.1 mg/L+土豆泥200 g/L +蔗糖20 g/L組合的芽誘導(dǎo)效果最好，其不定芽誘導(dǎo)率為46.70%。愈傷組織誘導(dǎo)分化出不定芽的效果見圖2。

表3 不定芽誘導(dǎo)的正交試驗結(jié)果分析

表4 各指標方差分析結(jié)果

圖2 愈傷組織誘導(dǎo)分化不定芽

2.3 不同激素處理組合對不定芽誘導(dǎo)生根成苗的影響

由表5可以看出，在培養(yǎng)基中添加3種不同濃度的IBA和NAA 0.2 mg/L組合，均能誘導(dǎo)生根，但不同處理組合對生根誘導(dǎo)的效果存在一定的差異。在3個處理中，以IBA 1.0 mg/L和NAA 0.2 mg/L組合的誘導(dǎo)生根效果最好，生根率達93.33%。該組合與其他處理相比，根系較粗壯，根多且長（圖3）。

表5 不同激素處理組合對不定芽誘導(dǎo)生根成苗的影響

圖3 不定芽誘導(dǎo)生根成苗

2.4 病毒檢測

通過RT-PCR檢測技術(shù)，由龍巖市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供的20份百香果組培苗樣品（編號為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1A、1B、2A、2B、2C、3A、3B、4A、4B、4C）的病毒檢測結(jié)果（圖4）為：所有樣品均未檢測到EAPV和PLV；樣品編號1、2A、2B檢測到PaMV；樣品編號3B檢測到TeMV；樣品編 號1、2、8、9、1A、1B、2A、2B、3A、3B、4B均 檢測到CMV。送檢的20份百香果組培苗樣品有9份均不帶CMV、EAPV、PLV、PaMV和TeMV等5種病毒，脫毒率為45%。

圖4 福建百香果3號的病毒檢測跑膠圖

2.5 不同處理對百香果脫毒組培苗擴繁的影響

由表6可以看出，百香果莖節(jié)在MS培養(yǎng)基+6- BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L的組合中的脫毒苗生長效果較佳，表現(xiàn)為：株高8.03 cm，莖粗0.58 cm，鮮重0.42 g；經(jīng)過40 d左右可發(fā)育成6～10 cm高的完整植株。培養(yǎng)一批脫毒苗的周期為40～50 d。

表6 不同激素配比對百香果組培苗擴繁的影響

3 結(jié)論與討論

在福建百香果3號愈傷組織的誘導(dǎo)試驗中，以MS培養(yǎng)基+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂7 g/L的組合誘導(dǎo)效果最好，其誘導(dǎo)出愈率為83.33%；在愈傷組織誘導(dǎo)分化不定芽中，以MS培養(yǎng)基+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.1 mg/L+土豆泥200 g/L+蔗糖20 g/L的組合誘導(dǎo)效果最好，其不定芽誘導(dǎo)率為46.70%；在不定芽誘導(dǎo)成苗中，MS基本培養(yǎng)基+IBA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L的組合誘導(dǎo)生根效果最好，生根率達93.33%；在脫毒苗快繁培養(yǎng)中，以MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L組合的效果最好，表現(xiàn)為生根快、莖粗壯，幼苗長勢好。在上述試驗中，愈傷組織誘導(dǎo)分化不定芽是難點，也是百香果離體培養(yǎng)得到脫毒組培苗的關(guān)鍵技術(shù)。本研究中，愈傷組織的分化較愈傷組織的誘導(dǎo)難度更高，愈傷組織分化不定芽的誘導(dǎo)率最高為46.70%，顯著低于愈傷組織的出愈率（83.33%）。梁春輝等［12］在研究百香果莖段愈傷組織誘導(dǎo)分化的試驗中，愈傷組織的最高誘導(dǎo)率為70.00%，愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的誘導(dǎo)率最高為40.00%。孫琪等［10］在研究百香果組織培養(yǎng)技術(shù)研究中，莖段愈傷組織的最高誘導(dǎo)率為66.67%，愈傷組織不定芽的誘導(dǎo)率最高為55.56%。從研究結(jié)果可以看出，愈傷組織再分化不定芽的誘導(dǎo)率顯著低于愈傷組織的誘導(dǎo)率，說明百香果愈傷組織誘導(dǎo)分化不定芽的相關(guān)方法還有待進一步研究，從而實現(xiàn)誘導(dǎo)分化率的提高。

在病毒檢測試驗發(fā)現(xiàn)，20份百香果組培苗樣品中有9份均不含CMV、PaMV、TeMV、EAPV和PLV，脫毒率達到45%。這說明如果組培快速繁苗的速度足夠快，利用百香果莖段愈傷組織為外植體建立再生體系獲得脫毒組培苗這項技術(shù)完全可以滿足保存優(yōu)良種質(zhì)資源和培育工廠化優(yōu)質(zhì)脫毒種苗的需求。但愈傷組織脫毒方法的缺陷是植株遺傳性狀存在不穩(wěn)定性，可能會產(chǎn)生變異植株［13］，在后續(xù)研究中將重點觀察評價脫毒苗的田間表現(xiàn)。