王五權(quán)，張得平，彭麗娟，孔 菲，孫成龍，桑維鈞，盧燕回，楊茂發(fā)

(1.中國(guó)煙草總公司 廣西壯族自治區(qū)公司，廣西 南寧 530022；2.貴州大學(xué) 煙草學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

煙草青枯病是由青枯勞爾氏菌(R.solanacearum)引起的一種土傳病害[1]。是一種高溫高濕型病害，溫度和濕度是病害發(fā)生和流行的先決條件。青枯病發(fā)病最適宜的溫度為30～35 °C。濕度是影響該病發(fā)病流行的另一重要因素，我國(guó)南方夏季溫度高、雨量多、濕度大，導(dǎo)致青枯病發(fā)展快，為害較重。煙草青枯病在苗期和大田期均可發(fā)病，作為典型的維管束病害，根、莖、葉均可受害，但以根、莖危害為主，煙株一旦染病常造成整株死亡，嚴(yán)重危害煙草生長(zhǎng)和品質(zhì)，造成產(chǎn)量和質(zhì)量的毀滅性損失，嚴(yán)重阻礙煙草種植業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展[2-3]。

煙草黑脛病是世界煙草生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的病害之一，同時(shí)也是我國(guó)煙草主要土傳病害，其病原為煙草疫霉(P.nicotianae)[4]，該菌可為害煙草整個(gè)生育期，尤其是移栽后的大田煙株，侵染煙莖基部，發(fā)病初期在莖基部形成黑斑，條件適宜時(shí)，黑斑向上擴(kuò)展，直至全株腐爛，病部布滿菌絲和孢子囊并傳染附近煙株。煙草黑脛病也屬高溫高濕型病害，最適發(fā)病溫度為24.5～32 °C，而且病株上產(chǎn)生的孢子囊和游動(dòng)孢子借雨水或灌溉水、帶菌的土壤、糞肥傳播[5]。煙草黑脛病菌以卵孢子、厚垣孢子和菌絲體隨病株殘?bào)w在土壤中越冬[6]。該病在煙田易發(fā)生蔓延，破壞性極強(qiáng)，對(duì)煙草生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響。

煙草黑脛病和青枯病均屬于高溫高濕病害，發(fā)病條件相近，故經(jīng)?；旌习l(fā)生，危害十分嚴(yán)重，且難以防治，常對(duì)煙田造成毀滅性破壞，而且兩種病原菌有很強(qiáng)的越冬能力，一旦二者成功定殖煙田，會(huì)造成煙田多年無法種植煙草。廣西壯族自治區(qū)地處長(zhǎng)江以南，屬亞熱帶季風(fēng)氣候，氣候溫暖，雨量充沛，適宜煙草種植，成為全國(guó)最具發(fā)展種植優(yōu)質(zhì)煙葉潛力的產(chǎn)區(qū)之一[7]，得天獨(dú)厚的自然條件為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)煙葉提供了良好的氣候條件，但同時(shí)也利于煙草青枯病和黑脛病的發(fā)生及流行，烤煙是廣西的主要經(jīng)濟(jì)作物之一，種植面積約1700 hm2，是農(nóng)民脫貧致富的主要經(jīng)濟(jì)來源，隨著煙田連作年限的延長(zhǎng)，煙草青枯病和黑脛病近年來發(fā)生普遍，嚴(yán)重影響烤煙的產(chǎn)量和品質(zhì)，已經(jīng)是限制烤煙發(fā)展的重要障礙。本研究對(duì)廣西烤煙主產(chǎn)區(qū)病害進(jìn)行調(diào)查，明確現(xiàn)階段引起廣西煙草主要病害的種類、分布以及危害程度，為掌握煙草病害的發(fā)生發(fā)展規(guī)律和制定合理有效的防治措施奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試標(biāo)本采集

2021年5～6月，于廣西賀州、百色及河池等3市主要煙區(qū)采集具有典型煙草青枯病、黑脛病癥狀的標(biāo)本，具體地點(diǎn)見表1。每塊發(fā)病煙田至少采集3株病株。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1煙草青枯病菌分離和鑒定

分離方法：選取新鮮的發(fā)病植株，從莖部的病健結(jié)合處切取少量組織，先以滅菌水清洗2～3次，在超凈工作臺(tái)晾干磨碎后加入10 mL滅菌水。28 °C、200 r/min 培養(yǎng)30 min。分別采用組織分離法、病株根圍土壤樣品平板梯度稀釋法[8]和直接菌液稀釋法等3種方法分離煙草青枯菌，所用培養(yǎng)基為參照劉艷霞[9]的方法配制改良的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基加入多種抑制真菌和放線菌的抗生素以及TTC，因此只能分離出致病性細(xì)菌，且致病性越強(qiáng)，菌落顏色越深。

快速鑒定方法：分別將青枯病菌單菌落挑取到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，30 ℃，220 rpm，培養(yǎng)3～4 h后進(jìn)行多重菌落PCR。利用NCBI Primer-BLAST 在線設(shè)計(jì)16SrDNA、speI和rpsS基因的部分序列的保守區(qū)片段引物，為快速檢測(cè)，控制擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在1000 bp以下，16SrDNA-f:ACTAACGAAGCA GAGATGCATTA，16SrDNA-r:CCCAGTCACGGCAG AGACT，speI-f:GTCGCCGTCAACTCACTTTCC，speI-r:GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG，rpsS-f:GATCG TCAAACCGATGAAGTC，rpsS-r:GATATGAC TCGTTCCGCAAAA。用高效擴(kuò)增酶和快速擴(kuò)增程序，擴(kuò)增16SrDNA、speI和rpsS基因的部分序列，擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果在Genebank中進(jìn)行序列比對(duì)。

1.2.2煙草黑脛病菌分離和鑒定

分離方法：參考鄭小波[10]的方法，選擇典型病株(圖1)切取煙株莖基部病健交界組織，剪成小塊，表面消毒后，置于燕麥培養(yǎng)基平板(參考方中達(dá)[11])上，28 ℃培養(yǎng)2～4 d后，根據(jù)菌絲形態(tài)進(jìn)行分離純化并保存。

鑒定方法：純化后的煙草黑脛病菌，采用CTAB 法[12]提取總基因組DNA，PCR擴(kuò)增部分ITS序列，擴(kuò)增程序參考Pascual[13]的方法，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在Genebank中進(jìn)行序列比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草青枯病、黑脛病混合發(fā)生情況初探

從廣西12個(gè)主產(chǎn)煙區(qū)采集煙草青枯病和黑脛病標(biāo)本共116余份。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同煙區(qū)煙草青枯病和黑脛病發(fā)生情況存在差異。河池市南丹縣六寨鎮(zhèn)采集標(biāo)本2次，5月22日采集的標(biāo)本發(fā)現(xiàn)煙草黑脛病與青枯病混合發(fā)生；6月13日未采集到煙草黑脛病與青枯病標(biāo)本；河池市南丹縣八圩鄉(xiāng)采集的標(biāo)本從外部癥狀上看為煙草青枯病，帶回實(shí)驗(yàn)室縱剖感病煙株后發(fā)現(xiàn)部分為煙草黑脛病與青枯病混合發(fā)生。百色市隆林縣德峨鎮(zhèn)、蛇場(chǎng)鄉(xiāng)采集的標(biāo)本均為煙草黑脛病，未采集到煙草青枯病標(biāo)本。

表1 煙草青枯病、黑脛病標(biāo)本采集時(shí)間地點(diǎn)

靖西市新甲鄉(xiāng)、地州鎮(zhèn)、魯利鎮(zhèn)和同德鄉(xiāng)等4個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)采集的標(biāo)本有的僅發(fā)生煙草青枯病，有的煙草黑脛病和煙草青枯病混合發(fā)生。賀州市鐘山縣公安鎮(zhèn)，富川縣福利鎮(zhèn)和葛坡鎮(zhèn)采集的標(biāo)本以煙草青枯病為主，有的煙草黑脛病和煙草青枯病混合發(fā)生。

從靖西市新甲鄉(xiāng)、地州鎮(zhèn)、魯利鎮(zhèn)和同德鄉(xiāng)等4個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)，隆林縣蛇場(chǎng)鄉(xiāng)和德峨鎮(zhèn)，南丹縣八圩鄉(xiāng)和六寨鎮(zhèn)，鐘山縣公安鎮(zhèn)，富川縣福利鎮(zhèn)和葛坡鎮(zhèn)等鄉(xiāng)鎮(zhèn)煙田采集的標(biāo)本中隨機(jī)選取24株發(fā)病煙株觀察癥狀，從癥狀上判斷，煙草黑脛病和煙草青枯病混合發(fā)生的病株有13株(54.17%)，以靖西市新甲鄉(xiāng)、地州鎮(zhèn)和魯利鎮(zhèn)，鐘山縣公安鎮(zhèn)，富川縣福利鎮(zhèn)和葛坡鎮(zhèn)等地混合發(fā)生情況最為普遍(圖1)。

圖1 煙草青枯病與黑脛病混合發(fā)生的病株Fig.1 Tobacco bacterial wilt co-infection with black shank in Guangxi

2.2 煙草青枯病菌、黑脛病菌分離

從廣西12個(gè)主產(chǎn)煙區(qū)采集116份標(biāo)本，分離到煙草青枯病菌103株，煙草黑脛病菌13株。

將青枯病發(fā)病煙株近根莖部橫切，切開后可見維管束已病變，顏色變?yōu)楹诤稚⒑谏?。靜置10 min后，發(fā)病較輕的有少許白色或微黃色菌液溢出；發(fā)病嚴(yán)重的，表皮和木質(zhì)部間溢出白色或微黃的菌液。青枯病菌在篩選培養(yǎng)基上，菌落為圓形，稍隆起，菌落中央呈紅色有光澤，周圍紅色稍淺，流動(dòng)性較強(qiáng)，呈典型的青枯雷爾氏菌菌落形態(tài)(圖2-a)。

注：a為篩選培養(yǎng)基分離青枯菌；b為燕麥培養(yǎng)基分離黑脛病菌。圖2 煙草青枯病菌與黑脛病菌菌落形態(tài)Fig.2 Colony of R.solanacearum and P.nicotianae on media

縱剖黑脛病莖稈，可見髓部變?yōu)楹诤稚?，干縮呈碟片狀，碟片之間有白色菌絲。煙草黑脛病菌在燕麥培養(yǎng)基上氣生菌絲生長(zhǎng)旺盛，呈白色絮狀，菌落質(zhì)地均勻(圖2-b)。

2.3 煙草青枯病菌的鑒定

采用多重PCR技術(shù)對(duì)分離的青枯菌進(jìn)行菌落PCR。結(jié)果表明：103株菌均可同時(shí)擴(kuò)增得到大小分別為500 bp部分16S rDNA 序列、281 bpspeI基因的部分序列和180 bprpsS基因的部分序列的特異性擴(kuò)增片段，將擴(kuò)增的DNA片段切膠回收后測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在Genbank中比對(duì)，發(fā)現(xiàn)103株細(xì)菌均為青枯勞爾氏菌(R.solanacearum)。

2.4 煙草黑脛病菌的鑒定

顯微鏡下觀察黑脛病菌絲粗細(xì)不均勻，有菌絲膨大體，在膨大體上常有若干放射狀菌絲，厚垣孢子球形，頂生，孢子囊梨形(圖3-a)。將純化后的煙草黑脛病菌提取總DNA，PCR擴(kuò)增部分ITS序列，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(圖3-b)，將PCR產(chǎn)物測(cè)序后，結(jié)果在Genebank中進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果表明，測(cè)序菌株均為煙草疫霉(P.nicotianae)。

注：a為煙草疫霉厚垣孢子和孢子囊; b為部分煙草黑脛病菌ITS片段凝膠電泳結(jié)果。圖3 煙草黑脛病菌鑒定Fig.3 Identification of tobacco P.nicotiana

3 結(jié)論與討論

田間采集帶回的標(biāo)本，將煙株根莖部橫切后，分為3種類型：以青枯病癥狀為主，以黑脛病癥狀為主，青枯病與黑脛病混合發(fā)生為主。煙草青枯病和黑脛病均為煙草土傳性病害，病株根莖相交處都可呈黑色壞死癥狀，田間常見兩種病害混合侵染。煙苗移栽期因外力扯拉易造成煙草根系損傷，病田殘留病菌易侵染煙苗，如先感染其中一種病害，都可能導(dǎo)致容易感染其他病害并加重為害[14-15]。

廣西煙區(qū)夏季高溫多雨的氣候條件適合生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)煙葉，同時(shí)也適宜青枯病和黑脛病的發(fā)生與流行，容易造成大面積發(fā)病。通過調(diào)查，基本掌握了廣西主要植煙區(qū)煙草青枯病與黑脛病發(fā)生為害情況，隆林縣蛇場(chǎng)鄉(xiāng)和德峨鎮(zhèn)以煙草黑脛病為主，南丹縣六寨鎮(zhèn)與八圩鄉(xiāng)煙草青枯病與黑脛病混合發(fā)生，但較靖西市、富川縣和鐘山縣發(fā)病輕，其他煙區(qū)煙草黑脛病和青枯病均存在普遍復(fù)合侵染現(xiàn)象。不同縣之間煙田發(fā)病有一定差異，導(dǎo)致這些差異的原因除了不同地區(qū)的生態(tài)條件和環(huán)境因素外，煙田不同的耕作和管理模式差異也是重要原因。研究表明[16-19]，土壤中微生物種類間的競(jìng)爭(zhēng)和繁殖是影響煙草青枯菌危害程度的重要因素。作者認(rèn)為，科學(xué)的耕作方式與合理施用農(nóng)藥在一定程度上可減輕兩種病害的大面積發(fā)生，針對(duì)廣西特殊的氣候條件和栽培管理模式，還可采用病原菌早期快速檢測(cè)、培育抗病品種和研制新型農(nóng)藥等措施。

結(jié)合煙田病害調(diào)查與實(shí)驗(yàn)室分離鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在廣西主要植煙區(qū)青枯病與黑脛病混合發(fā)生較普遍。兩種病害均可破壞維管束組織，從而導(dǎo)致烤煙水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)輸送功能受損，進(jìn)一步破壞煙葉的品質(zhì)和產(chǎn)量。病害防治藥劑如不能有效輸送至發(fā)病部位，或藥劑使用不當(dāng)易造成藥害或病原的抗藥性，而且多年烤煙連作使得感病程度加劇，對(duì)煙草青枯病和黑脛病的預(yù)防和治理帶來較大困難。因此，生產(chǎn)中可考慮同時(shí)或先后施用防治煙草青枯病與黑脛病的藥劑，減輕這兩種病害的危害。

生物防治通過與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和空間位點(diǎn)、分泌抑菌物質(zhì)、誘發(fā)植物抗病潛能等直接或間接地抑制或殺死病原菌。因此，探索和研發(fā)生防產(chǎn)品對(duì)煙草根莖類病害的防治顯得尤為重要。目前已經(jīng)有報(bào)道鏈霉菌能夠應(yīng)用于煙草黑脛病的生物防治[20]，通過盆栽試驗(yàn)證實(shí)枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌能夠用于煙草青枯病的生物防治[21]，在煙草種植過程中，由于只能在移栽期前將生防菌施用大田，因而實(shí)行提前防治才能使得生防菌成功定殖，占領(lǐng)生態(tài)位、分泌抑菌物質(zhì)或代謝產(chǎn)物。

對(duì)于廣西主要煙草種植區(qū)，早診斷和早鑒定在青枯病防治中很重要。將PCR技術(shù)應(yīng)用于青枯病診斷及病原菌鑒定等方面國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道。而本研究先利用改良后的篩選培養(yǎng)基篩選煙草青枯菌，將活化后的菌液作為擴(kuò)增的模板，再利用多個(gè)保守特異性片段引物進(jìn)行多重PCR技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，既簡(jiǎn)化試驗(yàn)步驟縮短檢測(cè)時(shí)間，又可減少土壤中其他微生物干擾。本研究中無論是青枯病發(fā)生較重的煙桿，還是發(fā)病初期的煙株，均通過這種方法成功分離到煙草青枯菌。因此，選擇性培養(yǎng)基和多重菌落PCR技術(shù)的聯(lián)合使用是一種檢測(cè)青枯病菌的有效方法，為鑒定煙草青枯病菌株提供了一種快速特異的檢測(cè)手段。